一種集成細(xì)胞分選及檢測的微流控芯片系統(tǒng)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種集成細(xì)胞分選及檢測的微流控芯片系統(tǒng),該系統(tǒng)包括微流控芯片、高頻鎖相放大器和處理器,其中微流控芯片由流道層、電極層、基底層和PCB板依次對準(zhǔn)封裝而成,流道層上設(shè)有細(xì)胞分選螺旋流道、檢測主流道和縮進流道,縮進流道和電極層的平面金屬電極對準(zhǔn),在主流道兩側(cè)形成液體電極結(jié)構(gòu);電極層的電極通過PCB板的功率放大電路、I/V轉(zhuǎn)換電路與高頻鎖相放大器構(gòu)成差分高頻阻抗測量電路實現(xiàn)細(xì)胞交流阻抗的差分檢測。本發(fā)明的系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)對稀有細(xì)胞分選與表征功能的整合,提高了細(xì)胞檢測技術(shù)的集成度和準(zhǔn)確性,可廣泛用于稀有細(xì)胞生物學(xué)研究、疾病早期診斷與治療等領(lǐng)域。
【專利說明】一種集成細(xì)胞分選及檢測的微流控芯片系統(tǒng)
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微流控芯片和生物粒子操控、檢測領(lǐng)域,具體涉及一種集成螺旋流道慣性分選技術(shù)和差分電阻抗測量技術(shù)的微流控芯片稀有細(xì)胞檢測系統(tǒng)。
【背景技術(shù)】
[0002]捕捉檢測血液、胸水等體液中微乎其微的稀有細(xì)胞,有助于疾病的早期診斷與患者的病情監(jiān)測以及開展個性化治療。目前,臨床上常用的稀有細(xì)胞檢測方法有免疫細(xì)胞化學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)、熒光原位雜交及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)等,這些方法具有各自的優(yōu)勢,但都以稀有細(xì)胞表達的生物分子標(biāo)記物為分析對象,存在操作復(fù)雜、樣品消耗大、檢測效率低以及實驗儀器昂貴等共同缺點。結(jié)合微流控技術(shù)、阻抗分析技術(shù)和流式細(xì)胞術(shù)的微流控阻抗細(xì)胞儀,是一種能夠?qū)崿F(xiàn)單細(xì)胞連續(xù)分析的非標(biāo)記方法,與上述方法相比,具有樣品消耗低、操作簡單和處理快速等優(yōu)勢,在細(xì)胞的計數(shù)、形貌分析和介電性能表征等方面得到了廣泛的應(yīng)用。
[0003]目前已有研究者嘗試?yán)梦⒘骺刈杩辜?xì)胞儀分析檢測稀有細(xì)胞,并取得初步進展。然而已有的微流控阻抗細(xì)胞儀集成度低,通常只包括阻抗測量與表征單項功能模塊,沒有涉及細(xì)胞分選、聚焦等前處理過程,不能實現(xiàn)在體液中直接檢測稀有細(xì)胞,從而極大限制了稀有細(xì)胞檢測方法在臨床診斷中的應(yīng)用。且現(xiàn)有微流控阻抗細(xì)胞儀的測量頻率通常只達到IO7Hz級,能夠分析細(xì)胞膜電容和細(xì)胞質(zhì)電導(dǎo)率,但無法獲取細(xì)胞核等內(nèi)部結(jié)構(gòu)信息。另外,目前研究人員通常采用商業(yè)化的阻抗分析儀,限制了細(xì)胞檢測系統(tǒng)的應(yīng)用范圍,且不易實現(xiàn)微型化與便攜式。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種集成細(xì)胞分選及檢測的微流控芯片系統(tǒng),該系統(tǒng)集成了螺旋流道慣性分選技術(shù)與差分電阻抗測量技術(shù),實現(xiàn)了稀有細(xì)胞檢測的高通量分選與精確表征功能的有機整合。
