肝硬化microRNA分子標(biāo)志物組合及其用途
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種肝硬化轉(zhuǎn)歸microRNA分子標(biāo)志物，序列號(hào)1-13，及其在制備肝硬化個(gè)體化用藥診斷試劑中的用途。肝硬化患者microRNA分子標(biāo)志物在血漿/血清中的含量與健康對(duì)照血漿/血清中含量相比，存在顯著差異，能夠有效區(qū)分肝硬化患者和健康對(duì)照人群，在肝硬化患者用藥過程中，當(dāng)肝硬化轉(zhuǎn)歸microRNA分子標(biāo)志物調(diào)整到正常水平，可輔助指導(dǎo)停止用藥。本發(fā)明還提供了一種指導(dǎo)肝硬化個(gè)體化用藥的診斷試劑盒。使用本發(fā)明的肝硬化轉(zhuǎn)歸microRNA分子標(biāo)志物，指導(dǎo)肝硬化患者的個(gè)體化用藥，具有操作簡(jiǎn)單，安全無創(chuàng)傷，高特異性，高靈敏性以及易于大量篩查的特點(diǎn)。
【專利說明】肝硬化microRNA分子標(biāo)志物組合及其用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及肝硬化個(gè)體化用藥診斷領(lǐng)域，具體來說涉及一組肝硬化microRNA分 子標(biāo)志物組合，其對(duì)肝硬化患者進(jìn)行診斷和/或預(yù)后評(píng)估的用途以及含有其特異引物的試 劑盒。其可應(yīng)用于對(duì)肝硬化患者進(jìn)行診斷和/或預(yù)后評(píng)估，指導(dǎo)患者科學(xué)用藥和停藥，既減 少患者用藥痛苦，也減少醫(yī)療資源的浪費(fèi)。

【背景技術(shù)】
[0002] microRNA(miRNA)是近年來的研究熱點(diǎn)，它是一種廣泛存在于真核生物中的單鏈 小分子RNA，不具編碼功能，但它能夠結(jié)合于基因序列的側(cè)翼區(qū)域阻遏或抑制靶mRNA的翻 譯，具有高度的保守性、時(shí)序性和組織特異性，目前在腫瘤、血液病、病毒感染等多種疾病的 臨床診斷、治療及預(yù)后評(píng)價(jià)等領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用。
[0003] 肝炎后肝硬化可由乙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、丙型肝炎病毒所致慢性肝炎演 變而成。其預(yù)后與病毒復(fù)制狀態(tài)、肝功能狀態(tài)和有無嚴(yán)重合并癥密切相關(guān)。代償性肝硬化 病人如果年齡小，病毒復(fù)制停止或低復(fù)制狀態(tài)，抗HBe陽性，肝功能尚好，白蛋白不低，血膽 紅素近正常及門脈高壓不高者，病情可能穩(wěn)定，甚至長(zhǎng)期代償，一生無癥狀。一旦發(fā)生失代 償癥狀，5年存活率低于50%。失代償?shù)母斡不舨环e極治療，半年存活率不及半數(shù)。主 要死因?yàn)槁愿喂δ芩ソ?、合并癥及肝癌。
[0004] 影響肝硬化轉(zhuǎn)歸的因素很多，包括（1)性別、年齡；（2)肝功能與預(yù)后肝臟體積大 比偏小者預(yù)后好；（3)合并癥，包括門脈高壓、腹水、肝性腦病、感染、肝腎綜合征等；(4)病 毒感染的狀態(tài)和炎癥活動(dòng)反應(yīng)；（5)肝炎病理改變與預(yù)后。但目前尚沒有指標(biāo)檢測(cè)肝硬化 的轉(zhuǎn)歸，指導(dǎo)臨床用藥。
[0005] 近年來的研究表明，乙型肝炎病毒感染、慢性乙型肝炎、肝硬化和miRNA密切相 關(guān)，miRNA可以通過作用于病毒本身或作用于免疫系統(tǒng)從而影響治療過程，因此對(duì)肝硬化用 藥的診斷也可能有相應(yīng)的作用。與肝硬化相關(guān)的miRNA種類較多且作用不一，已有研究表 明在乙型肝炎病毒感染后，患者體內(nèi)miRNA表達(dá)譜會(huì)發(fā)生變化，其中一些特異性miRNA已發(fā) 表相關(guān)專利。雖然已在該領(lǐng)域進(jìn)行了一些研究，但是肝硬化患者用藥后的miRNA表達(dá)變化 目前還沒有研究，在臨床和研究中，需尋找可有效判斷肝硬化用藥后療效、指導(dǎo)臨床停藥的 miRNA標(biāo)志物。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的一個(gè)方面提供了一種肝硬化轉(zhuǎn)歸microRNA分子標(biāo)志物組合，其包括一 種以上選自以下的 microRNA 核酸分子：SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 10, SEQ ID N0：1USEQ ID N0：12,SEQ ID NO ：13〇
[0007] 優(yōu)選地，所述的一種以上為2-13種、更優(yōu)選3-10種、進(jìn)一步優(yōu)選3-8種，最優(yōu)選4 種。
[0008] 優(yōu)選地，所述的肝硬化轉(zhuǎn)歸microRNA分子標(biāo)志物組合含有SEQ ID NO :3、SEQ ID N0:4、SEQIDN0:1(^PSEQIDN0:11。
