一種產(chǎn)異戊二烯基因工程菌及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種產(chǎn)異戊二烯基因工程菌及其應(yīng)用，屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明通過(guò)將含有乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶、3-羥-3甲基戊二酰輔酶A合酶、羥甲基戊二酰輔酶A還原酶、末端烯烴形成脂肪酸脫羧酶和油酸水合酶的基因轉(zhuǎn)化入宿主菌獲得重組菌，并利用重組菌發(fā)酵生產(chǎn)異戊二烯。本發(fā)明所提供的方法大大縮短了大腸桿菌利用外源MVA途徑合成異戊二烯的反應(yīng)過(guò)程，由乙酰輔酶A僅需5步反應(yīng)就可合成異戊二烯，避免了由于過(guò)多外源基因的表達(dá)而導(dǎo)致的對(duì)細(xì)胞自身代謝的影響。同時(shí)，通過(guò)對(duì)發(fā)酵條件的優(yōu)化，發(fā)酵產(chǎn)物異戊二烯的產(chǎn)量可達(dá)39.49μg/L。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種產(chǎn)異戊二烯基因工程菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種產(chǎn)異戊二烯基因工程菌及其應(yīng)用，屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。
技術(shù)背景
[0002]異戊二烯是一種重要的化工平臺(tái)化合物，其95%用于合成橡膠；也是丁基橡膠的第二單體。此外，異戊二烯還廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥、醫(yī)藥、香料及粘結(jié)劑等領(lǐng)域。
[0003]目前，異戊二烯的來(lái)源主要是通過(guò)石油基原料異戊烷、異戊烯脫氫法、化學(xué)合成法(包括異丁烯-甲醛法、乙炔-丙酮法、丙烯二聚法)和裂解C5餾分萃取蒸餾法。然而，隨著化石資源的日益枯竭，原料來(lái)源是利用石油基原料制備異戊二烯的重要瓶頸問(wèn)題。
[0004]生物體中主要存在兩種天然的代謝途徑進(jìn)行異戊二烯的生物合成，即甲羥戊酸(MVA)途徑和甲基赤蘚糖-4-磷酸(MEP)途徑。MVA途徑主要存在于真核生物、古細(xì)菌和高等植物的細(xì)胞液中，而MEP途徑存在于植物的質(zhì)體，細(xì)菌，藻類(lèi)。這兩類(lèi)代謝途徑的最終產(chǎn)物都是形成異戍二烯的前體物質(zhì)二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyl diphosphate,DMAPP)，之后經(jīng)過(guò)異戊二烯合成酶催化DMAPP至異戊二烯。
[0005]利用MVA途徑 和MEP途徑生產(chǎn)異戊二烯的反應(yīng)分別涉及8和9步反應(yīng)，反應(yīng)涉及過(guò)多的基因。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，研究者開(kāi)始探討生物法合成異戊二烯可行性。例如Pia Lindberg等利用藍(lán)藻的MEP途徑進(jìn)行異戊二烯的生產(chǎn)，取得了 50微克/克干細(xì)胞/天的產(chǎn)率(Pia Lindberg等，2009)，但藻類(lèi)生長(zhǎng)緩慢、生物量低下是利用藻類(lèi)制備異戊二烯的瓶頸問(wèn)題。Genencor和Goodyear公司則是將外源的MVA途徑重組入大腸桿菌細(xì)胞中，進(jìn)而利用工程菌發(fā)酵生產(chǎn)異戊二烯(美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)，2009/0203102)。該工程菌中獲得外源MVA途徑時(shí)需要轉(zhuǎn)入多達(dá)8個(gè)異源基因，由于過(guò)多的異源基因表達(dá)可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞自身代謝的紊亂，影響細(xì)胞的正常生長(zhǎng)代謝。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為避免代謝途徑過(guò)長(zhǎng)可能導(dǎo)致的細(xì)胞自身代謝紊亂的問(wèn)題，本發(fā)明提出利用可再生資源葡萄糖為原料，通過(guò)縮短MVA途徑的反應(yīng)步驟，完成生物催化劑的制備，構(gòu)建了具有簡(jiǎn)短的異戊二烯代謝途徑的基因工程菌。本發(fā)明所采取的技術(shù)方案如下:
[0007]—種產(chǎn)異戊二烯的基因工程菌，是在微生物中共表達(dá)乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶、3-羥-3甲基戊二酰輔酶A合酶、羥甲基戊二酰輔酶A還原酶、末端烯烴形成脂肪酸脫羧酶和油酸水合酶的基因得到的重組菌。