[0005]為實現(xiàn)上述目的,本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
本發(fā)明集成細(xì)胞分選功能的微流控芯片稀有細(xì)胞檢測系統(tǒng)包括微流控芯片、高頻鎖相放大器以及處理器;所述微流控芯片由流道層、電極層、基底層和PCB板依次對準(zhǔn)封裝而成;其特征在于:所述流道層包括螺旋流道、突擴結(jié)構(gòu)流道、上分支流道、下分支流道、檢測主流道以及兩對縮進流道;所述的螺旋流道一端為樣品入口、所述的螺旋流道另一端為突擴結(jié)構(gòu),所述突擴結(jié)構(gòu)具有兩個出口,所述的兩個出口分別與所述的上分支流道和下分支流道連接;所述的下分支流道出口為檢測主流道,所述的檢測主流道出口為稀有細(xì)胞出口 ;所述的上分支流道出口為廢液出口,所述上分支流道設(shè)置有使廢液出口與稀有細(xì)胞出口之間流體壓力平衡的彎曲結(jié)構(gòu);所述兩對縮進流道對稱分布于檢測主流道的兩側(cè);
所述電極層包括一對信號施加電極和一對信號傳感電極,分別與兩對縮進流道相互對準(zhǔn),在檢測主流道的兩側(cè)形成液體電極結(jié)構(gòu);所述PCB板的集成電路包括電信號輸入接口、功率放大電路、I/V轉(zhuǎn)換電路以及電信號輸出接口 ;所述的ΙΛ轉(zhuǎn)換電路包括電流電壓轉(zhuǎn)換模塊和差分放大模塊;所述電信號輸入接口與功率放大電路連接,所述的功率放大電路分成兩路與所述的一對信號施加電極連接,所述Ι/v轉(zhuǎn)換電路與電信號輸出接口連接;所述的I/V轉(zhuǎn)換電路分成兩路與所述的一對信號傳感電極連接;
所述的高頻鎖相放大器通過第一輸出端與電信號輸入接口連接,高頻鎖相放大器通過第一輸入端與電信號輸出接口連接;所述高頻鎖相放大器、電信號輸入接口、功率放大電路、信號施加電極依次連接構(gòu)成激勵信號施加電路;所述信號傳感電極、Ι/v轉(zhuǎn)換電路、電信號輸出接口以及高頻鎖相放大器依次連接構(gòu)成差分阻抗信號傳感電路。
[0006]所述的高頻鎖相放大器通過第二輸出端與處理器連接。
[0007]進一步地,還包括進樣裝置、廢液收集裝置和稀有細(xì)胞收集裝置;所述進樣裝置和樣品入口連接;所述廢液收集裝置和廢液出口連接;所述稀有細(xì)胞收集裝置和稀有細(xì)胞出口連接。
[0008]與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明具有的有益效果是:
利用流體在螺旋流道中的慣性效應(yīng)和Dean流作用,將稀有細(xì)胞和其它細(xì)胞聚焦在不同的平衡位置,并通過突擴結(jié)構(gòu)流道分別導(dǎo)入下分支流道和上分支流道,同時,當(dāng)下分支流道中的稀有細(xì)胞運輸?shù)綑z測主流道的液體電極結(jié)構(gòu)時,借助差分阻抗測量電路獲取稀有細(xì)胞的差分電阻抗信號,得到稀有細(xì)胞的體積與內(nèi)部介電性能等參數(shù)信息,采用上述螺旋流道慣性分選技術(shù)結(jié)構(gòu)與差 分電阻抗測量技術(shù)集成,克服了已有細(xì)胞檢測方法的集成度低、測量頻率低等缺陷,實現(xiàn)對稀有細(xì)胞分選與表征功能的有效整合;另外,本系統(tǒng)的芯片結(jié)構(gòu)簡單、加工方便,檢測過程中無需鞘液、無需復(fù)雜的免疫標(biāo)記預(yù)處理,具有操作簡單、自動化程度高等優(yōu)點,可廣泛用于稀有細(xì)胞生物學(xué)研究、疾病早期診斷與治療等領(lǐng)域。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0009]圖1為本發(fā)明集成細(xì)胞分選及檢測的微流控芯片系統(tǒng)整體結(jié)構(gòu)示意圖;
