一種用于預(yù)防病毒性心肌炎的重組病毒及其疫苗和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明一種重組病毒，以水皰型口炎病毒為載體，在水皰型口炎病毒的囊膜糖蛋白G和聚合酶蛋白L之間插入編碼抗原CVB3結(jié)構(gòu)蛋白VP1基因。本發(fā)明還提供了上述重組病毒的制備方法，由pP、pL、pXN2-VP1、pVSVG和pN五質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK21細胞獲得。本發(fā)明還提供了一種疫苗，含有有效量的上述的重組病毒。本發(fā)明的疫苗可以以滴鼻、口服或經(jīng)生殖道方式實施粘膜部位接種，能解決現(xiàn)有技術(shù)中常規(guī)疫苗無法有效誘導(dǎo)高強度的粘膜免疫應(yīng)答，抗原不能在粘膜局部有效停留、不足以被APC提的技術(shù)問題。本發(fā)明的重組病毒可有效增強CVB3特異性血清和粘膜局部抗體應(yīng)答，明顯加強全身及腸道粘膜局部特異性CD8T細胞殺傷能力。
【專利說明】一種用于預(yù)防病毒性心肌炎的重組病毒及其疫苗和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明涉及生物基因技術(shù)，尤其涉及一種重組病毒，特別是一種用于預(yù)防病毒性心肌炎的重組病毒及其疫苗和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]病毒性心肌炎主要由B3型柯薩奇病毒(CVB3)感染所致，青壯年發(fā)病較高，可導(dǎo)致約50%的人類急性及慢性心肌炎和25%擴張性心肌病的發(fā)生，是一常見、多發(fā)的心血管系統(tǒng)疾病。目前尚無有效的預(yù)防或治療疫苗。CVB3屬于腸道病毒，通過呼吸道、胃腸道入侵機體后，由于機體粘膜免疫(如腸道IgA)不能在感染早期及時清除病毒，使病毒迅速擴散入血、進而侵犯心臟，導(dǎo)致病毒性心肌炎；CVB3的持續(xù)性感染還可能導(dǎo)致擴展性心肌病的發(fā)生，致死率極高，危害嚴重。當(dāng)前導(dǎo)致嚴重感染性疾病的病原體如人類免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒、嚴重急性呼吸綜合征病毒(SARS-CoV)等均通過粘膜表面(生殖道、呼吸道、胃腸道)入侵和感染機體，由于機體不能誘導(dǎo)有效的粘膜免疫應(yīng)答清除粘膜感染病原體，使病原體迅速擴散入血、進而侵犯全身，造成機體損傷；同時發(fā)展為慢性感染，導(dǎo)致慢性疾病的行成。
[0003]對于以上經(jīng)粘膜感染病原體，如能誘導(dǎo)粘膜局部(鼻咽、胃腸道)的特異性粘膜免疫應(yīng)答，特別是特異性的SIgA的形成和分泌，則可能在感染初期有效中和病毒，避免病毒入血而后感染全身器官，從而有效的阻止病毒性心肌炎的發(fā)生。因此研制出有效誘導(dǎo)SIgA分泌的粘膜疫苗迫在眉睫。
[0004]已知常規(guī)疫苗如滅活、蛋白疫苗、DNA疫苗、亞單位疫苗等，經(jīng)常規(guī)途徑免疫(肌肉注射、皮下等)通常不能誘導(dǎo)特異性粘膜免疫應(yīng)答。無論疫苗的形式是什么，要誘導(dǎo)粘膜免疫應(yīng)答通常需要將靶抗原從粘 膜部位接種，才能被粘膜中APC攝取并提呈，激活粘膜免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)粘膜免疫應(yīng)答。
[0005]已知的粘膜接種抗原的瓶頸在于:粘膜局部纖毛的頻繁物理擺動可迅速清除外來抗原；粘膜局部存在大量酸性溶液，富含水解酶、DNA酶等，可迅速降解外來抗原。因此粘膜部位接種抗原由于被迅速清除和降解，不能在粘膜局部有效停留，使不足以被APC提呈，不能誘導(dǎo)有效的粘膜免疫應(yīng)答。即使誘導(dǎo)，其應(yīng)答程度非常低下。
