具有增強的產(chǎn)量相關(guān)性狀的植物及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于通過調(diào)節(jié)植物中編碼PATL(PATELLIN)多肽，或PRP38(RNA加工因子前體38)，或ADA2(轉(zhuǎn)錄銜接頭2)多肽的表達而增強植物產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法。本發(fā)明也涉及用于通過調(diào)節(jié)植物中GATA樣多肽的核酸的表達而提高千粒重、種子總重量和/或飽滿種子數(shù)的方法。本發(fā)明也涉及用于通過增加植物中編碼WD40重復(fù)(WDR)23樣多肽的核酸的表達而增強多種植物產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法。本發(fā)明也提供了在本發(fā)明方法中有用的迄今未知的PATL核酸和構(gòu)建體。
【專利說明】具有增強的產(chǎn)量相關(guān)性狀的植物及其制備方法
[0001]本申請為2008年11月26日提交的、發(fā)明名稱為“具有增強的產(chǎn)量相關(guān)性狀的植物及其制備方法”的PCT申請PCT/EP2008/066237的分案申請，所述PCT申請進入中國國家階段的日期為2010年6月I日，申請?zhí)枮?00880118749.9。
[0002]本發(fā)明總體上涉及分子生物學領(lǐng)域并涉及用于通過調(diào)節(jié)植物中編碼PATL (PATELLIN)多肽或PRP38 (RNA加工因子前體38)或GATA樣多肽或ADA2 (轉(zhuǎn)錄銜接頭
2)多肽或WDR23樣多肽的核酸的表達而增強植物產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法。本發(fā)明也涉及具有編碼PATL多肽或PRP38或GATA樣或ADA2多肽或WDR23樣的核酸的受調(diào)節(jié)表達的植物，所述植物相對于對 應(yīng)野生型植物或其他對照植物具有增強的產(chǎn)量相關(guān)性狀。本發(fā)明也提供了在本發(fā)明方法中有用的迄今未知的PATL或PRP38或GATA樣或ADA2或DR23樣核酸和構(gòu)建體。
[0003]在一個實施方案中，本發(fā)明還涉及用于通過調(diào)節(jié)編碼GATA樣多肽的核酸在植物中的表達來改善植物生長特征的方法。本發(fā)明還涉及具有編碼GATA樣多肽的核酸的受調(diào)節(jié)的表達的植物，所述植物相對于對應(yīng)的野生型植物或其他對照植物具有改善的生長特征。本發(fā)明也提供了在本發(fā)明方法中有用的構(gòu)建體。
[0004]在另一個實施方案中，本發(fā)明還涉及用于通過增加編碼WD40重復(fù)(WDR) 23樣多肽的核酸序列在植物中的表達來增強各種植物產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法。本發(fā)明還涉及具有編碼WD23樣多肽的核酸的增加的表達的植物，所述植物相對于對照植物具有增強的產(chǎn)量相關(guān)性狀。此外，本發(fā)明涉及編碼具有上述植物產(chǎn)量增加活性的上述多肽的特定核酸序列、包含所述核酸序列的核酸構(gòu)建體、載體和植物。
[0005]持續(xù)增長的世界人口和農(nóng)業(yè)用可耕地供應(yīng)萎縮刺激了有關(guān)提高農(nóng)業(yè)效率的研究。常規(guī)的作物及園藝學改良手段利用選擇育種技術(shù)以鑒定具有受歡迎特征的植物。然而，此類選擇育種技術(shù)具有幾個缺陷，即這些技術(shù)一般耗費很多勞動并且產(chǎn)生這樣的植物，其經(jīng)常含有異源的遺傳組分，其可能不總導致受歡迎性狀從親代植物傳遞下去。分子生物學進展已經(jīng)允許人類改良動物及植物的種質(zhì)。植物的遺傳工程使得可以分離和操作遺傳物質(zhì)(一般處于DNA或RNA形式)并且隨后導入該遺傳物質(zhì)至植物中。此類技術(shù)具有產(chǎn)生具備多種經(jīng)濟學、農(nóng)學或園藝學改良性狀的作物或植物的能力。
[0006]具有特殊經(jīng)濟意義的性狀是提高的產(chǎn)量。產(chǎn)量通常定義為來自作物的經(jīng)濟價值的可測量結(jié)果。該結(jié)果可以就數(shù)量和/或品質(zhì)方面進行定義。產(chǎn)量直接取決于幾個因素，例如器官的數(shù)目和大小、植物構(gòu)造(例如枝的數(shù)目)、種子產(chǎn)生、葉衰老等。根發(fā)育、養(yǎng)分攝入、脅迫耐受性和早期生長勢(early vigor)也可以是決定產(chǎn)量的重要因素。優(yōu)化前述因素因而可以有助于提高作物產(chǎn)量。