[0009] 本發(fā)明提供了一組新的肝硬化轉(zhuǎn)歸相關(guān)的miRNA作為肝硬化轉(zhuǎn)歸的分子標(biāo)志物， 由一組miRNA組成，其序列如下所示SEQ ID N0 :1至序列號(hào)13中的一種以上。
[0010]

【權(quán)利要求】
1. 一種肝硬化轉(zhuǎn)歸microRNA分子標(biāo)志物組合，其包括一種以上選自以下的microRNA 核酸分子：SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID DO :11、SEQ ID NO :12、SEQ ID NO :13,優(yōu)選地，所述的一種以上為2-13種、更優(yōu)選3-10種、進(jìn)一步優(yōu)選3-8 種，最優(yōu)選4種。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的肝硬化轉(zhuǎn)歸microRNA分子標(biāo)志物組合，其含有SEQ ID NO : 3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :10 和 SEQ ID NO: 11。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的肝硬化轉(zhuǎn)歸microRNA分子標(biāo)志物組合在制備肝硬化個(gè)體化 用藥診斷試劑中的用途，所述的肝硬化轉(zhuǎn)歸microRNA分子標(biāo)志物組合優(yōu)選含有SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :10 和 SEQ ID NO: 11。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述用途，其中，所述診斷試劑通過檢測(cè)被試者血漿/血清中肝硬化 轉(zhuǎn)歸microRNA分子標(biāo)志物組合的含量，并與健康對(duì)照人群平均水平相比較來判斷是否停 止用藥。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述用途，其中，使用定量PCR的方法來檢測(cè)被試者血漿中肝硬化轉(zhuǎn) 歸microRNA分子標(biāo)志物組合的含量。
6. -種指導(dǎo)肝硬化個(gè)體化用藥的診斷試劑盒，其特征在于：包括權(quán)利要求1所述肝硬 化microRNA分子標(biāo)志物組合的特異性正向引物組合，優(yōu)選含有SEQ ID NO :3、SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO :10和SEQ ID NO :11的組合的特異性正向引物。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的診斷試劑盒，其特征在于所述的特異性正向引物包括一種以 上選自以下序列的引物組合：SEQ ID N0:14、SEQ ID N0:15、SEQ ID N0:16、SEQ ID N0:17、 SEQ ID NO ：18, SEQ ID N0：19,SEQ ID N0：20,SEQ ID N0：2USEQ ID N0：22,SEQ ID NO： 23、SEQIDN0:24、SEQIDN0:25、SEQIDN0:26，優(yōu)選含有SEQIDN0 :16、SEQIDN0:17、 SEQ ID NO :23 和 SEQ ID NO :24。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的診斷試劑盒，其進(jìn)一步包括： (1)血漿/血清總RNA提取試劑， ⑵RNA加 polyA試劑， (3) RT-PCR 試劑， (4) 定量PCR試劑； 其中，定量PCR試劑中包括權(quán)利要求1所述肝硬化轉(zhuǎn)歸microRNA分子標(biāo)志物組合的特 異性正向引物其中，所述血漿總RNA提取試劑中包括序列為SEQ ID NO :27的外部控制序 列-1 (External Control-Ι)，其中，所述RNA加 polyA試劑中包括序列為SEQ ID NO :28的 外部控制序列-2 (External Control-2)，其中，所述RT-PCR試劑中包括序列為SEQ ID NO: 29的反轉(zhuǎn)錄引物（RT-Primer)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述診斷試劑盒，其中，所述定量PCR試劑中包括序列分別為SEQ ID NO :30和31的通用反向引物UPM-short和UPM-long。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104232638SQ201410155061
【公開日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2014年4月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月18日
【發(fā)明者】李寧, 李啟靖, 張永宏, 張衛(wèi)紅, 石佳, 李鵬, 魏穎穎 申請(qǐng)人:首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院, 北京曠博生物技術(shù)有限公司