[0006]水皰型口炎病毒(VSV)能感染多種動物和昆蟲。家畜中自然感染VSV的有馬、牛(羊)、豬，而人群中自然狀態(tài)下幾乎不存在水皰型口炎病毒主動感染，對人的感染不會引起很明顯的病癥，因此將水皰型口炎病毒作為病毒載體疫苗是有潛在的可行性的。水皰型口炎病毒病毒內(nèi)部為緊密盤旋的螺旋對稱的核衣殼，VSV基因組為不分節(jié)段的線性單股負鏈RNA，長約llkb。從3’ 一5’端依次排列著N、NS (P)、M、G、L等5個不重疊的基因，分別編碼核(N)蛋白、磷酸(P)蛋白、基質(zhì)(M)蛋白、糖(G)蛋白、及RNA聚合酶(L)蛋白等5種不同的主要蛋白。其中核蛋白(N)和糖蛋白(G)在病毒免疫具有重要的意義。N基因編碼的病毒核蛋白(N蛋白)，它可有效的保護病毒RNA免受各種核酸酶的消化。N基因編碼的N蛋白呈群特異性，為許多型和亞型所共有，有高的抗原性，且在轉(zhuǎn)錄復(fù)制中擔(dān)任了重要的角色。進入細胞的VSV的N蛋白作為優(yōu)勢抗原被V SV特異性CTL細胞識別，誘導(dǎo)CTL發(fā)揮作用，參與免疫反應(yīng)。因此VSV作為病毒載體攜帶靶抗原，會增強機體的免疫應(yīng)答強度，采取的粘膜部位接種免疫方式則會誘導(dǎo)機體產(chǎn)生更強的特異性黏膜免疫應(yīng)答。

【發(fā)明內(nèi)容】
:
[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種用于預(yù)防病毒性心肌炎的重組病毒及其疫苗和應(yīng)用，所述的這一種用于預(yù)防病毒性心肌炎的重組病毒及其疫苗和應(yīng)用解決了現(xiàn)有技術(shù)中的疫苗對B3型柯薩奇病毒(CVB3)感染所致病毒性心肌炎效果不好的技術(shù)問題。
[0008]本發(fā)明為一種重組病毒，以水皰型口炎病毒為載體，在所述的水皰型口炎病毒的囊膜糖蛋白G和聚合酶蛋白L之間插入編碼抗原CVB3結(jié)構(gòu)蛋白VPl基因。
[0009]進一步的，所述的編碼靶抗原CVB3結(jié)構(gòu)蛋白VPl基因的序列如SEQ ID N0:1所
/Jn ο
[0010]進一步的，所述的CVB3結(jié)構(gòu)蛋白來源于CVB3Nancy株。
[0011 ] 進一步的，所述的水皰型口炎病毒來源于水皰型口炎病毒印第安納株。
[0012]進一步的，上述的重組病毒通過反向遺傳重組質(zhì)粒在BHK21細胞中包裝出重組的水皰型口炎病毒。
[0013]本發(fā)明還提供了上述的一種重組病毒的制備方法，通過如下方法制備:
[0014](I)選擇靶抗原CVB3結(jié)構(gòu)蛋白VPl基因，以質(zhì)粒pXN2為載體，在所述的pXN2載體中插入編碼靶抗原CVB3結(jié)構(gòu)蛋白VPl基因，得到重組質(zhì)粒PXN2-VPl。
`[0015](2)在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)BHK細胞，待細胞長滿40~70%的時候，收集BHK細胞；
[0016](3)用痘病毒在無血清DMEM培養(yǎng)基中與BHK細胞共孵育，然后用脂質(zhì)體將水皰型口炎病毒的反向遺傳重組質(zhì)粒PXN2-VPl、pP、pL、pN、和pVSVG的五質(zhì)粒系統(tǒng)轉(zhuǎn)染到BHK細胞中，36-60h后收集細胞上清，過濾膜后高速離心，所述的離心濃縮后的病毒分裝溶解在PBS中備用。
[0017]上述的pP、pL、pN、pVSVG質(zhì)粒系統(tǒng)的具體構(gòu)建方法參照文獻Proc Natl Acad SciUSA.1995;92:4477-81，構(gòu)建的方法為本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。