[0007]種子產(chǎn)量是特別重要的性狀，因為許多植物的種子對人和動物營養(yǎng)是重要的。作物如谷物、稻、小麥、卡諾拉油菜和大豆占超過一半的人類總熱量攝入，無論通過直接消費種子本身或通過消費基于加工的種子而產(chǎn)生的肉產(chǎn)品。作物也是糖、油及工業(yè)加工中所用許多類型代謝物的來源。種子含有胚(新枝條(shoot)和新根的起源)和胚乳(萌發(fā)期間和籽苗早期生長期間用于胚生長的養(yǎng)分來源)。種子發(fā)育涉及多種基因并且需要代謝物從根、葉和莖轉(zhuǎn)移至正在生長的種子中。胚乳尤其同化糖類、油和蛋白質(zhì)的代謝前體并且將它們合成為貯藏大分子以灌滿籽粒。
[0008]植物生物量是飼料作物如苜蓿、飼用谷物和干草的產(chǎn)量。產(chǎn)量的許多代用物已經(jīng)用于谷物作物。它們當中主要是對植物尺寸的估計。植物尺寸可以根據(jù)物種和發(fā)育階段以多種方式測量，不過包括總植物干重、地上部分干重、地上部分鮮重、葉面積、莖體積、植物高度、蓮座叢直徑、葉長度、根長度、根質(zhì)量、分蘗數(shù)和葉數(shù)。許多物種維持在給定發(fā)育階段上植物不同部分的尺寸之間的保守比率。這些異速增長關(guān)系用來從這些尺寸量值之一外推至另一種尺寸量值(例如 Tittonell 等，2005Agric Ecosys&Environl05:213)。在發(fā)育早期的植物尺寸一般與發(fā)育中稍后的植物尺寸相關(guān)。具有較大葉面積的較大植物通?？梢员容^小的植物吸收更多光線和二氧化碳并且因而可能會在相同的時段期間獲得更大重量(Fasoula和Tollenaar2005Maydica50:39)。此外，這也是植物應(yīng)當初始實現(xiàn)較大尺寸的微環(huán)境優(yōu)勢或遺傳優(yōu)勢的潛在延續(xù)。存在針對植物尺寸和生長速率的強遺傳組分(例如ter Steege等，2005Plant Physiologyl39:1078),并且因而對于一系列各異遺傳表型，在一種環(huán)境條件下的植物尺寸很可能關(guān)聯(lián)于另一種環(huán)境條件下的尺寸(Hittalmani等，2003Theoretical AppliedGeneticsl07:679)。以這種方式，使用標準環(huán)境作為作物在田間于不同位置及時間所遭遇的多樣且動態(tài)環(huán)境的代用物。[0009]對于許多作物的另一個重要性狀是早期生長勢。改善早期生長勢是現(xiàn)代稻育種計劃在溫帶和熱帶稻品種方面的重要目標。長根對于水栽稻中正確土壤固定是重要的。在稻直接播種至被淹沒田地的情況下，以及在植物必須從水中迅速萌發(fā)的情況下，較長的枝條與生長勢相關(guān)。在實施條播的情況下，較長的中胚軸和胚芽鞘對良好出苗是重要的。將早期生長勢A工改造到植物內(nèi)的能力在農(nóng)業(yè)中將是極重要的。例如，不良的早期生長勢已經(jīng)限制了基于玉米帶種質(zhì)(Corn Belt germplasm)在歐洲大西洋地區(qū)引種玉米(Zea mayesL.)雜種。
[0010]收獲指數(shù)即種子產(chǎn)量對地上部分干重的比率在許多環(huán)境條件下是相對穩(wěn)定的并且因而可以經(jīng)常獲得植物尺寸與谷物產(chǎn)量之間的強相關(guān)(例如Rebetzke等，2002CropScience42:739)。這些過程是內(nèi)在聯(lián)系的，因為谷物生物量的主要部分取決于植物葉和莖的現(xiàn)有和儲備光合生產(chǎn)率(Gardener 等，1985Physiology of Crop Plants.1owa StateUniversity Press,第68-73頁)。因此,選擇植物尺寸(甚至在發(fā)育的早期)已經(jīng)用作未來潛在產(chǎn)能的指示物(例如Tittonell等，2005Agric Ecosys&Environl05:213)。當檢驗遺傳差異對脅迫耐受性的影響時，使土壤屬性、溫度、水和養(yǎng)分有效性和光強度標準化的能力是溫室或植物生長室環(huán)境與田間相比的固有優(yōu)勢。然而，產(chǎn)量因不良授粉所致的人為限制可能限制這些受控環(huán)境檢驗產(chǎn)量差異的用途，其中所述的不良授粉因缺少風和昆蟲或成熟根或根冠生長的足夠空間引起。因此，在標準化條件下在生長室或溫室測量發(fā)育早期的植物尺寸是提供潛在遺傳產(chǎn)量優(yōu)勢指示的標準操作。
[0011]另一個重要性狀是改良的非生物性脅迫耐受性。非生物性脅迫是世界范圍作物損失的主要原因，對于大多數(shù)主要作物植物而言平均產(chǎn)量降低超過50% (Wang等，(2003)Planta218:1_14)。非生物性脅迫可以由干旱、鹽度、極端溫度、化學毒性養(yǎng)分、(大分子和/或微量元素)過量或匱乏、輻射和氧化脅迫引起。提高植物的非生物性脅迫耐受性能力將在世界范圍對農(nóng)民是巨大的經(jīng)濟優(yōu)勢并且將允許在不利條件期間及在本來不可能栽培作物的陸地上栽培作物。
