轉(zhuǎn)基因植物中cry3A基因的LAMP檢測引物組、試劑盒及檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種轉(zhuǎn)基因植物中cry3A基因的LAMP檢測引物組、試劑盒及檢測方法。引物組由5條特異性引物組成，其核苷酸序列如SEQIDNO：1~5所示。檢測試劑盒包括檢測引物溶液、環(huán)引物溶液、具有鏈置換活性的DNA聚合酶、10×反應(yīng)緩沖液、dNTPs溶液、陽性DNA對照和陰性DNA對照，試劑盒還可以含有顯色劑。檢測方法是采用特異性引物及具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在63~65℃對樣品DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，并采用加入顯色劑觀察顏色變化或直接觀察反應(yīng)管內(nèi)沉淀的濁度變化等方法，判斷樣品是否含有cry3A基因成分。本發(fā)明不需要特殊儀器，具有快速高效、操作簡便、特異性強(qiáng)、靈敏度高等特點，適合現(xiàn)場檢測。
【專利說明】轉(zhuǎn)基因植物中cry3A基因的LAMP檢測引物組、試劑盒及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品的檢測方法，具體涉及一種利用環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)快速檢測轉(zhuǎn)基因植物中cit3A基因的引物組、試劑盒和檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]2013年全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積高達(dá)1.752億公頃，比1996年商業(yè)化初期增長了 100余倍。目前商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因作物主要有大豆、玉米、棉花、油菜，主要性狀為抗蟲、抗除草劑。在抗蟲轉(zhuǎn)基因植物中應(yīng)用的目的基因有crylAb、crylAc、crylA.105、crylF、cry2Ab> cry3A > cry3Bb^ vip3'等,其中ciyJA基因存在于轉(zhuǎn)基因玉米MIR604中，已獲準(zhǔn)在美國、歐盟、澳大利亞、俄羅斯、韓國、南非等近20個國家和地區(qū)商業(yè)化種植或作為食品和飼料，我國也在2008年批準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因玉米MIR604進(jìn)口用作加工原料。
[0003]為加強(qiáng)轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品的安全管理，全球50多個國家和地區(qū)制訂了轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識制度。我國于2001年相繼頒布實施了《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理條例》及安全評價、標(biāo)識管理、進(jìn)口安全、加工審批等一系列配套管理辦法，對轉(zhuǎn)基因生物進(jìn)行全產(chǎn)業(yè)鏈監(jiān)管，要求對轉(zhuǎn)基因玉米、大豆、油菜、棉花、番茄等5類17種產(chǎn)品實施強(qiáng)制性標(biāo)識管理制度。
[0004]轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)是轉(zhuǎn)基因生物安全管理的重要技術(shù)支撐。目前轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)主要分為兩大類:一類以外源DNA為檢測對象，如PCR、基因芯片等，另一類以外源基因表達(dá)的蛋白質(zhì)為檢測對象，如ELISA、免疫試紙條等。在上述方法中，PCR方法應(yīng)用最為廣泛，但基于PCR技術(shù)的轉(zhuǎn)基因檢測方法需要PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)等專業(yè)儀器設(shè)備，且擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測時間較長(約3~4 h)，難以實現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測，因此，在實際工作中需要一種更加便捷、準(zhǔn)確、且適用于現(xiàn)場操作的轉(zhuǎn)基因檢測新技術(shù)。