[0018]具體來說pP包含了水皰型口炎病毒印第安納株磷酸蛋白，pL含了 RNA聚合酶蛋白、PN包含了病毒核衣殼蛋白、pVSVG包含了病毒糖蛋白、pXN2質(zhì)粒包含了全長基因組核酸，在BHK細胞中同時轉(zhuǎn)染這5個質(zhì)粒，通過擴增純化，可以得到野生型的水皰型口炎病毒。在本發(fā)明中，我們構(gòu)建了重組質(zhì)粒PXN2-VP1，在BHK21通過共轉(zhuǎn)染pP、pL、pN、pVSVG和PXN2-VP15個質(zhì)粒，在T7RNA聚合酶的作用下，質(zhì)粒pL、pVSVG、pN、pP和pXN2_VPl轉(zhuǎn)錄翻譯形成聚合酶蛋白、糖蛋白、核蛋白、磷蛋白，和正鏈病毒核酸，其中聚合酶蛋白、核蛋白和磷蛋白可以形成核蛋白轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，把正鏈病毒核酸轉(zhuǎn)錄形成副鏈病毒基因組，在病毒裝配過程中，副鏈病毒基因組、核蛋白轉(zhuǎn)錄復(fù)合物被包裹進核蛋白形成的病毒顆粒里，同時病毒表面出膜獲得雙層膜結(jié)構(gòu)和糖蛋白，形成新的子代感染性病毒顆粒VSV-VPl。
[0019]進一步的,過濾膜后22000~28000rpm高速離心。
[0020]具體的，在VeroE6細胞中得到單一的重組病毒，擴大培養(yǎng)，濃縮病毒，得到純化單一的重組的水皰型口炎病毒。
[0021]本發(fā)明還提供了一種疫苗，含有有效量的上述的一種重組病毒。
[0022]本發(fā)明還提供了上述的一種重組病毒或者上述的疫苗在制備預(yù)防病毒性心肌炎藥物中的應(yīng)用。
[0023]本發(fā)明還提供了一種粘膜疫苗的免疫方法:
[0024]I)采取滴鼻或口服的方式免疫小鼠；
[0025]2)只需I次免疫；
[0026]3)免疫劑量為25ul的IO6Pfu的重組水皰型口炎病毒。
[0027]本發(fā)明的疫苗可以以滴鼻、口服或經(jīng)生殖道方式實施粘膜部位接種，能解決現(xiàn)有技術(shù)中常規(guī)疫苗無法有效誘導(dǎo)高強度的粘膜免疫應(yīng)答，抗原不能在粘膜局部有效停留、不足以被APC提等技術(shù)問題。
[0028]本發(fā)明選擇活病毒作為載體，攜帶特異性靶抗原基因，利用水皰型口炎病毒在細胞中的復(fù)制能力，高效快速的表達靶抗原，趨引T細胞到達疫苗給予的粘膜部位、促進CD8+T細胞應(yīng)答等性質(zhì)，來增強特異性粘膜免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)。由于病毒本身的特異性，會引起很強的固有免疫應(yīng)答，激活機體的免疫系統(tǒng)，類似于佐劑的作用，隨著病毒被免疫系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)識別以及清除的過程中，病毒攜帶的靶抗原會充分被發(fā)現(xiàn)，區(qū)別于普通疫苗的抗原不穩(wěn)定，易被降解，本發(fā)明的病毒載體的靶抗原會隨著病毒的復(fù)制大量表達在胞漿中，充分被遞呈給免疫細胞，引起機體的特異性免疫應(yīng)答，由于采取的是粘膜部位接種疫苗，因此會誘導(dǎo)很強的局部黏膜免疫應(yīng)答。
[0029]本發(fā)明的重組的水皰型口炎病毒可用于多種經(jīng)粘膜感染病原體的預(yù)防或治療性疫苗的粘膜遞送。本發(fā)明的疫苗滴鼻或口服免疫小鼠，可有效誘導(dǎo)針對CVB3的特異性粘膜SIgA和全身IgG的產(chǎn)生，能否更好的預(yù)防病毒性心肌炎的發(fā)生。
[0030]本發(fā)明和已有技術(shù)相比較，其效果是積極和明顯的。本發(fā)明的重組水皰型口炎病毒經(jīng)鼻粘膜進行粘膜免疫，證實可有效`增強B3型柯薩奇病毒特異性血清和粘膜局部抗體應(yīng)答，能有效的誘導(dǎo)全身和粘膜部位的SlgA抗體和T細胞應(yīng)答，明顯加強全身及腸道粘膜局部特異性CD8T細胞殺傷能力，顯著提高免疫小鼠抵御病毒感染的能力，具備作為新型粘膜疫苗的應(yīng)用價值和潛力。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0031]圖1是VSV-VPl重組病毒反向遺傳重組質(zhì)粒構(gòu)建示意圖。
