生物人工肝用細胞源的培養(yǎng)液的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種生物人工肝用細胞源的培養(yǎng)液，包括由低糖型DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清按照體積比8～12:1的比例組成的混合液，所述混合液中還含有60～140U/L的胰島素、3～9μg/L的肝細胞生長因子、0.5～2g/L的異甘草酸鎂、3～10mg/L的?；切苋パ跄懰?、50～100U/mL的青鏈雙抗。本發(fā)明的生物人工肝用細胞源的培養(yǎng)液通過改進現有的DMEM培養(yǎng)基，添加保護肝細胞的胰島素、肝細胞生長因子、異甘草酸鎂、?；切苋パ跄懰?，達到促進肝細胞或類肝細胞的生長，并有利于細胞向更好發(fā)揮肝功能的方向發(fā)展，特別能有效提高細胞在高膽紅素血癥環(huán)境時的成活率和存活時間，提高療效。適用于各類肝細胞和類肝細胞的培養(yǎng)，特別適合L-02細胞的培養(yǎng)。
【專利說明】生物人工肝用細胞源的培養(yǎng)液
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及肝細胞及類肝細胞培養(yǎng)【技術領域】，具體地指一種生物人工肝用細胞源的培養(yǎng)液。
【背景技術】
[0002]我國是世界上肝病最嚴重的國家，每年肝衰竭新發(fā)病人數超過100萬，每年約50萬肝功衰竭患者因得不到有效治療而死亡。治愈機會只有一種，即肝移植，但由于肝臟來源困難，等待時間長，或根本沒有機會得到供肝，因此絕大多數病人根本沒有生存機會。因此，急需人工肝系統(tǒng)維持病人生命，等待肝移植機會，或病人自身肝恢復的機會。
[0003]但由于傳統(tǒng)的人工肝(即物理人工肝)成本極高，大多數病人都無法承擔，療效非常有限，不能明顯減少肝功能衰竭的死亡率，故臨床應用受到限制。近年來，將活性肝細胞或類肝細胞加入到人工肝系統(tǒng)內以改進療效，已成為世界研發(fā)熱點，這種以肝細胞充填反應器為基礎的人工肝稱為生物人工肝(bio-artificial liver，BAL)，大量研究證明其療效明顯優(yōu)于物理人工肝，能明顯減少肝功能衰竭病死率，明顯延長生存期，為急性肝功能衰竭病患的自身肝臟恢復和慢性肝功能衰竭病患等待肝移植創(chuàng)造了條件。
[0004]現有生物人工肝采用的細胞有多種，包括豬肝細胞、永生化人肝細胞、人肝癌細胞系、C3A細胞、L-02永生化肝細胞等細胞源，這些細胞多采用DMEM培養(yǎng)液來培養(yǎng)，DMEM是一種含各種氨基酸和葡萄糖的培養(yǎng)基，是在MEM培養(yǎng)基的基礎上研制的。分為高糖型(糖分在1000~4500mg/L)和低糖型(糖分低于1000mg/L)。高糖型有利于細胞停泊于一個位置生長，適于生長較快、 附著較困難腫瘤細胞等?，F有技術中還存在DMEM培養(yǎng)液的改進型，針對不同的細胞，添加肝細胞生長因子、胰島素等。
[0005]由于生物人工肝在臨床實際應用中，肝功能衰竭患者血液中的膽紅素很高，生物人工肝系統(tǒng)中的肝細胞或類肝細胞有可能無法耐受高膽紅素帶來的毒性而凋亡，從而降低治療效果，最終降低患者的生存率。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明的目的在于克服現有肝細胞培養(yǎng)液無法對抗高膽紅素毒性，易使人工肝系統(tǒng)中的肝細胞或類肝細胞凋亡的缺陷，提供一種能夠抗膽紅素毒性的生物人工肝用細胞源的培養(yǎng)液。
[0007]為實現上述目的，本發(fā)明所設計的生物人工肝用細胞源的培養(yǎng)液，包括由低糖型DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清按照體積比8~12:1的比例組成的混合液，所述混合液中還含有60~140U/L的胰島素、3~9μ g/L的肝細胞生長因子、0.5~2g/L的異甘草酸鎂、3~10mg/L的?；切苋パ跄懰?、50~100U/mL的青鏈雙抗。
[0008]優(yōu)選地，所述混合液由低糖型DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清按照體積比10:1的比例組成。
[0009]優(yōu)選地，所述混合液中含有80~120U/L的胰島素、4~6 μ g/L的肝細胞生長因子、0.8~1.2g/L的異甘草酸鎂、5~8mg/L的?；切苋パ跄懰?、60~90U/mL的青鏈雙抗。
[0010]更優(yōu)選地，所述混合液中含有100U/L的胰島素、5 μ g/L的肝細胞生長因子、lg/L的異甘草酸鎂、6mg/L的?；切苋パ跄懰?、80U/mL的青鏈雙抗。