圖2為本發(fā)明微流控芯片的結(jié)構(gòu)示意圖;
圖3為本發(fā)明螺旋流道中細(xì)胞慣性分選的原理示意圖;
圖4為本發(fā)明突擴結(jié)構(gòu)流道處細(xì)胞分選的原理示意圖;
圖5為本發(fā)明液體電極結(jié)構(gòu)的局部放大圖;
圖6為本發(fā)明差分交流阻抗測量電路原理示意圖。
[0010]圖中:11、微流控芯片,12、高頻鎖相放大器,13、處理器,14、進樣裝置,15、廢液收集裝置,16、稀有細(xì)胞收集裝置,17、微管,111、流道層,112、電極層,113、基底層,114、PCB板,121、電纜線,122、數(shù)據(jù)線,21、螺旋流道,22、突擴結(jié)構(gòu)流道,23、上分支流道,24、下分支流道,25、檢測主流道,28、緊固件,211、樣品入口,231、廢液出口,251、縮進流道,252、稀有細(xì)胞出口,261、信號施加電極,262、信號傳感電極,263、導(dǎo)電銀膠,264、導(dǎo)電銀膠,271、電信號輸入接口,272、功率放大電路,273、I/V轉(zhuǎn)換電路,274、電信號輸出接口,31、Dean流,32、螺旋流道內(nèi)壁面,33、螺旋流道內(nèi)壁面,41、稀有癌細(xì)胞,42、血細(xì)胞。
【具體實施方式】[0011]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步說明。
[0012]如圖1所示,本發(fā)明集成細(xì)胞分選及檢測的微流控芯片系統(tǒng)包括微流控芯片11、高頻鎖相放大器12、處理器13、樣品進樣裝置14、廢液收集裝置15和稀有細(xì)胞收集裝置16。樣品進樣裝置14、廢液收集裝置15和稀有細(xì)胞收集裝置16通過微管17與微流控芯片11連接,分別用于細(xì)胞樣品的進樣、廢液的收集和稀有細(xì)胞的收集。高頻鎖相放大器12通過電纜線121與PCB板114的集成電路的電信號輸入接口 271和電信號輸出接口 274分別連接,用于施加高頻交流信號(500MHz)和對響應(yīng)信號進行處理,并通過數(shù)據(jù)線122將處理后的交流阻抗信號傳輸?shù)教幚砥?3中,處理器13可以采用計算機。 [0013]如圖2,6所示,所述檢測系統(tǒng)的微流控芯片11由流道層111、電極層112、基底層113和PCB板114依次對準(zhǔn)封裝而成。流道層111包括螺旋流道21、突擴結(jié)構(gòu)流道22、上分支流道23、下分支流道24、檢測主流道25和兩對縮進流道251,螺旋流道21 —端為樣品入口 211,樣品入口 211通過微管17和樣品進樣裝置連接,螺旋流道21另一端為突擴結(jié)構(gòu)22,突擴結(jié)構(gòu)22具有兩個出口,兩個出口分別與上分支流道23和下分支流道24連接;下分支流道24出口為檢測主流道25,檢測主流道25出口為稀有細(xì)胞出口 252,稀有細(xì)胞出口 252通過微管17和稀有細(xì)胞收集裝置16連接;上分支流道23出口為廢液出口 231,廢液出口231通過微管17和廢液收集裝置15連接,上分支流道23設(shè)置有使廢液出口 231與稀有細(xì)胞出口 252之間流體壓力平衡的彎曲結(jié)構(gòu);兩對縮進流道251對稱分布于檢測主流道25的兩側(cè);電極層112包括一對信號施加電極261和一對信號傳感電極262,分別與兩對縮進流道251相互對準(zhǔn),在檢測主流道25的兩側(cè)形成液體電極結(jié)構(gòu);PCB板114的集成電路包括電信號輸入接口 271、功率放大電路272、I/V轉(zhuǎn)換電路273以及電信號輸出接口 274 ;所述的I/V轉(zhuǎn)換電路27包括電流電壓轉(zhuǎn)換模塊和差分放大模塊,所述電信號輸入接口 