[0032]圖2是重組的VSV-VPl病毒靶抗原以及VSV-G囊膜蛋白的免疫印跡檢測示意圖；A顯示了重組的VSV-VPl病毒的構(gòu)建示意圖，B顯示了 VSV-VPl感染BHK細胞后表達產(chǎn)物的western Blot鑒定；C顯示了重組的VSV-VPl病毒感染BHK細胞的免疫熒光照片。
[0033]圖3顯示了 VSV-VPl病毒疫苗滴鼻免疫誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的CVB3特異性血清IgG和糞便特異性IgA水平(A、B);血清特異性IgG抗體滴度和糞便特異性IgA抗體滴度(C、D)。
[0034]圖4顯示了 VSV-VPl病毒疫苗滴鼻免疫誘導(dǎo)小鼠誘生的CVB3特異性脾臟和腸系膜淋巴T細胞增殖能力(A、B),以及誘生的CVB3特異性脾臟和腸系膜淋巴T細胞CTL殺傷能力(C、D)。
[0035]圖5顯示了 VSV-VPl病毒疫苗滴鼻免疫小鼠產(chǎn)生的免疫保護作用。末次免疫后2周，以3LD50劑量的CVB3腹腔感染小鼠。顯示第7天血清血清肌酶(CK)水平(A);顯示第7天血清肌酶同功酶(CK-MB)水平(B);顯示感染第7天體重下降水平(C);顯示小鼠14天內(nèi)的生存率曲線(D);顯示第7天小鼠心臟病理改變情況(E)。[0036]圖6顯示了 VSV-VPl病毒疫苗滴鼻免疫可顯著降低感染小鼠心臟和胰腺中病毒的滴度。
[0037]圖1是水皰型口炎病毒的結(jié)構(gòu)示意圖。
【具體實施方式】
[0038]以下是本發(fā)明的具體實施例，所述的實施例是用于描述本發(fā)明的使用和用途，而不是限制本發(fā)明。
[0039]實施例中采用的質(zhì)粒、菌種、細胞、動物及試劑如下:
[0040]B3型柯薩奇病毒Nancy株(復(fù)旦大學(xué)中山醫(yī)院衛(wèi)生部病毒性心肌炎重點實驗室提供)。質(zhì)粒 pXN2, pP, pL, pN 和 pVSVG 來自 Dr.John Rose, Yale university,該實驗室免費提供。宿主細菌DH5 a、BL21 (Invitrogen公司)。BHK21和VeroE6由本實驗室保存?；蚝铣晌猩虾Ｙ惏偈⒐尽RP標(biāo)記羊抗小鼠IgG多克隆抗體，HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgA多克隆抗體(SouthernBiotech公司)。限制性核酸內(nèi)切酶XhoI和NheI (TaKaRa公司)、T4DNA連接酶(TaKaRa) ；Taq DNA聚合酶(Promega 公司)；dNTP (Promega) ;LB 培養(yǎng)基(英國 OXOID公司)，瓊脂粉、瓊脂糖、EB (上?；瘜W(xué)試劑采購供應(yīng)站)，Tris (USB公司)，瓊脂糖膠回收試劑盒(上海華舜公司)，大量質(zhì)粒抽提試劑盒(Qiagen),乳酸脫氫酶LDH試劑盒購自Roche。6-8周齡雄性BALB/c (H-2d)小鼠購自上海斯萊克實驗動物中心，清潔級飼養(yǎng)。動物飼養(yǎng)及操作符合國家相關(guān)規(guī)定。
[0041]實施例1 Hela細胞培養(yǎng)及CVB3病毒傳代:
[0042]本發(fā)明的人宮頸癌 細胞系Hela細胞按常規(guī)方法培養(yǎng)，以含10%NBS、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素和硫酸卡那霉素的RPM1-1640培養(yǎng)基在37°C、5%C02條件下培養(yǎng)，隔天傳代。以IOOul CVB3病毒凍存液感染約5 X IO6Hela細胞，培養(yǎng)40hr后80%細胞被復(fù)制病毒裂解，將液體及細胞碎片以3000rpm/min離心20min，所得上清即新鮮CVB3懸液。
[0043]實施例2 CVB3病毒的LD5tl (半數(shù)致死量)滴定:
[0044]取出生48h的BALB/c乳鼠，分為8組，每組6只小鼠，將新鮮制備的CVB3懸液以10倍遞次稀釋法依次稀釋為10—1、10_2、10_3、ΙΟ'ΙΟ—5、10_6、10_7、10_8，分別取100 μ I經(jīng)腹腔注射8組乳鼠，逐日觀察乳鼠存活情況，按病毒學(xué)常規(guī)方法計算該批次CVB3病毒的LD5tl效價。距離比例=(>50%的死亡百分數(shù)一 50) / 050%的死亡百分數(shù)一〈50%的死亡百分數(shù))LD50 = >50%的死亡率稀釋度的對數(shù)(Log) +距離比例
[0045]本試驗中同一批次內(nèi)CVB3的LD5tl效價為l(T5 5/100ul。
[0046]實施例3重組VSV病毒的構(gòu)建及體外表達功能鑒定
[0047]I靶抗原質(zhì)粒pXN2-VPl構(gòu)建:以CVB3結(jié)構(gòu)蛋白VPl為靶抗原構(gòu)建了以pXN2為載體的pXN2-VPl質(zhì)粒。其中，VPIcDNA序列根據(jù)文獻(Klump WM, et al.JVirol, 1990,64(4): 1573-1583)，具體如 SEQ ID NO:1 所示。
[0048]I)從新鮮培養(yǎng)的CVB3 (Nancy株)中經(jīng)RT-PCR獲得CVB3VP1基因。
[0049]設(shè)計VPl 上下游引物:KVl:5' -CCCAAGCTTGCCACCATGGGCCCAGTG GAAGACGCG-3'；KV2:5' -CGGGATCCTTACTAAAATGCGCCCGTA TTTGT C-3 '。按上海華舜生物公司 RNAexReagent&System Kit 提取病毒 RNA，CVB3 總 RNA 以 20 μ IDEPC H2O 溶解，_80°C保存。
[0050]cDNA 逆轉(zhuǎn)錄按上海生工生物公司 2_N First Strand cDNA Synthesis Kit 進行:總體積 20μ 1，5μ I 病毒 RNA，加 1μ I Oligo dT、6ul DEPC 水，70°C 5min ;于 4°C 加緩沖液 4 μ 1、dNTP2 μ 1、Rnase 抑制劑 I μ I, 37°C 5min，加 MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶 I μ 1,37°C 60min,70 V IOmin,得cDNA，-20 °C保存。特異引物PCR擴增:總體積25 μ 1，水13.3ul、10XPCR2.5μ l、50mmol/L MgCl2L 5 μ 1、2.5mmol/L dNTP0.5 μ 1、IOpmol/μ I KV-1/KV-2引物各 0.5 μ 1、TaqDNA 聚合酶 IU、cDNA 模板 5 μ I。反應(yīng)條件:94 °C 5min,94°C lmin,58°C 2min, 72°C 2min，35 循環(huán)，72°C IOmin0 得 VPl 基因。
[0051]3)膠回收經(jīng)RT-PCR所得VPl基因:電泳瓊脂糖內(nèi)RT-PCR產(chǎn)物以Golden BeadsDNA Gel Purification Kit 純化回收，每 IOmg 膠加 400 μ I Solution S 液、20 μ I GoldenBeads, 65°C IOmin ; 12000rpm 離心 lmin,去上清，加 500 μ I Wash Solution, 12000rpm 離心lmin,去上清，50°C 5min ;以 20 μ I Elution Buffer 洗脫，37°C 2min, 12000rpm 離心 lmin,上清含回收VPlDNA和Ltn DNA。
[0052]4)回收VPlDNA 以 Xho1、NheI 雙酶切:總體積 20 μ 1，Η2013μ 1,10ΧΗ buffer2 μ 1，DNA5y I, XhoI,NheI 各 1U，37°C 2hr，走 1.0%瓊脂糖電泳，割膠經(jīng) Golden Beads 回收 VPl 雙酶切產(chǎn)物；同理將pXN2質(zhì)粒以Xho1、NheI雙酶切，酶切產(chǎn)物回收、定量。