[0012]因而可以通過優(yōu)化前述因素之一提高作物產(chǎn)量。
[0013]取決于最終用途，對某些產(chǎn)量性狀的改良可能優(yōu)先于其它產(chǎn)量性狀。例如對于應(yīng)用如飼料或木材生產(chǎn)或生物燃料資源而言，增加植物營養(yǎng)體部分可能是希望的，而對于應(yīng)用如面粉、淀粉或油生產(chǎn)而言，種子參數(shù)提高可能是特別希望的。即便在種子參數(shù)當中，某些參數(shù)可以更優(yōu)先于其它參數(shù)，這取決于用途。多種機制可以有助于提高種子產(chǎn)量，無論其形式為提高的種子尺寸或提高的種子數(shù)目。
[0014]增強植物中產(chǎn)量相關(guān)性狀(種子產(chǎn)量和/或生物量)的一種方法可以是通過調(diào)節(jié)植物的內(nèi)在生長機制如細胞周期或參與植物生長或參與防御機制的多種信號傳導途徑。
[0015]現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可以通過調(diào)節(jié)植物中編碼PATL(Patellin)多肽或PRP38 (RNA加工因子前體38)或ADA2 (轉(zhuǎn)錄銜接頭2)多肽或WD40重復(fù)(WDR) 23樣多肽的核酸的表達而增強植物中多種產(chǎn)量相關(guān)性狀
[0016]又發(fā)現(xiàn)可通過調(diào)節(jié)植物中編碼GATA樣(目的蛋白)的核酸表達而改善多種生長特征。
[0017]增強的產(chǎn)量相關(guān)性狀包含以下一項或多項:提高的每株植物種子總產(chǎn)量、提高的種子飽滿率、提聞的種子充數(shù)量、提聞的收獲指數(shù)或提聞的千粒重。
[0018]脂類(含ipids)是在非極性溶劑(如氯仿或醚)中可溶的物質(zhì)。脂類是活生物體中的必需成分。如糖脂 、磷脂和膽固醇的脂類是細胞膜的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)成分，而甘油三酯是生物能源分子。磷脂酰肌醇(PtdIns)和磷脂酰膽堿(PtdCho)是磷脂的實例。脂類和蛋白質(zhì)間的相互作用在將涉及多種過程(如細胞信號發(fā)放和細胞增殖)的蛋白質(zhì)和糖脂靶向至特定的膜和細胞內(nèi)部位中起作用。多種蛋白質(zhì)與脂類的生物合成、轉(zhuǎn)運和吸收相關(guān)。此外，涉及信號轉(zhuǎn)導和蛋白質(zhì)導向的關(guān)鍵蛋白質(zhì)具有翻譯后附加至其的脂類衍生基團(Stryer，L.(1995)Biochemistry, ff.H.Freeman 和 C0.，New York N.Y.,第 264-267 頁，934)。
[0019]磷脂酰肌醇/磷脂酰膽堿轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)(PIPT)是通過促進在真核細胞的不同月旲區(qū)室中轉(zhuǎn)移，而涉及PtdIns和PtdCho代謝協(xié)調(diào)的遍在蛋白質(zhì)。在酵母中，王要的PIPT是SEC14蛋白質(zhì)，它是從高爾基體外側(cè)網(wǎng)絡(luò)分泌必需的(Bankatis等，1989，J.CellBiol.108:1271-81)。在植物和其他高等生物中發(fā)現(xiàn)了類似的蛋白質(zhì)。在植物中，幾種SEC14同源物已被描述為與釀酒酵母(S.cerevisiae) SEC14蛋白質(zhì)具有約25%的氨基酸序列相似性，在一些情況下，已通過secl4-l溫度敏感型酵母突變體的互補在實驗上驗證了假定的Ptdlns/PtdCho轉(zhuǎn)移功能(Jouannic等，1998)。據(jù)報道，植物SEC14蛋白質(zhì)在多種生物學過程中發(fā)揮作用，如胞質(zhì)分裂、高滲脅迫誘導的信號發(fā)放途徑、多種膜間的小泡運輸或結(jié)瘤作用期間的膜生物發(fā)生(Allen-Baume 等，2002 ；FEBsLetters531:74-80 ；Peterman等，2004.Plant Phys.136:3080-3094 ;Monks 等，2001，Plant Celll3:1205-19 ；Kapranov等，2001Plant Celll3:1369-1382)。
[0020]在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中，已報道 Patellinl (PATLl)蛋白質(zhì)(SEC14同源物蛋白質(zhì)家族成員)在胞質(zhì)分裂期間定位至細胞板和顯示具有PtdIns結(jié)合活性。PATLl是擬南芥中六種蛋白質(zhì)的小家族的成員，其特征在于存在SEC14和GOLD (高爾基體動力學)結(jié)構(gòu)域這兩種保守結(jié)構(gòu)域。