[0008]所述基因工程菌的宿主菌是大腸桿菌E.coli BL21 (DE3);所述表達(dá)乙酰輔酶A酰基轉(zhuǎn)移酶和羥甲基戊二酰輔酶A還原酶的基因是乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶/羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因mvaE，GenBank登錄序列號(hào)為AAG02438 ;所述表達(dá)3-羥-3甲基戊二酰輔酶A合酶的基因是3-羥-3甲基戊二酰輔酶A合酶基因mvaS，GenBank登錄序列號(hào)為AAG02439;所述表達(dá)末端烯烴形成脂肪酸脫羧酶的基因是末端烯烴形成脂肪酸脫羧酶基因OleT, GenBank登錄序列號(hào)為ADW41779.1 ;所述表達(dá)油酸水合酶的基因是油酸水合酶基因OhydEM, GenBank 登錄序列號(hào)為 ACT54545.1。
[0009]本發(fā)明還提供了一種利用所述基因工程菌生物合成異戊二烯的方法，是通過(guò)化學(xué)合成或克隆獲得含有乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶/羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因mvaE、3-羥-3甲基戊二酰輔酶A合酶基因mvaS、末端烯烴形成脂肪酸脫羧酶基因OleT和油酸水合酶基因OhydEM，構(gòu)建含有上述基因的重組菌，再利用重組菌發(fā)酵生產(chǎn)異戊二烯。
[0010]具體地，本發(fā)明利用所述基因工程菌生物合成異戊二烯的方法步驟如下:
[0011]I)分別克隆或化學(xué)合成乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶/羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因，3-羥-3甲基戊二酰輔酶A合酶基因，末端烯烴形成脂肪酸脫羧酶基因和油酸水合酶；
[0012]2)將步驟I)所得的基因連接到表達(dá)載體上，獲得重組質(zhì)粒；
[0013]3)將步驟2)所得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主菌，獲得重組菌；
[0014]4)利用步驟3)所得重組菌，發(fā)酵生產(chǎn)異戊二烯。
[0015]所述方法步驟I)中所述乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶/羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因mvaE, GenBank登錄序列號(hào)為AAG02438。
[0016]所述方法步驟I)中所述 3-輕-3甲基戍二酰輔酶A合酶基因mvaS,GenBank登錄序列號(hào)為AAG02439。
[0017]所述方法步驟I)中所述末端烯烴形成脂肪酸脫羧酶基因OleT，GenBank登錄序列號(hào)為 ADW41779.1。
[0018]所述方法步驟I)中所述油酸水合酶基因OhydEM, GenBank登錄序列號(hào)為ACT54545.1。
[0019]所述利用基因工程菌生物合成異戊二烯的方法的具體步驟如下:
[0020]I)分別化學(xué)合成乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶/羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因mvaE，3-羥-3甲基戊二酰輔酶A合酶基因mvaS，末端烯烴形成脂肪酸脫羧酶基因OleT和油酸水合酶OhydEM，并分別與載體pGH連接；
[0021]2)將步驟I)所得的含有基因mvaE和基因mvaS的pGH載體與pACYDuet-Ι載體重組后獲得重組質(zhì)粒pACY-mvaE-mvaS ;將步驟I)所得的含有基因OleT和基因OhydEM的pGH載體與pCOLADuet-Ι載體重組后獲得重組質(zhì)粒pC0LA-01eT_0hydEM ；
[0022]3)將步驟2)中所得的重組質(zhì)粒pACY-mvaE-mvaS和pC0LA-01eT-0hydEM轉(zhuǎn)化入大腸桿菌E.coli BL21(DE3)中，獲得重組菌；
[0023]4)利用步驟3)所得重組菌發(fā)酵生產(chǎn)異戊二烯。
[0024]在本發(fā)明的另一方面，提供了本發(fā)明的基因工程菌在生產(chǎn)異戊二烯中的應(yīng)用。
[0025]本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，為在重組細(xì)胞中更好地表達(dá)，上述各種酶的基因序列或由其衍生的編碼具有相同或相似的功能的蛋白的核酸序列可以根據(jù)所用的宿主細(xì)胞的密碼子偏好性進(jìn)行密碼子優(yōu)化。