271通過銅箔線與功率放大電路272連接,所述的功率放大電路272分成兩路通過導(dǎo)電銀膠263與所述的一對信號施加電極261連接;所述高頻鎖相放大器12、電信號輸入接口 271、功率放大電路272、信號施加電極261依次連接構(gòu)成激勵信號施加電路;所述I/V轉(zhuǎn)換電路273通過銅箔線與電信號輸出接口 274連接;所述的I/V轉(zhuǎn)換電路273分成兩路通過導(dǎo)電銀膠263與所述的一對信號傳感電極262連接;所述信號傳感電極262、I/V轉(zhuǎn)換電路273、電信號輸出接口 274以及高頻鎖相放大器12依次連接構(gòu)成差分阻抗信號傳感電路。
[0014]微流控芯片11的基底層113所用材質(zhì)為透明的聚二甲基硅氧烷、玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯或聚碳酸酯中的任意一種,流道層111所用材質(zhì)為聚二甲基硅氧烷、玻璃、環(huán)氧樹月旨、聚甲基丙烯酸甲酯或聚碳酸酯中的任意一種,信號施加電極261和信號傳感電極262為完全相同的平面金屬微電極,其所用材質(zhì)為金或鉬等?;讓?13上電極層112的制作可通過結(jié)合光刻技術(shù)和磁控濺射技術(shù)實現(xiàn),而流道層111則可利用光刻技術(shù)或其他刻蝕技術(shù)快速加工得到,為了避免流道內(nèi)表面對細(xì)胞的吸附,采用化學(xué)修飾等特定方式對流道表面進行改性。通過設(shè)置微結(jié)構(gòu)對準(zhǔn)標(biāo)記,借助紫外/臭氧照射或氧等離子體處理等表面改性技術(shù)實現(xiàn)基底層113和流道層111的不可逆鍵合。PCB板114和基底層113通過緊固件28實現(xiàn)固定。
[0015]下面以血液中稀有癌細(xì)胞的分選與表征來闡述本發(fā)明微流控芯片系統(tǒng)的工作流程和基本原理。
[0016]本發(fā)明微流控芯片系統(tǒng)的主要工作流程:樣品進樣裝置14將稍稀釋的全血樣品輸送至螺旋流道21,細(xì)胞在螺旋流道21內(nèi)承受與細(xì)胞尺寸相關(guān)的慣性升力和Dean拽力作用,使得大小不同的血細(xì)胞42和稀有癌細(xì)胞41聚焦在各自的平衡位置上;利用突擴結(jié)構(gòu)流道22在螺旋流道21的末端將血細(xì)胞42從樣品中分離到上分支流道23,經(jīng)廢液出口 231收集到廢液收集裝置15,并將稀有癌細(xì)胞41導(dǎo)入下分支流道24 ;當(dāng)稀有癌細(xì)胞41沿下分支流道24進入檢測主流道25的測量單元時,信號施加電極261、信號傳感電極262、功率放大電路272、I/V轉(zhuǎn)換電路273、高頻鎖相放大器12組成的測量電路對稀有細(xì)胞進行差分交流阻抗測量,最后在計算機上對阻抗信號進行降噪和設(shè)別,分析獲取稀有癌細(xì)胞的尺寸和內(nèi)部介電特性信息。
[0017]如圖3所示,細(xì)胞在螺旋流道21內(nèi)的慣性分選原理:在螺旋流道21的彎流道中,流體的運動可在流道剖面和截面方向上進行分解。在流道剖面上,拋物線形的泊肅葉流使得細(xì)胞受到指向壁面的剪切誘導(dǎo)慣性升力作用而向流道壁面運動,當(dāng)細(xì)胞靠近壁面時,因細(xì)胞自旋而產(chǎn)生的對稱尾跡受壁面影響而產(chǎn)生一個指向流道中心的壁面誘導(dǎo)慣性升力,剪切誘導(dǎo)慣性升力和壁面誘導(dǎo)慣性升力統(tǒng)稱為慣性升力Fl。在流道截面上,由于流道中心附近流體較壁面附近流體具有更高的流速,離心力和徑向壓力梯度的不平衡致使流道中心處的流體向外流動,為滿足質(zhì)量守恒,靠近外壁面33處的流體將沿著流道上下底面回流,于是在流道截面上產(chǎn)生兩個旋轉(zhuǎn)方向相反的潤31 (Dean流),使得流體中的細(xì)胞受到Dean拽力Fd作用??梢钥闯觯诹鞯澜孛嫔现挥性谖恢芒偬幖?xì)胞所受到的慣性升力Fl和Dean拽力Fd相互抵消達到平衡,因此細(xì)胞將聚焦到靠近螺旋流道內(nèi)壁面32附近。另外,由于慣性升力^和Dean拽力Fd的大小與細(xì)胞尺寸相關(guān),最終造成體積較大的稀有癌細(xì)胞平衡在更靠近流道內(nèi)壁面32 處。