[0021]SEC14結(jié)構(gòu)域見于酵母的SEC14蛋白質(zhì)和見于RhoGAP、RhoGEF和asGAP、神經(jīng)纖維瘤蛋白(NFl)。該結(jié)構(gòu)域還見于多種可以作為視覺周期功能成分的視黃醛/維甲醛結(jié)合蛋白質(zhì)的C端，和Trio蛋白質(zhì)中，Trio蛋白質(zhì)是整合和放大涉及肌動蛋白重建的信號的多功能因子。SEC14有時稱為CRAL_TR10結(jié)構(gòu)域。SEC14結(jié)構(gòu)域涉及脂類結(jié)合(Sha和Lu0.1999.，Biochim Biophys Acta.1441:268-77)。
[0022]GOLD結(jié)構(gòu)域是見于幾種真核高爾基體和脂類運輸?shù)鞍踪|(zhì)的蛋白質(zhì)組件。其長度一般在90-150氨基酸之間。在GOLD結(jié)構(gòu)域超家族中觀察到的大部分大小差異可追蹤至見于該結(jié)構(gòu)域的一些版本中的單個巨大的低復(fù)雜性插入片段。GOLD結(jié)構(gòu)域存在于可與膜相互作用，或在多種蛋白質(zhì)與細胞骨架絲的相互作用中有作用的蛋白質(zhì)中，如動物SEC14蛋白質(zhì)或酵母氧固醇(oxysterol)結(jié)合蛋白質(zhì)同源物3 (0SH3)。預(yù)測GOLD結(jié)構(gòu)域介導多中蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Anantharaman 等，2002.Genome Biol.3) ?
[0023]專利申請W02004/09014描述了涉及脅迫耐性的部分PATL蛋白質(zhì)。
[0024]細胞中信使RNA(mRNA)的合成和功能需要包含轉(zhuǎn)錄、加工、轉(zhuǎn)運、翻譯和降解的一系列事件。RNA加工指翻譯后修飾RNA的事件。在真核生物中，大多數(shù)新生前mRNA包含內(nèi)含子，內(nèi)含子的切除導致外顯子的精確連接以產(chǎn)生成熟mRNA，成熟mRNA是被核糖體用來翻譯為蛋白質(zhì)的RNA形式。RNA的轉(zhuǎn)錄后修飾還包含影響穩(wěn)定性和翻譯效率的5’端帽化和3’端聚腺苷化。mRNA翻譯和周轉(zhuǎn)間的關(guān)系對基因表達調(diào)節(jié)和細胞正確發(fā)揮作用很關(guān)鍵。在真核生物中，數(shù)十種蛋白質(zhì)涉及RNA代謝。這種蛋白質(zhì)的實例是前mRNA剪接因子PRP38。
[0025]酵母PRP38是在前mRNA剪接缺陷的釀酒酵母的溫度敏感型突變體遺傳篩選中鑒定的(Blanton 等，1992, Mol.Cel.Biol.12, 3939-3947)。插入序列從真核前 mRNA 轉(zhuǎn)錄本的切除發(fā)生于細胞核內(nèi)稱為剪接體的巨大的復(fù)雜結(jié)構(gòu)上。剪接體通過兩個步驟的機制進行內(nèi)含子切除，該機制 包含(i)內(nèi)含子上在5’剪接位點切割和連接內(nèi)含子5’端核苷酸至3’
端附近的腺苷和(ii)在3’剪接位點切割和外顯子連接。剪接體的組裝通過u1、U1U4/
U6和U5snRNP(小核糖核蛋白U1-U6)的相繼加入來進行。在組裝過程后期，U4從剪接體解離。據(jù)信，導致前mRNA分子中內(nèi)含子切除的剪接的催化事件發(fā)生在U4解離之后。在酵母中，據(jù)報道，PRP38對剪接體組裝不是必要的，但其是導致剪接體催化激活的構(gòu)象變化必需的(Xie 等，(1998)EMBO Journall7 卷 pp.2938-2946)。
[0026]在擬南芥中，依照其與SR蛋白質(zhì)的序列相似性，PRP38蛋白質(zhì)(AtPRP38)被稱為SRLl (SR 樣 I) (Forment 等，Plant J.2002 年 6 月；30(5):511-9)。但是，PRP38 在結(jié)構(gòu)上不同于其他SR蛋白質(zhì)。SR蛋白質(zhì)一般包含RRM結(jié)構(gòu)域(RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域)和RS結(jié)構(gòu)域(Kalyna 和 Barta Biochem Soc Trans.200432:561-4.)，而 AtPRP38 包含 RS 結(jié)構(gòu)域但缺少RRM結(jié)構(gòu)域。
[0027]W001/81599描述了用編碼幾種SR蛋白質(zhì)的核酸在酵母和植物中改良脅迫耐性的方法。已發(fā)現(xiàn)SRLl及其他在前mRNA剪接中起作用的蛋白質(zhì)在植物對非生物脅迫的響應(yīng)中發(fā)揮重要作用(Lee 等，2006Plant Cell.Jul ；18(7) =1736-49) ?