[0026]本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)該理解，上述各種酶的基因序列或由其衍生的編碼具有相同或相似的功能的蛋白的核酸序列可以按照常規(guī)分子克隆技術(shù)克隆到宿主細(xì)胞中。另外，這些核苷酸片段還可以與適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)控制元件(例如，啟動(dòng)子，增強(qiáng)子等)可操作地連接。這些都在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。這些核苷酸片段可操作性連接可以借助于接頭也可以不用接頭，這可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行適當(dāng)?shù)倪x擇。
[0027]本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)該理解，在選擇適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞構(gòu)建好能夠從乙酰輔酶A合成α-或β_菔烯的重組細(xì)胞后，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)技術(shù)常識(shí)或經(jīng)過(guò)有限次實(shí)驗(yàn)確定合適的培養(yǎng)條件(例如，發(fā)酵培養(yǎng)的溫度、攪拌速度、PH值、溶氧率、發(fā)酵時(shí)間等參數(shù))，也能夠選擇合適的誘導(dǎo)劑，確定加入誘導(dǎo)劑的時(shí)機(jī)，等等。
[0028]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明所提供的方法大大縮短了大腸桿菌外源MVA途徑的反應(yīng)過(guò)程，以乙酰輔酶A作為原料合成異戊二烯只需要5步反應(yīng)，僅涉及5種酶，避免了由于過(guò)多外源基因的表達(dá)而導(dǎo)致的對(duì)細(xì)胞自身代謝的影響，最終在大腸桿菌中構(gòu)建生物基異戊二烯合成途徑。提供的生物合成異戊二烯新方法大大縮短了工程大腸桿菌利用外源途徑合成異戊二烯的反應(yīng)過(guò)程，具有重要的社會(huì)意義和有益效果。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0029]圖1是利用乙酰輔酶A生物合成異戊二烯代謝途徑示意圖。
[0030]圖2是pFHR-Ι質(zhì)粒圖譜。
[0031]圖3是pFHR-2質(zhì)粒圖譜。
[0032]圖4是pFHR-3質(zhì)粒圖譜。
[0033]圖5是異戊二烯標(biāo)準(zhǔn)品與發(fā)酵產(chǎn)物異戊二烯的GC-MS分析圖譜。
[0034]圖6顯示IPTG濃度對(duì)工程菌產(chǎn)異戊二烯的影響。 [0035]圖7顯示誘導(dǎo)溫度對(duì)工程菌產(chǎn)異戊二烯的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0036]下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明不受實(shí)施例的限制。
[0037]通過(guò)在大腸桿菌中共同表達(dá)來(lái)源于糞腸球菌(Enterococcus faecalis)的乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶基因/羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因(mvaE，SEQ ID N0.1)，3-羥-3-甲基戊二酰輔酶 A 合酶基因(mvaS，SEQ ID N0.2);來(lái)源于 Jeotgalicoccus sp.ATCC8456的末端烯烴形成脂肪酸脫羧酶基因(01eT，SEQ ID N0.3)和來(lái)源于腦膜炎膿毒性黃桿菌(Elizabethkingiameningoseptica)的油酸水合酶基因(OhydEM, SEQ ID N0.4),利用葡萄糖降解中間產(chǎn)物乙酰輔酶A生物合成異戊二烯，縮短了異戊二烯的代謝途徑(圖1)。
[0038]實(shí)施例1外源基因的克隆和表達(dá)載體的構(gòu)建
[0039]1.外源基因的克隆
[0040]1.1糞腸球菌MVA上游代謝途徑基因的克隆
[0041]來(lái)自于幾腸球菌(Enterococcusfaecalis)的mvaS 基因(GenBank N0.AAG02439),mvaE基因(GenBank N0.AAG02438)由上海捷瑞公司通過(guò)化學(xué)合成方法獲得。之后分別與載體pGH (購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司)連接獲得pGH/mvaS，pGH/mvaE。
[0042]1.201 eT, OhydEM 基因的克隆