[0011]優(yōu)選地，所述混合液中還含有8.5~9.5mg/L的L-丙氨酸、13.2mg/L的L-天冬酰胺、11.5mg/L的L-脯氨酸、14.7mg/L的L-谷氨酸。。
[0012]更優(yōu)選地，所述混合液中還含有8.9mg/L的L-丙氨酸、13.2mg/L的L-天冬酰胺、
11.5mg/L的L-脯氨酸、14.7mg/L的L-谷氨酸。
[0013]本發(fā)明培養(yǎng)液中添加的部分組分功能如下:
[0014]胰島素作用:改善細胞糖利用，促進生長。
[0015]肝細胞生長因子作用:刺激肝細胞生長、防治肝細胞凋亡。
[0016]異甘草酸鎂作用:具有抗炎、抗氧化、抗肝臟毒物、穩(wěn)定細胞膜、抗肝纖維化、調節(jié)免疫、抑制Ca2+內流、防止細胞凋亡以及增加內源性類固醇產生等多種功效。
[0017]牛磺熊去氧膽酸(TUDCA)的作用:利膽、細胞保護、拮抗疏水性膽汁酸的細胞毒性、抗凋亡、抗氧化和免疫調節(jié)功能等。
[0018]通過上述四種添加物質的協(xié)同作用，是培養(yǎng)的肝細胞達到抗凋亡、抗氧化、抗細胞毒性的效果。
[0019]本發(fā)明的有益效果:生物人工肝用細胞源的培養(yǎng)液通過改進現有的DMEM培養(yǎng)基，添加保護肝細胞的胰島素、肝細胞生長因子、異甘草酸鎂、?；切苋パ跄懰幔_到促進肝細胞生長，并有利于細胞向更好發(fā)揮肝功能方向發(fā)展，有效提高肝細胞或類肝細胞在高膽紅素血癥應用時的成活率和存活時間，有利于提高療效。適用于各類肝細胞及類肝細胞的培養(yǎng)，特別適合L-02細胞的培養(yǎng)。
【具體實施方式】
[0020]以下結合具體實施例對本發(fā)明作進一步的詳細描述。
[0021]本實施例中采用兩種DMEM低糖型培養(yǎng)液，配方如下:
[0022]l)DMEM(A)培養(yǎng)液(以下添加物為粉末型)成分表
[0023]
【權利要求】
1.一種生物人工肝用細胞源的培養(yǎng)液，其特征在于:包括由低糖型DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清按照體積比8~12:1的比例組成的混合液，所述混合液中還含有60~140U/L的胰島素、3~9 μ g/L的肝細胞生長因子、0.5~2g/L的異甘草酸鎂、3~10mg/L的牛磺熊去氧膽酸、50~100U/mL的青鏈雙抗。
2.根據權利要求1所述生物人工肝用細胞源的培養(yǎng)液，其特征在于:所述混合液由低糖型DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清按照體積比10:1的比例組成。
3.根據權利要求1或2所述生物人工肝用細胞源的培養(yǎng)液，其特征在于:所述混合液中含有80~120U/L的胰島素、4~6 μ g/L的肝細胞生長因子、0.8~1.2g/L的異甘草酸鎂、5~8mg/L的牛磺熊去氧膽酸、60~90U/mL的青鏈雙抗。
4.根據權利要求1或2所述生物人工肝用細胞源的培養(yǎng)液，其特征在于:所述混合液中含有100U/L的胰島素、5 μ g/L的肝細胞生長因子、lg/L的異甘草酸鎂、6mg/L的?；切苋パ跄懰?、80U/mL的青鏈雙抗。
5.根據權利要求1或2所述生物人工肝用細胞源的培養(yǎng)液，其特征在于:所述混合液中還含有8.5~9.5mg/L的L-丙氨酸、13~14mg/L的L-天冬酰胺、11~12mg/L的L-脯氨酸、14~15mg/L的L-谷氨酸。
6.根據權利要求3所述生物人工肝用細胞源的培養(yǎng)液，其特征在于:所述混合液中還含有8.5~9.5mg/L的L-丙氨酸、13~14mg/L的L-天冬酰胺、11~12mg/L的L-脯氨酸、14~15mg/L的L-谷 氨酸。
7.根據權利要求4所述生物人工肝用細胞源的培養(yǎng)液，其特征在于:所述混合液中還含有8.5~9.5mg/L的L-丙氨酸、13~14mg/L的L-天冬酰胺、11~12mg/L的L-脯氨酸、14~15mg/L的L-谷氨酸。
8.根據權利要求4所述生物人工肝用細胞源的培養(yǎng)液，其特征在于:所述混合液中還含有8.9mg/L的L-丙氨酸、13.2mg/L的L-天冬酰胺、11.5mg/L的L-脯氨酸、14.7mg/L的L-谷氨酸。
【文檔編號】C12N5/071GK103952370SQ201410178735
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年4月29日 優(yōu)先權日:2014年4月29日
【發(fā)明者】周平, 劉路 申請人:周平, 劉路