[0028]GATA家族形成真核生物Cys2/Cys2型鋅指轉(zhuǎn)錄因子(見于如細胞狀黏菌、植物、真菌、線蟲、昆蟲、棘皮動物、脊椎動物)中的主要家族之一，其包含I個或2個高度保守的鋅指DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。DNA結(jié)合的共有序列是CX2CX17_2(ICX2C，并包含由保守的4個半胱氨酸配位(coordinate)的鋅原子(Omichinski等，1993 ;Reyes等，2004)。此結(jié)構(gòu)域之后一般是堿性區(qū)域。其特征性地在GATA識別序列(A/T)GATA(A/G)處結(jié)合DNA (Martin和Orkin，1990 ；Omichinski等，2003)。動物的GATA在第二和第三個半胱氨酸之間一般包含17個殘基，而在真菌中這一數(shù)目可以是17-18 (很少是19或20)。植物在第二和第三個半胱氨酸之間具有18或20個殘基。
[0029]在人類中，最初的GATAl被鑒定為促進球蛋白基因表達所需的轉(zhuǎn)錄因子(Pevny等，1991)。第一種植物GATA(NTLl)作為粗糙鏈孢霉(Neurospora crassa)轉(zhuǎn)錄因子NIT2(在氮限制條件中激活氮代謝酶基因表達的蛋白質(zhì))的植物同源物分離自煙草。NTLl在第二和第三個半胱氨酸之間包含18個間隔(CX2CX18CX2C) (Daniel-Vedele和Caboche，1997)。擬南芥和稻(Oryza sativa)基因組中分別存在29和28個編碼假定的GATA轉(zhuǎn)錄因子(CX2CX18sa2ciCX2C)的基因座(Reyes等，2004):擬南芥僅具有帶一個GATA結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，而稻具有兩種包含兩個GATA結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)和一種包含三個GATA結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。稻轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(DRTF，Gao 等，Bioinformatics2006，22，1286-1287)提出秈稻(Indica)中有28種GATA，粳稻(Japonica)中有23種GATA。稻和擬南芥中的轉(zhuǎn)錄因子GATA家族可以劃分為7個亞家族,這些亞家族中的一些在兩個物種中均存在,而其他亞家族是兩個物種之一獨有的。
[0030]GATA-樣蛋白質(zhì)(HAN)在強組成型35S啟動子控制下的異位表達嚴重地影響植物的生存力和發(fā)育(Zhao等，Plant Celll6，2586-2600，2004)。轉(zhuǎn)化的植物矮小，具有異常形成的葉和較小且畸形的花序。US2007/0250956公開OsGATAII及其對提高種子產(chǎn)量的用途。
[0031]植物中的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)是許多生物學過程的基礎(chǔ)，如對環(huán)境的適應(yīng)和代謝和生理平衡的調(diào)節(jié)。因此，改變植物中的基因轉(zhuǎn)錄可導致植物生長和發(fā)育的顯著改變。這種特性可用來改良作物植物的性能。存在數(shù)百種控制基因表達的基因，其中只有少數(shù)已顯示在調(diào)節(jié)其在植物中的表達時對農(nóng)業(yè)的目的性狀具有有益作用(Vinocur和Altman，2005，CurrentOpinion in Biotechnologyl6, 123-132 ；Gutterson 和 Reuber2004.Current Opinion inPlant Biology, 7,465-471)。為增強產(chǎn)量性狀調(diào)芐基因表達的可用性將有助于改良作物性能，并最終有利于基于農(nóng)業(yè)的產(chǎn)業(yè)。
[0032]在真核生物中，基因表達與導致啟動子變得更易于接近RNA聚合酶II和轉(zhuǎn)錄裝置的其他成分的染色質(zhì)修飾相偶聯(lián)。兩類主要的蛋白質(zhì)復(fù)合物影響染色質(zhì)動力學。一類包含ATP依賴的染色質(zhì)重建器(SWI/SNF相關(guān)復(fù)合物)，第二類包含修飾組蛋白蛋白質(zhì)的復(fù)合物。一種這類組蛋白修飾由組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HAT)介導，可通過存在于核心組蛋白N端中的特定賴氨酸殘基乙酰化(Narlikar等，2002Celll08，475-487)。作為轉(zhuǎn)錄輔激活物起作用的原型組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶之一稱為Gcn5。在酵母中，Gcn5形成已知包含如ADA、SAGA、SALSA和SLIK的銜接頭蛋白質(zhì)的不同蛋白質(zhì)復(fù)合物[18-20]。已在包括植物的高等真核生物中鑒定了同源復(fù)合物。在擬南芥中，已描述了兩種編碼ADA2蛋白質(zhì)的旁系同源基因(Stockinger 等，2001Nucleic acid research29,1524-1533)。