[0043]來(lái)自于Jeotgalicoccus sp.ATCC8456 的 OleT 基因(GenBank N0.ADW41779.1),Elizabethkingia meningoseptica 的 OhydEM基因(GenBank N0.ACT54545.1)由上海捷瑞公司進(jìn)行化學(xué)合成，分別連入PGH載體上分別形成pGH/OleT，pGH/OhydEM載體。
[0044]2表達(dá)載體的構(gòu)建
[0045]2.1pFHR-1 載體構(gòu)建
[0046]將pGH-OleT 與 pCOLADuet-Ι 載體(Novagen)分別用 BamH I 和 Sac I 進(jìn)行雙酶切，載體與外源片段按摩爾比1:5的比例，4°C連接過(guò)夜或16°C連接4~6h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5a，然后涂布加有50mg.mL—1卡那霉素的LB固體平板，PCR篩選陽(yáng)性克隆，從陽(yáng)性克隆中提取重組質(zhì)粒pFHR-1 (pCOLA-OleT,圖2)后，再通過(guò)限制性酶切和測(cè)序鑒定。
[0047]2.2pFHR-2 載體構(gòu)建
[0048]將pCOLA-OleT (pFHR-1)與 pGH-OhydEM 載體分別用 BglII 和 NdeI 進(jìn)行雙酶切，載體與外源片段按摩爾比1:5的比例，4°C連接過(guò)夜或16°C連接4~6h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5 a，然后涂布加有50mg.mL—1卡那霉素的LB固體平板，PCR篩選陽(yáng)性克隆，從陽(yáng)性克隆中提取重組質(zhì)粒pFHR-2(pC0LA-01eT-0hydEM，圖3)后，再通過(guò)限制性酶切和測(cè)序鑒定。
[0049]2.3pFHR-3 載體構(gòu)建
[0050]將pACY-mvaE-mvaS-1spSPa 載體(pYJM20,實(shí)驗(yàn)室保存)與 pACYDuet-Ι 載體分別用NcoI和PstI進(jìn)行雙酶切,載體pACYDuet-Ι與外源片段mvaE-mvaS按摩爾比1:5的比例,4°C連接過(guò)夜或16°C連接4~6h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5 α，然后涂布加有34 μ g -mol-1氯霉素的LB固體平板，PCR篩選陽(yáng)性克隆，從陽(yáng)性克隆中提取重組質(zhì)粒pYJM3 (pACY-mvaE-mvaS,圖4)后，再通過(guò)限制性酶切和測(cè)序鑒定。
[0051]實(shí)施例2重組菌株的構(gòu)建和發(fā)酵培養(yǎng) [0052]將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)搖瓶發(fā)酵對(duì)重組菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)和氣相色譜(GC)分別對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行定性和定量的檢測(cè)。
[0053]2.1E.coli重組菌株的構(gòu)建
[0054]將pFHR-2 (pC0LA-01eT-0hydEM)和 pFHR-3 (pACY-mvaE-mvaS)重組質(zhì)粒共同熱擊轉(zhuǎn)化E.coli BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂布于加有氯霉素和卡那霉素的LB固體平板，通過(guò)PCR篩選獲得陽(yáng)性克隆，由此獲得含有pFHR-2和pFHR-3的工程大腸桿菌。
[0055]2.2工程大腸桿菌的培養(yǎng)
[0056]將活化后的工程大腸桿菌按1:100的比例接種到含有氯霉素和卡那霉素的LB液體培養(yǎng)液中，37°C，180rpm條件下振蕩培養(yǎng)，當(dāng)OD6tltol為0.6-0.8時(shí)，在菌液中加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度0.5mmol噸'然后轉(zhuǎn)入在30°C，180rpm條件下，繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)工程菌株誘導(dǎo)24h后，取頂空氣體1ml，利用GC-MS定性檢測(cè)。
[0057]GC-MS 檢測(cè)條件=GC-MS 儀器型號(hào)=Thermo GC Trace ITQl 110 ;分離柱型號(hào):HP-1NN0Wax30m*0.25mm*0.25um ;離子源:EI ;進(jìn)樣量:0.2ml ;檢測(cè)器:ICR ;柱溫:40°C 保溫5min,然后以20°C /min的速度升溫至75°C,保溫lmin,然后再以20°C /min的速度升至245°C，保溫 5min。
[0058]GC-MS檢測(cè)結(jié)果如圖5所示，該結(jié)果表明:發(fā)酵產(chǎn)物與異戊二烯標(biāo)準(zhǔn)品氣相色譜出峰時(shí)間及質(zhì)譜特征一致，從而確定發(fā)酵產(chǎn)物為異戊二烯。