[0005]LAMP技術(shù)是由日本榮研化學(xué)株式會社在2000年開發(fā)的一種新的基因擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)的基本特點是:①恒溫擴(kuò)增:整個擴(kuò)增反應(yīng)在恒溫條件(6(T65°C)進(jìn)行，不需要特殊儀器設(shè)備；②快速高效:整個擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測可在I h內(nèi)完成；③高特異性:針對靶標(biāo)序列的6個區(qū)域設(shè)計4條檢測引物，擴(kuò)增特異性高；④高靈敏度:檢測極限可低至10個拷貝或更低；⑤鑒定簡便:擴(kuò)增產(chǎn)物有多種鑒定方法，如肉眼觀察或利用濁度儀觀察反應(yīng)管內(nèi)沉淀的濁度變化、加入染料觀察顏色變化等。
[0006]LAMP方法具有快速高效、操作簡便、特異性強(qiáng)、靈敏度高等特點，不需要特殊儀器，適合現(xiàn)場快速檢測，在轉(zhuǎn)基因植物檢測領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。目前尚未有利用LAMP方法檢測轉(zhuǎn)基因植物中cir3A基因的檢測方法和試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的一個目的在于公開一種轉(zhuǎn)基因植物中cry3A基因的LAMP檢測引物組。
[0008] 本發(fā)明的另一個目的在于公開一種轉(zhuǎn)基因植物中CirM基因的LAMP檢測試劑盒。[0009]本發(fā)明的另一個目的在于公開一種基于上述引物組和試劑盒檢測轉(zhuǎn)基因植物中cry3A基因的LAMP檢測方法。
[0010]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下:
根據(jù)CIT.3A基因的核苷酸序列，設(shè)計CIT.3A基因的LAMP檢測引物組，其核苷酸序列如SEQ ID NO: f 5 ;確定LAMP檢測方法的技術(shù)參數(shù)，并對檢測方法的特異性、靈敏度進(jìn)行驗證。
[0011]轉(zhuǎn)基因植物中CiySA基因的LAMP檢測引物組，包括外引物1、外引物2、內(nèi)引物1、內(nèi)引物2、環(huán)引物，其核苷酸序列分別如下所示:
外引物 1:AAGCCCCACCTGTTCGA (SEQ ID NO:1);
外引物 2:GGCTCGCTGCTCTTGTTG (SEQ ID NO:2);
內(nèi)引物 1:AGTTGAAGCTGTCGTTGCCGTACCTGCACCGCATCCAGTTC (SEQ ID NO:3);
內(nèi)引物 2:GGAGCGGCAACTACGTGAGCAGAAGGGGCTGGTGATGA (SEQ ID NO:4);
環(huán)引物:GGGCTGGAAACGCGTGT (SEQ ID NO:5)。
[0012]轉(zhuǎn)基因植物中ciy3A基因的LAMP檢測試劑盒，包括以下組分:
(1)檢測引物溶液:由2條外引物和2條內(nèi)引物配制的檢測引物溶液，外引物1、外引物2、內(nèi)引物I和內(nèi)引物2的濃度依次為4飛Mmol/L、r6 Mmol/L、32~48 Mmol/L和32~48Mmol/L ；
(2)環(huán)引物溶液:環(huán)引物濃度為16~24Mmol/L ；
(3)具有鏈置換活性的DNA聚合酶:濃度為7~9U/ μ L ;
(4)IOX 反應(yīng)緩沖液:200 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8),100 mmol/L KCl, 100 mmol/L(NH4) 2S04,40~100 mmol/L MgSO4,6~14 mol/L 甜菜喊；
(5)dNTPs溶液，由濃度分別為10 mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四種脫氧核糖核苷酸溶液等體積混合而成；
(6)陽性DNA對照樣品，轉(zhuǎn)基因植物的基因組DNA，或含有基因序列的大腸桿菌質(zhì)粒DNA ；
(7)陰性DNA對照樣品:不含ciy3A基因序列的DNA。