[0053]5)VP1酶切片段與pXN2酶切載體連接:按摩爾比3:1連接，總體積10 μ 1，10X連接酶 Bufferl μ 1，pcDNA3.1 雙酶切產(chǎn)物 3 μ 1，VPl 酶切產(chǎn)物 5ul，Ligase 酶 lul，4°C過夜，轉(zhuǎn)化DH5a，篩陽性單克隆。
[0054]6)質(zhì)粒pXN2-VPl鑒定:分別經(jīng)PCR、酶切和DNA測序來鑒定。PCR鑒定:以T7-1/T7-2、T7-l/KV-2 以及 T7-2/KV-1 為正反向引物鑒定 VPl 插入；以 T7-1/Ltn_2、T7-2/Ltn_l鑒定Ltn插入；以Xho1、NheI雙酶切pXN2_VPl，以Xho1、NheI雙酶切pXN2_VPl。由上海Invitrogen DNA測序服務(wù)中心進行DNA測序鑒定。
[0055]7) pXN2-VPl的鑒定:pXN2_VPl經(jīng)Xho1、NheI雙酶切可切出877bp條帶。鑒定結(jié)果表明，VPl基因被有效構(gòu)建`于VSV病毒包裝載體中。
[0056]8)如圖1所示，VSV-VPl重組病毒的包裝:首先在IOcm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)BHK細胞，待細胞長滿50%，用IOul痘病毒(MOI=IO)在無血清DMEM培養(yǎng)基中與BHK細胞共孵育2h，用痘病毒感染BHK (10cm dish)細胞，然后用脂質(zhì)體2000將水皰型口炎病毒的反向遺傳重組質(zhì)粒 PXN2-VPl (IOug), pP (5ug), pL (lug), pN (3ug)和 pVSVG(2ug)的五質(zhì)粒系統(tǒng)轉(zhuǎn)染到 BHK細胞中，48h后收集細胞上清，過0.22um的濾膜后25000rpm高速離心，所述的離心濃縮后的重組的VSV-VPl病毒分裝溶解在IOOul PBS中，用TCID50的方法測定病毒載量后，將剩余的病毒保存于_80°C冰箱。
[0057]9)如圖2所示，將重組的VSV-VPl感染新鮮的BHK細胞6h后，收集細胞樣品，經(jīng)SDS-PAGE分離蛋白表達產(chǎn)物，轉(zhuǎn)膜，然后以抗VPl和抗VSV-G囊膜蛋白特異性抗體孵育并顯色，結(jié)果顯示:VP1可在體外有效表達，表達產(chǎn)物VPl約為34KD，VSV-G約為55KD。
[0058]實施例4新型病毒疫苗VSV-VPl滴鼻免疫可誘導(dǎo)CVB3全身和粘膜特異性抗體應(yīng)答
[0059]I)小鼠滴鼻免疫方法及血清、糞便收集
[0060]以水皰型口炎病毒作為病毒載體預(yù)防病毒性心肌炎的粘膜疫苗，將6-8周BALB/c雄性小鼠分為3組，滴鼻免疫，分別為=VSV-VP 1、VSV-GFP、PBS (對照組)，每組6只小鼠。滴鼻免疫程序如下:以0.75%戊巴比妥鈉80-120 μ I經(jīng)腹腔注射小鼠，使小鼠輕微麻醉。以含有VSV-VPl的PBS病毒疫苗溶液逐滴滴入小鼠兩側(cè)鼻腔，其它兩組采取相同的操作方法。每兩周經(jīng)眼眶后目此靜脈采血，37°C靜置30min,6000rpm離心10min,收集血清，分裝凍存于-70°C。同時，收集小鼠糞便標(biāo)本，以100mg/ml濃度溶解于PBS溶液中(5%脫脂牛奶、IOmM Leupeptin、I μ g/ml aprotinin、ImM PMSF),充分混旋后離心收集上清凍存 _70°C。
[0061]2) CVB3特異性血清IgG和腸道SIgA的ELISA檢測:
[0062]ELISA 方法:以 10ug/ml CVB4VP1237 ~249 多肽、包被液(0.1M Na2CO3, pH9.6、
0.1%BSA)4°C包板；以5%milk-PBS封閉；依次加1:40稀釋血清及糞便原液、HRP-羊抗小鼠IgG, IgA, OPD,顯色中止，測 0D49(lnm。
[0063]VSV-VPl免疫組在免疫2周后即誘生了較高水平的特異性IgG，第4周OD值達
0.88，且隨時間推移IgG水平逐漸降低，IgG抗體效價在第4周時高達3500。而單獨的空病毒VSV-GFP不能誘生血清IgG，第4周IgG效價約為200，明顯低于前者。更為重要的是:VSV-VP1有效的誘生了粘膜SIgA的分泌，第2周OD值高達1.1，而單獨VSV-GFP組為