[0059]實(shí)施例3不同發(fā)酵條件對(duì)重組菌產(chǎn)量的影響
[0060]不同的發(fā)酵條件，如誘導(dǎo)溫度，轉(zhuǎn)速，誘導(dǎo)劑濃度，氮源，底物濃度，培養(yǎng)基pH值及成分配比等，會(huì)影響發(fā)酵產(chǎn)物異戊二烯的產(chǎn)量。本發(fā)明檢測(cè)了不同的誘導(dǎo)溫度，誘導(dǎo)劑濃度對(duì)異戊二烯產(chǎn)量的影響。培養(yǎng)方法同實(shí)施例2，利用GC對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行定量。
[0061 ] GC檢測(cè)條件:GC系統(tǒng)采用山東魯南瑞虹SP-6890型氣相色譜儀，色譜柱為HP-1NNOffAX column (25mX250 μ mX 0.2 μ m)，檢測(cè)器為 FID檢測(cè)器；氣化室溫度 200°C，檢測(cè)器溫度230°C，載氣流速:lml/min。柱溫:50°C恒溫。
[0062]3.1E.coli重組菌株的構(gòu)建
[0063]將pFHR-2 (pCOLA-OleT-OhydEM)和 pFHR-3 (pACY-mvaE-mvaS)重組質(zhì)粒共同熱擊RKE.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂布于加有氯霉素和卡那霉素抗生素的LB固體平板，通過(guò)PCR篩選獲得陽(yáng)性克隆，由此獲得含有pFHR-2和pFHR-3的工程大腸桿菌。
[0064]3.2研究不同IPTG (異丙基-β -D-硫代半乳糖苷)濃度對(duì)異戊二烯產(chǎn)量的影響
[0065]挑取單克隆于5ml LB小瓶中培養(yǎng)活化過(guò)夜，按I %接種于10ml含有Cm+Kan抗生素的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)4h，當(dāng)OD6tltlnm = 0.6-0.8左右，加入不同濃度IPTG(0.125mM,0.25mM,0.5mM,0.75mM, ImM, 1.125mM, 1.25mM)在 30°C 條件下進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。培養(yǎng)48h后取Iml頂空氣體進(jìn)行GC測(cè)定。檢測(cè)結(jié)果如圖6所示，結(jié)果表明:IPTG濃度為ImM時(shí)，異戊二烯產(chǎn)量最高，為35.43 μ g/L。
[0066]3.3研究不同誘導(dǎo)溫度對(duì)異戊二烯產(chǎn)量的影響
[0067]挑取單克隆于5ml LB小瓶中培養(yǎng)活化過(guò)夜，按I %接種于10ml含有Cm+Kan抗生素的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，37°C，180rpm條件下振蕩培養(yǎng)，當(dāng)OD6tltol為0.6-0.8時(shí)，在菌液中加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度Immol噸―1，然后轉(zhuǎn)入不同溫度下(25°C，28°C，30°C，34°C，37°C )進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。培養(yǎng)48h后取Iml頂空氣體進(jìn)行GC測(cè)定。檢測(cè)結(jié)果如圖7所示，結(jié)果表明:誘導(dǎo)溫度為37°C時(shí)，異戊二烯產(chǎn)量最高，為39.49 μ g/L。 [0068]應(yīng)該理解，盡管參考其示例性的實(shí)施方案，已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體地顯示和描述，但是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該理解，在不背離由權(quán)利要求書(shū)所定義的本發(fā)明的精神和范圍的條件下，可以在其中進(jìn)行各種形式和細(xì)節(jié)的變化，可以進(jìn)行各種實(shí)施方案的任意組合。
【權(quán)利要求】
1.一種產(chǎn)異戊二烯的基因工程菌，其特征在于，是在微生物中共表達(dá)乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶、3-羥-3甲基戊二酰輔酶A合酶、羥甲基戊二酰輔酶A還原酶、末端烯烴形成脂肪酸脫羧酶和油酸水合酶的基因得到的重組菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述基因工程菌，其特征在于，所述重組菌的宿主菌為大腸桿菌E.coli BL2KDE3);所述表達(dá)乙酰輔酶A酰基轉(zhuǎn)移酶和羥甲基戊二酰輔酶A還原酶的基因是乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶/羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因mvaE，GenBank登錄序列號(hào)為AAG02438 ;所述表達(dá)3-羥-3甲基戊二酰輔酶A合酶的基因是3-羥-3甲基戊二酰輔酶A合酶基因mvaS，GenBank登錄序列號(hào)為AAG02439 ;所述表達(dá)末端烯烴形成脂肪酸脫羧酶的基因是末端烯烴形成脂肪酸脫羧酶基因OleT，GenBank登錄序列號(hào)為ADW41779.1 ;所述表達(dá)油酸水合酶的基因是油酸水合酶基因OhydEM，GenBank登錄序列號(hào)為ACT54545.1。