[0013]優(yōu)選的，所述的檢測引物溶液中含有5 Mmol/L外引物1、5 Mmol/L外引物2、40Mmol/L內(nèi)引物1、40 Mmol/L內(nèi)引物2。
[0014]優(yōu)選的，所述的環(huán)引物溶液中含有20 Mmol/L環(huán)引物。
[0015]優(yōu)選的，所述的具有鏈置換活性的DNA聚合酶為Bst DNA聚合酶，濃度為8 U/μ L0
[0016]優(yōu)選的，所述的10Χ反應(yīng)緩沖液中MgSO4、甜菜堿的濃度分別為80 mmol/L和8mol/L。
[0017]本發(fā)明的CIT3A基因的LAMP檢測試劑盒中還可以含有顯色劑，所述顯色劑為SYBRGREEN I熒光染料。
[0018]利用以上所述的試劑盒檢測基因的方法，包括如下步驟:
(1)提取待測 樣品的基因組DNA:按常規(guī)CTAB方法或植物基因組DNA提取試劑盒提取待測樣品的基因組DNA ；
(2)配制待測樣品的LAMP檢測反應(yīng)體系:在200μ L PCR反應(yīng)管內(nèi)加入模板DNA 2^5UL、檢測引物溶液1.5 yL、環(huán)引物溶液I yL、Bst DNA聚合酶I μ L、10X反應(yīng)緩沖液2.5μ L、dNTPs溶液3 μ L,用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25 μ L ；
(3)配制對照樣品的LAMP檢測反應(yīng)體系:配制陽性對照、陰性對照反應(yīng)體系時，除將模板DNA分別換成陽性DNA對照樣品、陰性DNA對照樣品外，其他組分與步驟(2) —致；
(4)運(yùn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng):63~65°C孵育3(T60min，80°C孵育5min終止反應(yīng)；
(5)LAMP擴(kuò)增結(jié)果的鑒定:通過肉眼觀察或利用濁度儀觀察反應(yīng)管內(nèi)沉淀的濁度變化來判斷擴(kuò)增結(jié)果，或取2~5 PL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果。
[0019]在試劑盒中含有顯色劑的情況下，在步驟(4)后獲得的LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物中加入1~ 2μL顯色劑，通過肉眼觀察顯色結(jié)果來判斷擴(kuò)增結(jié)果。
[0020]通過實驗證明，本發(fā)明提供的基因的LAMP檢測引物組、試劑盒及檢測方法具有快速高效、操作簡便、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021 ] 圖1為實施例1的LAMP檢測結(jié)果圖，I為陽性對照樣品，2為陰性對照樣品，3、4為待測樣品；
圖2為實施例2的LAMP檢測結(jié)果圖，I為陽性對照樣品，2為陰性對照樣品，3、4為待測樣品；
圖3是實施例3中進(jìn)行特異性檢測的結(jié)果圖，1~15依次為轉(zhuǎn)基因玉米M0N89034、M0N810、Btll、Btl76，轉(zhuǎn)基因棉花 M0N531、MONl5985，轉(zhuǎn)基因水稻 KF_6、TT51_1，轉(zhuǎn)基因玉米M0N863、M0N88017、MIR604、TC1507、59122、非轉(zhuǎn)基因玉米陰性對照、空白對照；
圖4和圖5是實施例4中進(jìn)行靈敏度檢測的結(jié)果圖，1~7依次為轉(zhuǎn)基因玉米MIR604質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為100%、10%、1%、0.1%、0.05%,0..02%,0.01%的測試樣品，8為非轉(zhuǎn)基因玉米樣品，M為DNA分子量Marker。
【具體實施方式】
[0022]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0023]實施例1不含顯色劑的試劑盒及其檢測方法:
按下列配方制備ciy3A基因的LAMP檢測試劑盒:
(1)檢測引物溶液:合成外引物1、外引物2、內(nèi)引物I和內(nèi)引物2，將引物干粉用滅菌去離子水分別配成濃度為100 μ mol/L的母液，然后取7.5 111^外引物1、7.5 μ L外引物2、60 “1^內(nèi)引物1、60 “1^內(nèi)引物2、15 μ L滅菌去離子水，充分混勻配成150 μ L的基因的LAMP檢測引物溶液，其中引物序列分別為:
外引物 1:AAGCCCCACCTGTTCGA (SEQ ID NO:1);
外引物 2:GGCTCGCTGCTCTTGTTG (SEQ ID NO:2)；
內(nèi)引物 1:AGTTGAAGCTGTCGTTGCCGTACCTGCACCGCATCCAGTTC (SEQ ID NO:3);
內(nèi)引物 2:GGAGCGGCAACTACGTGAGCAGAAGGGGCTGGTGATGA (SEQ ID NO:4);
(2)環(huán)引物溶液:合成環(huán)引物，將引物干粉用滅菌去離子水配成濃度為100μ mol/L的母液，然后取20 μ L環(huán)引物、80 μ L滅菌去離子水，充分混勻配成100 4 1^的<^7124基因的LAMP環(huán)引物溶液，其中引物序列為:
環(huán)引物:GGGCTGGAAACGCGTGT (SEQ ID NO:5);(3)Bst DNA聚合酶，濃度為8 U/yL；
(4)IOX 反應(yīng)緩沖液:200 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8),100 mmol/L KCl, 100 mmol/L(NH4)2SO4,80 mmol/L MgSO4,8 mol/L 甜菜喊;
(5)dNTPs溶液，由濃度分別為10 mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四種脫氧核糖核苷酸溶液等體積混合而成；
(6)陽性DNA對照樣品，轉(zhuǎn)基因植物的基因組DNA，或含有基因序列的大腸桿菌質(zhì)粒DNA ；
(7)陰性DNA對照樣品:不含ciy3A基因序列的DNA。
[0024]用上述試劑盒按以下方法對待測樣品進(jìn)行檢測:
(1)提取待測樣品的 基因組DNA:采用北京天根公司生產(chǎn)的植物DNA提取試劑盒方法，提取待測樣品的基因組DNA ；
(2)配制待測樣品的LAMP檢測反應(yīng)體系:在200uL PCR反應(yīng)管內(nèi)加入模板DNA 2UL、檢測引物溶液1.5 yL、環(huán)引物溶液I yL、Bst DNA聚合酶I μ L、10X反應(yīng)緩沖液2.5μ L、dNTPs溶液3 μ L,用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25 μ L ；
(3)配制對照樣品的LAMP檢測反應(yīng)體系:配制陽性對照、陰性對照反應(yīng)體系時，除將模板DNA分別換成陽性DNA對照樣品、陰性DNA對照樣品外，其他組分與步驟(2) —致；
(4)將反應(yīng)管放置在濁度儀中，運(yùn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng):63°C孵育40min，80°C孵育5min終止反應(yīng)；
(5)LAMP擴(kuò)增結(jié)果的鑒定:利用實時濁度儀(日本榮研公司)觀察反應(yīng)管內(nèi)沉淀的濁度變化(反映為實時擴(kuò)增曲線)來判斷擴(kuò)增結(jié)果。
[0025]本實施例中，陽性對照有沉淀產(chǎn)生(出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線)，陰性對照無沉淀產(chǎn)生(無典型擴(kuò)增曲線);待測樣品I的反應(yīng)管出現(xiàn)沉淀，表明含有基因成分；待測樣品2的反應(yīng)管未出現(xiàn)沉淀，表明不含有基因成分。
[0026]實施例2含顯色劑的試劑盒及其檢測方法 按下列配方制備ciy3A基因的LAMP檢測試劑盒:
(1)檢測引物溶液:合成外引物1、外引物2、內(nèi)引物I和內(nèi)引物2，將引物干粉用滅菌去離子水分別配成濃度為100 μ mol/L的母液，然后取7.5 111^外引物1、7.5 μ L外引物2、60 “1^內(nèi)引物1、60 “1^內(nèi)引物2、15 μ L滅菌去離子水，充分混勻配成150 μ L的基因的LAMP檢測引物溶液，其中引物序列分別為:
外引物 1:AAGCCCCACCTGTTCGA (SEQ ID NO:1);
外引物 2:GGCTCGCTGCTCTTGTTG (SEQ ID NO:2)；
內(nèi)引物 1:AGTTGAAGCTGTCGTTGCCGTACCTGCACCGCATCCAGTTC (SEQ ID NO:3);
內(nèi)引物 2:GGAGCGGCAACTACGTGAGCAGAAGGGGCTGGTGATGA (SEQ ID NO:4);
