一組用于水禽細(xì)小病毒可視化鑒別診斷的熒光定量引物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一組用于鵝細(xì)小病毒和番鴨細(xì)小病毒感染情況的可視化檢測的實時熒光定量PCR引物的方法，該方法是利用該引物擴(kuò)增的GPV和MDPV特異基因片段區(qū)域核苷酸GC含量的差異導(dǎo)致溶解曲線溫度的差異來對GPV和MDPV感染情況進(jìn)行檢測，該方法僅需一組基于SYBRGreenⅠ實時熒光定量PCR引物結(jié)合反應(yīng)結(jié)束后自動生成的溶解曲線即可特異性的對GPV和MDPV感染情況進(jìn)行可視化鑒別診斷。本發(fā)明鑒定方法簡單，效率和準(zhǔn)確率較高。
【專利說明】—組用于水禽細(xì)小病毒可視化鑒別診斷的熒光定量引物
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于動物分子病原學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一組用于水禽細(xì)小病毒可視化鑒別診斷的熒光定量引物。
【背景技術(shù)】
[0002]鵝細(xì)小病毒(Goose parvovirus,GPV)是感染禽類的主要自主復(fù)制型細(xì)小病毒，由我國學(xué)者方定一于1956年首先在江蘇省揚州地區(qū)發(fā)現(xiàn)(方定一.小鵝瘟的介紹[J].中國獸醫(yī)學(xué)雜志，1962，8:19-20.]，以后在許多國家也分離到該病毒，世界禽類學(xué)會為紀(jì)念匈牙利學(xué)者Derzsy的先進(jìn)工作而將此病命名為Derzsy’s病(萬春和,朱海俠,黃瑜,等.一株鵝細(xì)小病毒全基因特征分析[J].中國動物傳染病學(xué)報，2011，1，9 (4):19-24.)0
[0003]鵝細(xì)小病毒屬于細(xì)小病毒科、細(xì)小病毒屬，只有一個血清型。該病主要侵害30d以內(nèi)的雛鵝和雛番鴨，引起以急性腸炎及肝、腎、心等實質(zhì)臟器敗血性病變，尤其是小腸部位的纖維性、栓塞性病變，是目前危害養(yǎng)鵝業(yè)健康發(fā)展的最嚴(yán)重的傳染病之一，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，引起國內(nèi)外學(xué)者的廣泛重視。
[0004]番鴨細(xì)小病毒病又叫“三周病”，是由番細(xì)小病毒(Muscovy duck parvovirus,MDPV)引起的一種急性、敗血性傳染病，其特點是具有高度傳染性和死亡率。主要發(fā)生于3周齡以內(nèi)的雛番鴨，病變的主要特征是腸道嚴(yán)重發(fā)炎，腸黏膜壞死，脫落，腸管腫膿、出血。本病可造成雛番鴨大批死亡，即使耐過也成僵鴨。
[0005]目前，關(guān)于鵝細(xì) 小病毒和番鴨細(xì)小病毒病原學(xué)檢測的實時突光定量PCR方法均有相關(guān)報道。其中關(guān)于鵝細(xì)小病毒和番鴨細(xì)小病毒病原學(xué)檢測的實時熒光定量PCR方法都是根據(jù)鵝細(xì)小病毒和番鴨細(xì)小病毒基因組特征分別設(shè)計引物，分別進(jìn)行實時熒光定量PCR來進(jìn)行診斷。
[0006]鵝細(xì)小病毒對雛鵝和雛番鴨均易感，在臨床上對番鴨感染細(xì)小病毒的檢測時，由于鵝細(xì)小病毒和番鴨細(xì)小病毒基因組NS基因同源性較高，PCR實驗結(jié)果可能會造成假陽性擴(kuò)增。目前，對GPV和MDPV感染情況用實時熒光定量PCR方法需分別進(jìn)行實時熒光定量PCR反應(yīng)，成本較高。
[0007]目前，國內(nèi)外還沒有僅需一組實時熒光定量PCR引物同時對GPV和MDPV感染情況進(jìn)行可視化鑒別診斷的相關(guān)研究報道，本發(fā)明的建立可填補國內(nèi)外相關(guān)領(lǐng)域空白。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提供一組用于水禽細(xì)小病毒可視化鑒別診斷的熒光定量引物及其檢測方法，該方法能有效區(qū)分鵝細(xì)小病毒(GPV)和番鴨細(xì)小病毒(MDPV)感染(或共感染)，為番鴨健康養(yǎng)殖提供技術(shù)保證。
[0009]本發(fā)明根據(jù)鵝細(xì)小病毒和番鴨細(xì)小病毒基因組中NS基因特征，設(shè)計一組實時熒光定量PCR引物，該引物針對鵝細(xì)小病毒和番鴨細(xì)小病毒進(jìn)行PCR擴(kuò)增可得到特異性目的條帶，用常規(guī)PCR無法對GPV和MDPV感染情況進(jìn)行鑒別診斷，對其擴(kuò)增的GPV和MDPV基因在該區(qū)域存在有GC含量差異，通過建立基于SYBRGreen I實時熒光定量PCR對GPV和MDPV反應(yīng)后的溶解曲線存在不同的特異峰，根據(jù)溶解曲線的特異峰的差異可直接對GPV和MDPV感染情況進(jìn)行可視化觀察。