3.一種利用權(quán)利要求1所述基因工程菌生物合成異戊二烯的方法，其特征在于，通過(guò)化學(xué)合成或克隆獲得含有乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶/羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因mvaE、3-羥-3甲基戊二酰輔酶A合酶基因mvaS、末端烯烴形成脂肪酸脫羧酶基因OleT和油酸水合酶基因OhydEM，構(gòu)建含有上述基因的重組菌，再利用重組菌發(fā)酵生產(chǎn)異戊二烯。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述方法，其特征在于，步驟如下: O分別克隆或化學(xué)合成乙酰輔酶A酰基轉(zhuǎn)移酶/羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因，3-羥-3甲基戊二酰輔酶A合酶基因，末端烯烴形成脂肪酸脫羧酶基因和油酸水合酶； 2)將步驟I)所得的基因連接到表達(dá)載體上，獲得重組質(zhì)粒； 3)將步驟2)所得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主菌，獲得重組菌； 4)利用步驟3)所得重組菌，發(fā)酵生產(chǎn)異戊二烯。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述方法，其特征在于，步驟I)中所述乙酰輔酶A酰基轉(zhuǎn)移酶/羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因mvaE，GenBank登錄序列號(hào)為AAG02438。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述方法，其特征在于，步驟I)中所述3-羥-3甲基戊二酰輔酶A合酶基因mvaS, GenBank登陸序列號(hào)為AAG02439。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述方法，其特征在于，步驟I)中所述末端烯烴形成脂肪酸脫羧酶基因OleT，登錄序列號(hào)為ADW41779.1。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述方法，其特征在于，步驟I)中所述油酸水合酶基因OhydEM，登陸序列號(hào)為ACT54545.1。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述方法，其特征在于，具體步驟如下: O分別化學(xué)合成乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶/羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因mvaE，3-羥-3甲基戊二酰輔酶A合酶基因mvaS，末端烯烴形成脂肪酸脫羧酶基因OleT和油酸水合酶OhydEM，并分別與載體pGH連接； 2)將步驟I)所得的含有基因mvaE和基因mvaS的pGH載體與pACYDuet-Ι載體重組后獲得重組質(zhì)粒pACY-mvaE-mvaS ;將步驟I)所得的含有基因OleT和基因OhydEM的pGH載體與pCOLADuet-Ι載體重組后獲得重組質(zhì)粒pC0LA-01eT_0hydEM ； 3)將步驟2)中所得的重組質(zhì)粒pACY-mvaE-mvaS和pC0LA-01eT_0hydEM轉(zhuǎn)化入大腸桿菌E.coli BL21(DE3)中，獲得重組菌； 4)利用步驟3)所得重組菌發(fā)酵生產(chǎn)異戊二烯。
10.權(quán)利要求1或2的基因工程菌在生產(chǎn)異戊二烯中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N1/21GK104031872SQ201410152878
【公開(kāi)日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2014年4月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月16日
【發(fā)明者】咸漠, 楊建明, 鄒慧斌, 馮紅茹 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所