(2)環(huán)引物溶液:合成環(huán)引物，將引物干粉用滅菌去離子水配成濃度為100μ mol/L的母液，然后取20 μ L環(huán)引物、80 μ L滅菌去離子水，充分混勻配成100 4 1^的<^7124基因的LAMP環(huán)引物溶液，其中引物序列為:
環(huán)引物:GGGCTGGAAACGCGTGT (SEQ ID NO:5);
(3)Bst DNA聚合酶，濃度為8 U/yL；
(4)10X 反應(yīng)緩沖液:200 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8),100 mmol/L KCl, 100 mmol/L(NH4)2SO4,80 mmol/L MgSO4,8 mol/L 甜菜喊;
(5)dNTPs溶液，由濃度分別為10 mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四種脫氧核糖核苷酸溶液等體積混合而成；
(6)陽性DNA對照樣品，轉(zhuǎn)基因植物的基因組DNA，或含有基因序列的大腸桿菌質(zhì)粒DNA ；
(7)陰性DNA對照樣品:不含ciy3A基因序列的DNA；
(8)顯色劑:1000XSYBRGREEN I熒光染料。
用上述試劑盒按以下方法對待測樣品進(jìn)行檢測:
(1)提取待測樣品的基因組DNA:采用北京天根公司生產(chǎn)的植物DNA提取試劑盒方法，提取待測樣品的基因組DNA ；
(2)配制待測樣品的LAMP檢測反應(yīng)體系:在200uL PCR反應(yīng)管內(nèi)加入模板DNA 2UL、檢測引物溶液1.5 yL、環(huán)引物溶液I yL、Bst DNA聚合酶I μ L、10X反應(yīng)緩沖液2.5μ L、dNTPs溶液3 μ L,用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25 μ L ；
(3)配制對照樣品的LAMP檢測反應(yīng)體系:配制陽性對照、陰性對照反應(yīng)體系時，除將模板DNA分別換成陽性DNA對照樣品、陰性DNA對照樣品外，其他組分與步驟(2) —致；
(4)將反應(yīng)管放置在恒溫水浴鍋中，運(yùn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng):63°C孵育40min，8(TC孵育5min終止反應(yīng)；
(5)LAMP擴(kuò)增結(jié)果的鑒定:在LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物中加入2 μL的顯色劑，混勻，若反應(yīng)管顯現(xiàn)綠色則為陽性，若顯現(xiàn)橙色則為陰性。
[0027]本實施例中，陽性對照顯現(xiàn)綠色，陰性對照顯現(xiàn)橙色；待測樣品I的反應(yīng)管顯現(xiàn)綠色，表明含有基因成分；待測樣品2的反應(yīng)管顯現(xiàn)橙色，表明不含有基因成分。
[0028]實施例3試劑盒及檢測方法的特異性實驗
對實施例2所述的試劑盒及其檢測方法的特異性進(jìn)行實驗，測試樣品包括:轉(zhuǎn)基因玉米 MIR604 CcrrSA ), M0N89034 icrylA.105, cry2Ab), M0N810 (.cryIAb), Btll (.cryIAb),Btl76 (crrlAb),M0m63 (crj^^)、M0N88017 助)、TC1507 (^7/^),59122 icry34Ab、轉(zhuǎn)基因棉花 M0N531 (.cry I Ac), M0N15985 (.cry I Ac,轉(zhuǎn)基因水稻 KF-6
{cryIAb), TT51-1 icrylAb/Ac)等13種抗蟲轉(zhuǎn)基因作物，以及非轉(zhuǎn)基因玉米。
[0029]本實施例中，僅含有基因的轉(zhuǎn)基因玉米MIR604樣品反應(yīng)管顯現(xiàn)綠色，表明本發(fā)明所述的試劑盒及檢測方法對⑶成基因具有很好的特異性。
[0030]實施例4試劑盒及檢測方法的靈敏度實驗
對實施例2所述的試劑盒及其檢測方法的靈敏度進(jìn)行實驗，測試樣品由轉(zhuǎn)基因玉米MIR604 (含基因)與非轉(zhuǎn)基因玉米按一定質(zhì)量比混合制備而成，8份測試樣品中的MIR604 玉米的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 100%、10%、1%、0.1%、0.05%,0.02%,0.01%,O0[0031 ] 本實施例中，MIR604玉米質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為100%、10%、1%、0.1%、0.05%、0.02%、