[0010]本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
一組用于水禽細(xì)小病毒可視化鑒別診斷的熒光定量引物，所述PCR引物Pl和P2的序列為:上游引物 Pl:5，- TTCTTTGCTGCTCTGTTGGAAATA -3，，
下游引物 P2:5’ - GCTTTTACCAATATGCC -3’。
[0011]通過所述引物建立基于SYBR Green I實時熒光定量PCR方法，根據(jù)利用該引物擴(kuò)增的鵝細(xì)小病毒(GPV)和番鴨細(xì)小病毒(MDPV)特異基因片段區(qū)域核苷酸GC含量的差異導(dǎo)致溶解曲線溫度Tm值的差異，根據(jù)溶解曲線Tm值的差異可直接對GPV和MDPV感染進(jìn)行定量檢測。
[0012]具體包括以下步驟:
(1)提取鵝細(xì)小病毒GPV和番鴨細(xì)小病毒MDPV基因組DNA；
(2)用所述實時熒光定量引物Pl和P2同時對GPV和MDPV進(jìn)行基于SYBRGreen I實時熒光定量PCR檢測，反應(yīng)完成后作出溶解曲線；
(3)實時熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)溶解曲線特異性峰值的差異直接對鵝細(xì)小病毒和番鴨細(xì)小病毒感染情況進(jìn)行可視化檢測。
[0013]所述PCR引物在檢測鵝細(xì)小病毒和番鴨細(xì)小病毒感染情況方面的應(yīng)用。
[0014]其中，實時熒光定量PCR引物需滿足如下要求:
(I)該實時熒光定量PCR引物是選擇GPV和MDPV非結(jié)構(gòu)蛋白NS中的保守區(qū)域進(jìn)行設(shè)計，該引物進(jìn)行常規(guī)PCR時，均可對GPV和MDPV進(jìn)行擴(kuò)增，但擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物用常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳無法區(qū)別。
[0015](2))該實時熒光定量PCR引物能一組實時熒光定量PCR反應(yīng)能對鵝細(xì)小病毒基因組DNA和番鴨細(xì)小病毒基因組DNA均能陽性擴(kuò)增，通過生成的溶解曲線獲得特異性峰。
[0016](3)該實時熒光定量PCR引物需選擇能對GPV和MDPV進(jìn)行實時熒光定量PCR陽性擴(kuò)增，但是實時熒光定量PCR引物針對的GPV和MDPV在該擴(kuò)增區(qū)域的基因片段存在有GC含量差異。由于GPV和MDPV在該擴(kuò)增區(qū)域的基因片段存在有GC含量差異導(dǎo)致進(jìn)行實時熒光定量PCR進(jìn)行擴(kuò)增后，生成的溶解曲線Tm值不同而存在有各自特異峰，可通過和實時熒光定量PCR儀器連接的電腦直接對GPV和MDPV感染情況進(jìn)行可視化觀察。
[0017]其中，所述的步驟(3)的峰值如下:
若在Tm= (86.17±0.06) °C出現(xiàn)單一的特異性峰判為GPV陽性；若在Tm=(84.27±0.06) °C出現(xiàn)單一的特異性峰判為MDPV陽性；若在Tm= (86.17±0.06)。。和Tm=(84.27±0.06) V均出現(xiàn)特異性峰判為GPV和MDPV陽性。
[0018]本發(fā)明的有益效果:鑒定方法簡單，效率和準(zhǔn)確率較高。使用本研究提供的一組實時熒光定量PCR引物對本臨床送檢5份疑似水禽細(xì)小病毒(GPV和MDPV)感染情況進(jìn)行可視化鑒別診斷的方法，其中G PV3株，MDPV 2株，其中1份樣品還存在有GPV和MDPV共感染。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1特異性實時熒光定量PCR引物對GPV和MDPV進(jìn)行檢測的溶解曲線。I為GPV陽性，2為MDPV陽性，3為GPV和MDPV陽性，4為GPV和MDPV陰性。
【具體實施方式】
[0020]下面實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的描述。
[0021]實施例1
1、毒株:
鵝細(xì)小病毒和番鴨細(xì)小病毒均由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所分離鑒定和保存。
[0022]2、引物設(shè)計與合成
根據(jù)GPV和MDPV非結(jié)構(gòu)蛋白基因特征設(shè)計實時熒光定量PCR引物Pl和P2，其中引物Pl和P2序列為:
上游引物 Pl:5’ - TTCTTTGCTGCTCTGTTGGAAATA -3’，
下游引物 P2:5’ - GCTTTTACCAATATGCC -3’。
[0023]3、實時熒光定量PCR擴(kuò)增 以常規(guī)方法提取GPV和MDPV基因組DNA。用所設(shè)計的特異性實時熒光定量PCR引物Pl和P2進(jìn)行實時熒光定量PCR擴(kuò)增。
[0024]優(yōu)化出的20 μ L最佳反應(yīng)體系為體系:SYBR Premix Ex Taq? 10 μ L、上、下游引物(10 ymol/L)各0.2 yL、模板2 μ L、水補足至20 μ L0最佳反應(yīng)條件為:95 °C,2min預(yù)變性；95 V 10 s，60 V 15 s，共40個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后，做出溶解曲線。
[0025]4、實時熒光定量PCR溶解曲線
實時熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)做出的溶解曲線，直接在和實時熒光定量PCR儀器連接的電腦上直接分析溶解曲線，對GPV和MDPV感染情況進(jìn)行判斷，判斷方法為:
從生成的溶解曲線可見看出，若在Tm= (86.17±0.06) °〇出現(xiàn)單一的特異性峰判為GPV陽性；若在Tm= (84.27±0.06) °C出現(xiàn)單一的特異性峰判為MDPV陽性；若在Tm=(86.17±0.06)。。和Tm= (84.27±0.06) °C均出現(xiàn)特異性峰判為GPV和MDPV陽性。
[0026]5、臨床應(yīng)用
使用本發(fā)明提供的引物方法對臨床送檢5份疑似水禽細(xì)小病毒(GPV和MDPV)感染情況進(jìn)行可視化鑒別診斷的方法，其中鵝細(xì)小病毒3株，番鴨細(xì)小病毒2株，其中1份樣品還存在鵝細(xì)小病毒和番鴨細(xì)小病毒共感染。本發(fā)明通過的方法用一組實時熒光定量PCR引物即可確定感染的水禽細(xì)小病毒類型，同時還能對GPV和MDPV感染類型和感染情況進(jìn)行準(zhǔn)確分析。
[0027]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【權(quán)利要求】
1.一組用于水禽細(xì)小病毒可視化鑒別診斷的熒光定量引物，其特征在于:所述PCR引物Pl和P2的序列為:上游引物Pl:5，- TTCTTTGCTGCTCTGTTGGAAATA _3’，下游引物P2:5’ - GCTTTTACCAATATGCC -3’。
2.一種如權(quán)利要求1所述的一組用于水禽細(xì)小病毒可視化鑒別診斷的熒光定量引物的檢測方法，其特征在于:通過所述引物建立基于SYBR Green I實時熒光定量PCR方法，根據(jù)利用該引物擴(kuò)增的鵝細(xì)小病毒和番鴨細(xì)小病毒特異基因片段區(qū)域核苷酸GC含量的差異導(dǎo)致溶解曲線溫度的差異，根據(jù)溶解曲線Tm值的差異可直接對鵝細(xì)小病毒和番鴨細(xì)小病毒感染進(jìn)行檢測。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種如權(quán)利要求1所述的一組用于水禽細(xì)小病毒可視化鑒別診斷的熒光定量引物的檢測方法，其特征在于:具體包括以下步驟: (1)提取鵝細(xì)小病毒和番鴨細(xì)小病毒基因組DNA； (2)用所述實時熒光定量引物Pl和P2同時對鵝細(xì)小病毒和番鴨細(xì)小病毒進(jìn)行基于SYBR Green I實時熒光定量PCR檢測，反應(yīng)完成后作出溶解曲線； (3)實時熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)溶解曲線特異性峰值Tm值的差異直接對鵝細(xì)小病毒和番鴨細(xì)小病毒感染情況進(jìn)行可視化檢測。
4.一種如權(quán)利要求1所述的一組用于水禽細(xì)小病毒可視化鑒別診斷的熒光定量引物在檢測鵝細(xì)小病毒和番鴨細(xì) 小病毒感染情況方面的應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/68GK103882153SQ201410134004
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年4月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月4日
【發(fā)明者】萬春和, 黃瑜, 陳紅梅, 施少華, 傅秋玲, 傅光華, 程龍飛 申請人:福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所