0.35 ;結(jié)果顯示VSV-VPl病毒疫苗經(jīng)滴鼻免疫不僅可誘生高水平血清IgG，還能增強腸道局部SIgA的產(chǎn)生(如圖3所示)。
[0064]實施例5以水皰型口炎病毒作為載體預(yù)防病毒性心肌炎的疫苗滴鼻免疫可誘導(dǎo)脾臟和腸系膜淋巴結(jié)T細胞的特異性增殖和CTL殺傷
[0065]I)小鼠脾臟和腸系膜淋巴結(jié)T細胞增殖功能檢測
[0066]小鼠脾臟和腸系膜淋巴結(jié)T細胞增殖功能使用Roche Brdu cell proliferationELSA試劑盒進行檢測，方法如下:取末次免疫后2周，各組小鼠脾臟及腸系膜淋巴結(jié)(MLN)細胞，制備無紅細胞的淋巴細胞懸液，調(diào)整濃度為4X106/ml，加入96孔板，100 μ I/孔，以終濃度為20 μ g/ml的VPl蛋白為刺激物，以1640作為空白對照，培養(yǎng)72h后加入Brdulabeling solution, 0.1 μ I/孔，24h 后收集細胞,固定后加入 ant1-Brdu-PODI μ I/孔,PBS洗滌后，TMB室溫顯色lOmin，2N H2S04終止，測0D450nm值。
[0067]結(jié)果顯示:與VSV-GFP免疫組相比，VSV-VPl免疫組脾臟細胞對VP1237_249產(chǎn)生了很強烈的增殖反應(yīng)(圖4A，P〈0.05)。不僅如此，其誘導(dǎo)的腸系膜淋巴結(jié)局部特異性T細胞也顯著強于對照組(圖4B，0D值0.75vs0.25)，提示該粘膜疫苗滴鼻免疫可顯著增強全身和遠端粘膜局部的特異性T細胞增殖反應(yīng)。
[0068]2)小鼠脾臟和腸系膜淋巴結(jié)T細胞CTL功能檢測
[0069]以滅活的CVB3刺激培養(yǎng)24h的SP2/0細胞作為靶細胞，制備方法如下:靶細胞按100 μ 1/1 X IO4/孔加入96孔U底板。末次免疫后2周，以3LD50CVB3腹腔感染小鼠，4d后取小鼠脾臟和腸系膜淋巴結(jié)細胞，調(diào)整濃度為5X106/ml。以該濃度為起始(即效靶比50:1)在板外作倍比稀釋，依次為2.5 XlO6M (25:1)、1.25 X 106/ml (12.5:1)，各按100 μ I/孔加入96孔板中，加樣均為三復(fù)孔。LDH釋放對照組的設(shè)計(每組均設(shè)3個復(fù)孔):
(I)培養(yǎng)液對照組:單純無血清1640培養(yǎng)液200 μ I/孔；(2)LDH低釋放組:靶細胞100 μ I/孔+無血清1640培養(yǎng)液100 μ I/孔；(3) LDH高釋放組:靶細胞100 μ I/孔+細胞裂解液(2%TritonX-100溶液)100 μ I/孔；(4)效應(yīng)細胞對照組:分別為效應(yīng)細胞5X IO5/孔，
2.5 X IO5/孔，1.25 X IO5/孔+培養(yǎng)液100 μ I/孔。將已加入細胞的96孔板置37°C，體積分數(shù)5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。培養(yǎng)結(jié)束后將培養(yǎng)板以250g速度離心10min。每孔取100 μ I細胞培養(yǎng)上清液，加入96孔平底細胞培養(yǎng)板中，于每孔中加入100 μ I LDH反應(yīng)液(Roche)，室溫避光放置30min。將細胞板置于酶標(biāo)儀中檢測492nm的吸光度(A)值。特異性CTL活性的
[0070]計算方法:CTL細胞毒相對活性=[(A效靶細胞混合一 A效應(yīng)細胞對照一 A低釋放對照)/ (A高釋放對照一 A低釋放對照)]X 100%。
[0071]結(jié)果顯示，效靶比為50:1時，VSV-VPl組脾臟和腸系膜淋巴結(jié)T細胞特異性殺傷率達50%和55%，遠高于VSV-GFP組(圖4C和D)，提示VSV-VPl病毒疫苗有效誘生了較強的CVB3特異性全身和粘膜局部T細胞CTL應(yīng)答，有效的抵抗了 CVB3感染。