0.01%的測試樣品反應(yīng)管中均顯現(xiàn)綠色，而陰性對照顯現(xiàn)橙色，表明本發(fā)明所述試劑盒及其檢測方法的檢測靈敏度可達(dá)0.01%。
[0032]以本發(fā)明所述的外引物I和外引物2，對上述測試樣品進(jìn)行定性PCR檢測。 [0033]PCR檢測反應(yīng)體系為:I XPCR緩沖液(大連寶生物公司)、0.2 mmol/L dNTPs (大連寶生物公司)、0.2 μ mol/L外引物1、0.2 μ mol/L外引物2、1 U Taq DNA聚合酶(大連寶生物公司)、2 μL模板DNA，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25 μ L。PCR反應(yīng)程序為:94°C預(yù)變性5min;95°C變性 30 s、60°C退火 30 S、72°C延伸 30 S，35 次循環(huán)；72°C延伸 7 min。PCR 結(jié)束后，取5 UL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0034]本實施例中，MIR604玉米質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為100%、10%、1%、0.1%、0.05%的測試樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)典型電泳條帶，而0.02%、0.01%、陰性對照均無典型電泳條帶，表明PCR方法的檢測靈敏度為0.05%。
[0035]兩種方法的比較結(jié)果顯示，本發(fā)明的試劑盒及其檢測方法的檢測靈敏度可以達(dá)到
0.01%，而PCR方法的檢測靈敏度為0.05% ;經(jīng)比對，本發(fā)明的試劑盒及檢測方法的靈敏度明顯高于PCR方法，可檢測出更低含量的樣品。
[0036]應(yīng)當(dāng)說明的是，上述實施例為本發(fā)明的具體實施例子，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為 是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.轉(zhuǎn)基因植物中基因的LAMP檢測引物組，包括外引物1、外引物2、內(nèi)引物1、內(nèi)引物2和環(huán)引物，其核苷酸序列分別如下所示:
外引物 1:AAGCCCCACCTGTTCGA (SEQ ID NO:I)；
外引物 2:GGCTCGCTGCTCTTGTTG (SEQ ID NO:2)；
內(nèi)引物 1:AGTTGAAGCTGTCGTTGCCGTACCTGCACCGCATCCAGTTC (SEQ ID NO:3);
內(nèi)引物 2:GGAGCGGCAACTACGTGAGCAGAAGGGGCTGGTGATGA (SEQ ID NO:4); 環(huán)引物:GGGCTGGAAACGCGTGT (SEQ ID NO:5)。
2.轉(zhuǎn)基因植物中ciy3A基因的LAMP檢測試劑盒，包括以下組分: (1)檢測引物溶液:由權(quán)利要求1所述的2條外引物和2條內(nèi)引物配制的檢測引物溶液，外引物1、外引物2、內(nèi)引物I和內(nèi)引物2的濃度依次為4飛Mmol/L,r6 Mmol/L、32~48Mmol/L和 32~48 Mmol/L ； (2)環(huán)引物溶液:由權(quán)利要求1所述的環(huán)引物配制而成，環(huán)引物的濃度為16~24Mmol/L ； (3)具有鏈置換活性的DNA聚合酶:濃度為7~9U/ μ L ; (4)IOX 反應(yīng)緩沖液:200 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8),100 mmol/L KCl, 100 mmol/L(NH4) 2S04,40~100 mmol/L MgSO4,6~14 mol/L 甜菜喊； (5)dNTPs溶液，由濃度分別為10 mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四種脫氧核糖核苷酸溶液等體積混合而成； (6)陽性DNA對照樣品，轉(zhuǎn)基因植物的基因組DNA，或含有基因序列的大腸桿菌質(zhì)粒DNA ； (7)陰性DNA對照樣品:不含ciy3A基因序列的DNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的CirJA基因的LAMP檢測試劑盒，其特征在于:所述的檢測引物溶液中含有5 Mmol/L外引物1、5 Mmol/L外引物2、40 Mmol/L內(nèi)引物1、40 μ mol/L內(nèi)引物2。