[0033]通用轉(zhuǎn)錄因子募集RNA聚合酶II至啟動子的TATA框，而轉(zhuǎn)錄激活因子結(jié)合至稱為上游激活位點(UAS)的特定DNA序列。通用轉(zhuǎn)錄因子可直接或通過銜接頭蛋白質(zhì)與轉(zhuǎn)錄激活因子相互作用。雖然也已經(jīng)描述了通過DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的相互作用，但銜接頭蛋白質(zhì)一般通過激活結(jié)構(gòu)域與轉(zhuǎn)錄激活因子相互作用(Mao等,2006.Biochimica et BiophysicaActal75969_79)。
[0034]在擬南芥中，據(jù)報道ADA2蛋白質(zhì)增強GCN5在體外乙酰化組蛋白的能力和調(diào)節(jié)GCN5的底物特異性。此外，GCN5可在植物同源物獨有而真菌和動物同源物缺乏的基序處乙?；疉DA2蛋白質(zhì)(Mao等，2006)。已發(fā)現(xiàn)ADA2b和GCN5中的T-DNA插入突變對植物的生長和發(fā)育具有多效性，包含矮小的尺寸、異常的根發(fā)育和花內(nèi)短的花瓣和雄蕊(Vlachonasios等，2003The Plant Cell，15卷，626-638)。還已經(jīng)公開了來自其他植物物種的編碼轉(zhuǎn)錄銜接頭蛋白質(zhì)的基因(W00003026)。
[0035]許多不同細胞過程的調(diào)節(jié)需要蛋白質(zhì)相互作用結(jié)構(gòu)域進行多肽彼此間結(jié)合，和與磷脂、小分子或核酸結(jié)合的用途。一種這類蛋白質(zhì)相互作用結(jié)構(gòu)域稱為WD重復(fù)(參見綜述Smith等，(1999)TIBS24:181-185)。包含WD重復(fù)的蛋白質(zhì)大量存在于大部分生物中，例如，人類(H.sapiens)中超過300種、秀麗隱桿線蟲(C.elegans)中超過140種、擬南芥中超過390種和釀酒酵母中超過90種。雖然通過WD重復(fù)(一條多肽中4-16個拷貝之間)的存在而在結(jié)構(gòu)上相關(guān)，但這些蛋白質(zhì)具有極多樣的功能。
[0036]通過Gly-His (GH) 二肽N端距Trp-Asp (WD) 二肽(位于基序的C端)10-20個殘基，長度一般為大約40 (但至多60)個殘基(因此稱為“WD40”)，在一級結(jié)構(gòu)上粗略地定義WD重復(fù)。但是，GH 二肽和WD 二肽都不是絕對保守。GH和WD之間是保守的核心序列，其可以用可從例如在英國的European Bioinformatics Institute (EBI)所擁有的InterPro獲得的算法鑒定。InterPix)是蛋白質(zhì)家族、結(jié)構(gòu)域和功能位點的數(shù)據(jù)庫，其中可將見于已知蛋白質(zhì)的可鑒定特征應(yīng)用于未知蛋白質(zhì)序列。[0037]據(jù)預(yù)測，WD40蛋白質(zhì)形成β螺旋槳-樣結(jié)構(gòu)(環(huán)狀重復(fù)結(jié)構(gòu))，其包含三個潛在的相互作用表面:頂部、底部和環(huán)狀面。這種擴展的表面積允許WD40蛋白質(zhì)可逆地與數(shù)個蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，從而協(xié)調(diào)涉及數(shù)組蛋白質(zhì)的相繼和/或同時相互作用。
[0038]涉及WD40蛋白質(zhì)的非常重要的蛋白質(zhì)復(fù)合物中有一類多蛋白質(zhì)泛素Ε3連接酶，Cullin4(CUL4)和損傷DNA結(jié)合蛋白質(zhì)I (DDBl)是其核心蛋白質(zhì)(Higa等，(2007)Cell Division2:5 ;Angers 等，(2006)Nature443 =59O-593 ;Higa 等，(2006)Nature CellBiol8(ll):1277-1283 ;He 等，(2006) Genes&Development20:2949-2954)。這種復(fù)合物為底物募集機制錨定WD40蛋白質(zhì)作為分子銜接頭，底物隨后被泛素化和破壞。這些WD蛋白質(zhì)形成稱為DCAF (DDB1-CUL4A結(jié)合因子)的亞類，它們在兩個連續(xù)的WD40重復(fù)末端包含兩個保守的DxR基序(He等(2006)見上)。
[0039]一種此類WD40蛋白質(zhì)WDR23(I2重復(fù)23 ;也稱為DCAF11)與見于植物的WD40蛋白質(zhì)具有顯著的一級序列同一'I"生。最先在紫草(Lithospermum erythrorhizon)中將這種WD40蛋白質(zhì)鑒定為克隆14B(LEC14B ；NCBI檢索號D83074)。
[0040]在專利申請W02002/016655中，SEQ ID NO:2577涉及編碼WDR23-樣多肽的擬南芥核酸序列，描述了用SEQ ID NO=1-SEQ ID NO:5379中的任意一個或多個來鑒定植物細胞已暴露過的脅迫條件的方法。在美國專利申請US2004/034888中，SEQ ID N0:13，294涉及編碼WDR23-樣多肽的擬南芥核酸序列，描述了用SEQ ID NO =1-SEQ ID NO:36,564中的任意一個或多個來產(chǎn)生具有改良特性的植物的方法。
[0041]令人驚奇地，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)編碼PRP38多肽的核酸的表達使植物具有增強的(或改良的)產(chǎn)量相關(guān)性狀，尤其是相對于對照植物的提高的產(chǎn)量，也在除由鹽、干旱、寒冷或冰凍引起的滲透脅迫的條件中。