[0018]如圖4所示,突擴結(jié)構(gòu)流道22處細(xì)胞的分選原理:在螺旋流道21的末端,稀有癌細(xì)胞41和血細(xì)胞42因螺旋流道中的慣性升力Fl和Dean拽力Fd作用,穩(wěn)定在各自的平衡位置上。當(dāng)細(xì)胞運動至突擴流道22時,流道的拓寬使得細(xì)胞受到的壁面誘導(dǎo)慣性升力突然減小,細(xì)胞向靠近壁面的方向運動并穩(wěn)定在新的平衡位置,造成稀有癌細(xì)胞41的平衡位置與血細(xì)胞42的平衡位置之間的間距變大。在突擴結(jié)構(gòu)流道22的末端,分叉結(jié)構(gòu)將血細(xì)胞42導(dǎo)入上分支流道23,將稀有細(xì)胞41導(dǎo)入下分支流道24,實現(xiàn)稀有癌細(xì)胞41的分選與聚焦。
[0019]如圖5所示,分離后的稀有癌細(xì)胞41沿下分支流道24進入檢測主流道25,并在檢測區(qū)域進行阻抗測量。在檢測區(qū)域內(nèi),平面金屬電極產(chǎn)生的電場沿著縮進流道251傳播,在檢測主流道25兩側(cè)的壁面上形成一個垂直的等勢面,如同在壁面上存在一對垂直電極,即形成液體電極結(jié)構(gòu)。液體電極的設(shè)計,能夠在得到均勻電場分布的同時,極大簡化金屬微電極的加工。
[0020]如圖6所示,差分高頻阻抗測量電路由信號施加電極261、信號傳感電極262功率放大電路272、I/V轉(zhuǎn)換電路273、高頻鎖相放大器12組成,其中功率放大電路272和I/V轉(zhuǎn)換電路273集成在PCB板114上。功率放大器272由寬帶固定增益放大器THS4303和一系列電阻組成,用于對鎖相放大器產(chǎn)生的激勵信號進行功率放大。ΙΛ轉(zhuǎn)換電路273包括電流電壓轉(zhuǎn)換模塊和差分放大電路,所述的電流電壓轉(zhuǎn)換模塊由寬帶固定增益放大器THS4303和電阻組成,用于將信號傳感電極262得到的電流信號轉(zhuǎn)換成電壓信號,所述的差分放大電路由差分放大器ADA4927和電阻組成,用于對電壓信號進行差分運算。高頻鎖相放大器12產(chǎn)生的高頻交流信號(高達500MHz),通過功率放大器271放大后分成兩路施加到信號施加電極261上,當(dāng)細(xì)胞經(jīng)過液體電極結(jié)構(gòu)時,細(xì)胞引起的電流響應(yīng)信號通過信號傳感電極262傳送至I/V轉(zhuǎn)換電路273依次進行電壓轉(zhuǎn)換和差分運算,并經(jīng)鎖相放大器12處理后傳送至計算機,實現(xiàn)細(xì)胞交流阻抗的差分檢測。采用差分阻抗測量方法,能夠直接獲取細(xì)胞的阻抗信息。得到的細(xì)胞阻抗信息與施加交流信號的頻率相關(guān),在低頻交流信號情況下,細(xì)胞膜的電容性阻礙電流通過,細(xì)胞可看作絕緣體,阻抗的幅值與細(xì)胞體積成比例;而在高頻時,細(xì)胞膜的阻礙作用下降,交流信號可以穿透細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)夜,此時得到的阻抗值反映細(xì)胞的內(nèi)部電學(xué)性能。
[0021]對于阻抗檢測電路獲取的細(xì)胞阻抗信號,在計算機中利用軟件進行降噪、設(shè)別和分析處理,得到電阻抗幅值和相位角等信息,結(jié)合電學(xué)模型完成對細(xì)胞體積和電學(xué)特性的提取,并繪制細(xì)胞性能參數(shù)的散點圖,完成具有實際意義的統(tǒng)計學(xué)分析。