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的CirJA基因的LAMP檢測試劑盒，其特征在于:所述的環(huán)引物溶液中含有20 Mmol/L環(huán)引物。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的cit3A基因的LAMP檢測試劑盒，其特征在于:所述的具有鏈置換活性的DNA聚合酶為Bst DNA聚合酶，濃度為8 U/μ L0
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因的LAMP檢測試劑盒，其特征在于:所述的10X反應(yīng)緩沖液中MgSO4、甜菜堿的濃度分別為80 mmol/L、8 mol/L。
7.利用權(quán)利要求2飛任一項所述的試劑盒檢測cit3A基因的方法，包括以下步驟: (1)提取待測樣品的基因組DNA； (2)配制待測樣品的LAMP檢測反應(yīng)體系:在200μ L PCR反應(yīng)管內(nèi)加入模板DNA 2^5UL、檢測引物溶液1.5 yL、環(huán)引物溶液I yL、Bst DNA聚合酶I μ L、10X反應(yīng)緩沖液2.5μ L、dNTPs溶液3 μ L,用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25 μ L ； (3)配制對照樣品的LAMP檢測反應(yīng)體系:配制陽性對照、陰性對照反應(yīng)體系時，除將模板DNA分別換成陽性DNA對照樣品、陰性DNA對照樣品外，其他組分與步驟(2) —致； (4)運(yùn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng):63~65°C孵育3(T60min，80°C孵育5min終止反應(yīng)； (5)LAMP擴(kuò)增結(jié)果的鑒定:通過肉眼觀察或利用濁度儀觀察反應(yīng)管內(nèi)沉淀的濁度變化來判斷擴(kuò)增結(jié)果、或取2~5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果。
8.根據(jù)權(quán)利要求2飛任一項所述的ciy3A基因的LAMP檢測試劑盒，其特征在于:試劑盒中還包括顯色劑，所述顯色劑為SYBR GREEN I熒光染料。
9.利用權(quán)利要求8所述的試劑盒檢測cry3A基因的方法，包括以下步驟: (1)提取待測樣品的基因組DNA； (2)配制待測樣品的LAMP檢測反應(yīng)體系:在200μ L PCR反應(yīng)管內(nèi)加入模板DNA 2^5UL、檢測引物溶液1.5 yL、環(huán)引物溶液I yL、Bst DNA聚合酶I μ L、10X反應(yīng)緩沖液2.5μ L、dNTPs溶液3 μ L,用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25 μ L ； (3)配制對照樣品的LAMP檢測反應(yīng)體系:配制陽性對照、陰性對照反應(yīng)體系時，除將模板DNA分別換成陽性DNA對照樣品、陰性DNA對照樣品外，其他組分與步驟(2) —致； (4)運(yùn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng):63~65°C孵育3(T60min，80°C孵育5min終止反應(yīng)； (5)LAMP擴(kuò)增結(jié)果的鑒 定:在反應(yīng)管中加入廣2μL顯色劑，通過肉眼觀察顯色結(jié)果來判斷擴(kuò)增結(jié)果。
【文檔編號】C12Q1/68GK103924000SQ201410176842
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年4月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月29日
【發(fā)明者】李飛武, 閆偉, 李蔥蔥, 龍麗坤, 董立明, 邢珍娟, 夏蔚, 邵改革 申請人:吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院