[0042]還令人驚奇地，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)(優(yōu)選提高)編碼GATA-樣多肽的核酸的表達使植物相對于對照植物具有顯著提高的千粒重(TKW)，而如種子數(shù)(飽滿種子或總種子數(shù))的其他種子產(chǎn)量參數(shù)未顯著提高。
[0043]此外，令人驚奇地，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)編碼ADA2多肽的核酸的表達使植物相對于對照植物具有增強的產(chǎn)量相關(guān)性狀，尤其是提高的產(chǎn)量。
[0044]還令 人驚奇地，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)提高編碼如本文定義的WDR23-樣多肽的核酸序列的表達使植物相對于對照植物具有提高的產(chǎn)量相關(guān)性狀。
[0045]此外，令人驚奇地，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)編碼PATL多肽的核酸的表達使植物相對于對照植物具有增強的產(chǎn)量相關(guān)性狀，尤其是提高的產(chǎn)量。
[0046]根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，提供了相對于對照植物在植物中改良(或增強)產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法，其包括調(diào)節(jié)編碼PATL多肽、或PRP38、或ADA2多肽的核酸在植物中的表達。
[0047]根據(jù)另一個實施方案，提供了相對于對照植物提高千粒重(TKW)的方法，其包括調(diào)節(jié)(優(yōu)選提高)編碼GATA-樣多肽的核酸在植物中的表達。
[0048]根據(jù)另一個實施方案，提供了相對于對照植物在植物中增強產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法，其包括提高編碼如本文定義的WDR23-樣多肽的核酸序列在植物中的表達。提高的產(chǎn)量相關(guān)性狀包含以下一種或多種:提聞的每株植物的種子總廣量、提聞的種子飽滿率、提聞的飽滿種子數(shù)、提高的收獲指數(shù)或提高的千粒重。
[0049]定義
[0050]多肽/蛋白質(zhì)
[0051]術(shù)語“多肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可相互交換地使用并且指由肽鍵連接起來的任意長度聚合物形式的氨基酸。
[0052]多核苷酸/核酸/核酸序列/核苷酸序列
[0053]術(shù)語“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”在本文中可相互交換地使用并且指任意長度的聚合非分支形式的核苷酸，即核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或這二者的組合。
[0054]對照植物
[0055]選擇合適的對照植物是實驗設(shè)計的例行部分并且可以包括相應(yīng)的野生型植物或無目的基因的相應(yīng)植物。對照植物一般是相同的植物物種或甚至是與待評估植物相同的品種。對照植物也可以是待評估植物的失效合子。失效合子是因分離而丟失轉(zhuǎn)基因的個體。如本文中所用的“對照植物”不僅指完整植物，也指植物部分，包括種子和種子部分。
[0056]同源物
[0057]蛋白質(zhì)的“同源物”包括這樣的肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)和酶，它們相對于非修飾的所討論蛋白質(zhì)具有氨基酸取代、缺失和/或插入并且與衍生它們的非修飾蛋白質(zhì)具有相似的生物學活性和功能活性。
[0058]缺失指從蛋白質(zhì)中移除一個或多個氨基酸。
[0059]插入指一個或多個氨基酸殘基被導入蛋白質(zhì)中的預(yù)定位點。插入可以包含氨基端融合和/或羧基端融合以及序列內(nèi)插入單個或多個氨基酸。通常，在氨基酸序列內(nèi)部的插入物比氨基端融合物或羧基端融合物小約I至10個殘基級別。氨基端或羧基端融合蛋白或融合肽的例子包括如酵母雙雜交系統(tǒng)中所用的轉(zhuǎn)錄激活物的結(jié)合結(jié)構(gòu)域或激活結(jié)構(gòu)域、噬菌體外殼蛋白、(組氨酸)-6-標簽、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶-標簽、蛋白A、麥芽糖結(jié)合蛋白、二氫葉酸還原酶、Tag.100表位、c-myc表位、| 1.......\(:廣-表位、lacZ、CMP( |丐調(diào)蛋白結(jié)合
肽)、HA表位、蛋白C表位和VSV表位。
[0060]取代指以具有相似特性(如相似的疏水性、親水性、抗原性、形成或破壞α -螺旋結(jié)構(gòu)或折疊結(jié)構(gòu)的傾向性)的其他氨基酸替代蛋白質(zhì)的氨基酸。氨基酸取代一般是單個殘基的，但是根據(jù)給予多肽的功能性約束條件，可以是簇集的；插入通常是約I至10個氨基酸殘基級別。氨基酸取代優(yōu)選地是保守性氨基酸取代。保守性取代表是本領(lǐng)域熟知的(見例如 Creighton (1984) Proteins, ff.H.Freeman 和 Company (編)和下表 I)。
[0061]表1:保守性氨基酸取代的例子
[0062]
【權(quán)利要求】