[0022]以上所述,僅 是本發(fā)明的較佳實施例而已,并非對本發(fā)明作任何形式上的限制。對于任何熟悉本【技術(shù)領(lǐng)域】的相關(guān)人員來說,在不脫離本發(fā)明技術(shù)實質(zhì)的前提下,還可以做出若干改進和修飾,這些改進和修飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種集成細(xì)胞分選及檢測的微流控芯片系統(tǒng),該系統(tǒng)包括微流控芯片(11)、高頻鎖相放大器(12)以及處理器(13);所述微流控芯片(11)由流道層(111)、電極層(112)、基底層(113)和PCB板(114)依次對準(zhǔn)封裝而成;其特征在于:所述流道層(111)包括螺旋流道(21)、突擴結(jié)構(gòu)流道(22)、上分支流道(23)、下分支流道(24)、檢測主流道(25)以及兩對縮進流道(251);所述的螺旋流道(21) —端為樣品入口(211)、所述的螺旋流道(21)另一端為突擴結(jié)構(gòu)(22),所述突擴結(jié)構(gòu)(22)具有兩個出口,所述的兩個出口分別與所述的上分支流道(23)和所述的下分支流道(24)連接;所述的下分支流道(24)出口為檢測主流道(25),所述的檢測主流道(25)出口為稀有細(xì)胞出口(252);所述的上分支流道(23)出口為廢液出口(231),所述上分支流道(23)設(shè)置有使廢液出口(231)與稀有細(xì)胞出口(252)之間流體壓力平衡的彎曲結(jié)構(gòu);所述兩對縮進流道(251)對稱分布于檢測主流道(25)的兩側(cè); 所述電極層(112)包括一對信號施加電極(261)和一對信號傳感電極(262),分別與兩對縮進流道(251)相互對準(zhǔn),在檢測主流道(25)的兩側(cè)形成液體電極結(jié)構(gòu); 所述PCB板(114)的集成電路包括電信號輸入接口(271)、功率放大電路(272)、I/V轉(zhuǎn)換電路(273)以及電信號輸出接口(274);所述電信號輸入接口(271)與功率放大電路(272)連接,所述的功率放大電路(272)分成兩路與所述的一對信號施加電極(261)連接;所述I/V轉(zhuǎn)換電路(273)與電信號輸出接口(274)連接,所述的I/V轉(zhuǎn)換電路(273)分成兩路與所述的一對信號傳感電極(262)連接; 所述的高頻鎖相放大器( 12)通過第一輸出端與電信號輸入接口(271)連接,高頻鎖相放大器(12)通過第一輸入端與電信號輸出接口(274)連接;所述高頻鎖相放大器(12)、電信號輸入接口(271)、功率放大電路(272)、信號施加電極(261)依次連接構(gòu)成激勵信號施加電路;所述信號傳感電極(262)、I/V轉(zhuǎn)換電路(273)、電信號輸出接口(274)以及高頻鎖相放大器(12)依次連接構(gòu)成差分阻抗信號傳感電路。 所述的高頻鎖相放大器(12)通過第二輸出端與處理器(13)連接。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的集成細(xì)胞分選及檢測的微流控芯片系統(tǒng),其特征在于:還包括進樣裝置(14)、廢液收集裝置(15)和稀有細(xì)胞收集裝置(16);所述進樣裝置(14)和樣品入口(211)連接;所述廢液收集裝置(15)和廢液出口(231)連接;所述稀有細(xì)胞收集裝置(16)和稀有細(xì)胞出口(252)連接。
【文檔編號】C12M1/34GK103923825SQ201410154420
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年4月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月17日
【發(fā)明者】易紅, 倪中華, 唐文來, 項楠, 黃笛, 顧興中 申請人:東南大學(xué)