1.用于相對于對照植物而言增強植物中產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法，其包括調(diào)節(jié)植物中編碼選自以下的多肽的核酸的表達， a)GATA樣多肽，其中所述GATA樣多肽屬于GATA轉(zhuǎn)錄因子亞家族II，并包含GATA結(jié)構(gòu)域，或
b)PRP38 多肽 和任選地選擇具有增強的產(chǎn)量相關(guān)性狀的植物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的GATA樣多肽包含一個或多個以下基序:
(i)基序Ic:C(S/A/T) (D/E/N)CXT(T/S/A) (K/S)TP(L/M)WR(S/G/N)GP(SEQ ID NO:130)，
(ii)基序2c:GPKSLCNACGIRX (R/K) K (SEQ ID NO:131)，
(iii)基序3c: (A/S) (A/ff)X(L/C) (L/N) (M/L/V) (T/L/A) (L/D) (S/R) (SEQ ID NO:132)
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法其中所述受調(diào)節(jié)的表達通過在植物中引入并表達編碼GATA樣多肽的核酸實現(xiàn)。
4.根據(jù)任一前述權(quán)利要求的方法，其中所述的編碼GATA樣多肽的核酸編碼表A中所列的任一種蛋白質(zhì)或是這種核酸的一部分或是能夠與這種核酸雜交的核酸。
5.根據(jù)任一前述權(quán)利要求的方法，其中所述的核酸序列編碼表A中給出的任意蛋白質(zhì)的直向同源物或旁系同源物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項的方法，其中所述增強的產(chǎn)量相關(guān)性狀在非脅迫條件下獲得。
7.根據(jù)權(quán)利要求3至6任一項的方法，其中所述的核酸有效鏈接至組成型啟動子，優(yōu)選至GOS2啟動子，最優(yōu)選地至來自稻的GOS2啟動子。
8.根據(jù)任一前述權(quán)利要求的方法，其中所述的編碼GATA樣多肽的核酸是植物來源的，優(yōu)選地來自雙子葉植物，進一步優(yōu)選地來自禾本科，更優(yōu)選地來自稻屬，最優(yōu)選地來自稻。
9.由根據(jù)任一前述權(quán)利要求的方法可獲得的植物或其部分，包括種子，其中所述植物或其部分包含編碼GATA樣多肽的重組核酸，所述核酸有效連接至植物來源的組成型啟動子，優(yōu)選至GOS2啟動子，最優(yōu)選地至來自稻的GOS2啟動子。
10.構(gòu)建體，其包含: (i)編碼如權(quán)利要求1或2定義中的GATA樣多肽的核酸； (?)能夠驅(qū)動(a)的核酸序列表達的一個或多個植物來源的調(diào)控序列；和任選地 (iii)轉(zhuǎn)錄終止序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的構(gòu)建體，其中所述調(diào)控序列之一是組成型啟動子，優(yōu)選GOS2啟動子，最優(yōu)選來自稻的GOS2啟動子。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11的構(gòu)建體在用于產(chǎn)生植物的方法中的用途，所述植物相對于對照植物具有提高的產(chǎn)量，包括千粒重、總種子重和飽滿種子數(shù)中一項或多項。
13.用根據(jù)權(quán)利要求10或11的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物、植物部分或植物細胞。
14.用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述的轉(zhuǎn)基因植物相對于對照植物具有提高的產(chǎn)量、特別是提高的生物量和/或提高的種子產(chǎn)量，該方法包括: (i)在植物中引入并表達編碼如權(quán)利要求1或2中定義的GATA樣多肽且有效連接至植物來源的組成型啟動子的核酸；和(?)在促進植物生長和發(fā)育的條件下培育植物細胞。
15.轉(zhuǎn)基因植物，其相對于對照植物具有因編碼如權(quán)利要求1或2中定義的GATA樣多肽的核酸的受調(diào)節(jié)表達引起的提高的千粒重，或所述轉(zhuǎn)基因植物衍生的轉(zhuǎn)基因植物細胞。
16.根據(jù)權(quán)利要求9、13或15的轉(zhuǎn)基因植物，或從其中衍生的轉(zhuǎn)基因植物細胞，其中所述的植物是作物植物或單子葉植物或禾谷植物，如稻、玉米、小麥、大麥、稷、黑麥、小黑麥、高粱和燕麥。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的植物的可收獲部分，其中所述的可收獲部分優(yōu)選地是種子。
18.產(chǎn)物，其衍生自根據(jù)權(quán)利要求16的植物和/或根據(jù)權(quán)利要求17的植物的可收獲部分。
19.編碼GATA樣多肽的核酸在植物中相對于對照植物提高千粒重、總種子重和飽滿種子數(shù)中一項或多項的用 途。
【文檔編號】C12N5/10GK103951741SQ201410223928
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2008年11月26日 優(yōu)先權(quán)日:2007年11月26日
【發(fā)明者】A·I·桑茲莫林納羅, C·勒佐, V·弗蘭卡德, J·M·穆萊特薩洛爾特, R·S·薩洛姆 申請人:巴斯夫植物科學有限公司