[0072]實施例6新型病毒疫苗VSV-VPl滴鼻免疫可顯著減輕CVB3感染小鼠誘導(dǎo)的病毒性心肌炎病情
[0073]I) CVB3感染后免疫小鼠體重和心肌損傷血清學(xué)指標(biāo)變化情況
[0074]末次免疫后2周，以誘導(dǎo)小鼠心肌炎的病毒劑量(3LD50CVB3)腹腔感染小鼠，稱取第O天和第7天體重改變，初步評估心肌炎嚴重程度。結(jié)果顯示:感染初期，各組小鼠體重基本相同，但至第7天，對照組小鼠體重下降最為顯著，而VSV-VPl組均重為27.5g，顯著高于其他組(圖5C)。此外，于感染第7天取血清，于生化分析儀Modular P800上檢測肌酸激酶CK和肌酸激酶同工酶CK-MB水平。結(jié)果顯示:與其他組相比，VSV-VPl組血清CK和CK-MB水平較低(圖5A5B)，提示其心肌損傷程度最輕。末次免疫后2周，以致死劑量的CVB3(3LD50)腹腔感染小鼠，觀察小鼠在14天內(nèi)的存活率，與其他組相比，VSV-VPl免疫組小鼠存活率高達70% (圖OT)，上述結(jié)果提示VSV-VPl滴鼻免疫可提供高效的預(yù)防心肌炎的免疫保護效果。
[0075]2) CVB3感染后免疫小鼠心肌病理改變
[0076]末次免疫后2周，以誘導(dǎo)心肌炎病毒劑量(3LD50)腹腔感染小鼠，于第7天取心臟行石蠟切片和HE染色，具體方法如下:將心臟在PBS中洗凈，4%多聚甲醛固定24小時、脫水、石蠟包埋后切片，行HE染色`，染色步驟:二甲苯I (IOmin) —二甲苯II (IOmin) —100% I的乙醇中(2min) —100% II的乙醇中(2min) — 95%的乙醇中(2min) — 90%的乙醇中(2min) —80%的乙醇中(2min) —自來水缸中浸泡5min—蘇木素染核7min—水洗(2min) 一 1%的鹽酸酒精分化(5s)—水洗一弱氨水返藍一水洗一鏡下觀察一伊紅染胞質(zhì)(20s) 一水稍洗一80%的乙醇(3s) —95%的乙醇I (3s) — 95%的乙醇II (3s) —100% I的乙醇中(5s) —100% II的乙醇中(5s) —二甲苯I (5min) —二甲苯II(5min) —中性樹膠封片。隨后于顯微鏡下觀察拍照。
[0077]結(jié)果顯示:對照組心室內(nèi)外壁均出現(xiàn)大量嚴重的灶性壞死，大量心肌細胞被破壞，而代之以成團的炎性淋巴細胞浸潤，心肌壞死損傷比較嚴重；VSV-VP1組免疫組心肌損傷較輕，部分小鼠心肌除有細胞濁腫現(xiàn)象和少量的淋巴細胞浸潤，無明顯異常，近似于正常心肌細胞(圖5E)。結(jié)果提示=VSV-VPl新型疫苗滴鼻免疫可有效預(yù)防病毒性心肌炎的發(fā)生。
[0078]實施例7新型病毒疫苗VSV-VPl滴鼻免疫可顯著減輕CVB3感染小鼠心臟病毒載量
[0079]末次免疫后2周，以誘導(dǎo)心肌炎病毒劑量(3LD50的CVB3)腹腔感染小鼠，于第7天取心臟，勻漿后取上清，在Hela細胞中測定病毒的TCID50 (50%細胞培養(yǎng)物感染劑量)來確定器官中CVB3病毒載量，具體方法如下:病毒滴度測定前一天，鋪2 X IO4/孔的Hela細胞入96孔板中作為被感染細胞。剪取3LD50CVB3攻擊后7天小鼠心臟或胰腺組織，稱重后重懸于完全培養(yǎng)基中。組織反復(fù)凍融后，勻漿離心取上清并作10倍倍比稀釋。取各稀釋度上清接種于各孔Hela細胞表面，每一稀釋度接種一縱排共8孔，每孔接種100 μ I。逐日觀察并記錄結(jié)果，一般需要觀察5-7天。按Reed-Muench兩氏法計算結(jié)果。
[0080]結(jié)果顯示:與對照組和VSV-GFP組相比，VSV-VPl組心臟和胰腺組織病毒載量顯著降低(如圖6所示)，提示該疫苗滴鼻免疫后機體可有效清除體內(nèi)病毒，顯著降低病毒性心肌炎的病情。`
【權(quán)利要求】
1.一種重組病毒，其特征在于:以水皰型口炎病毒為載體，在所述的水皰型口炎病毒的囊膜糖蛋白G和聚合酶蛋白L之間插入編碼抗原CVB3結(jié)構(gòu)蛋白VPl基因。
2.如權(quán)利要求1所述的一種重組病毒，其特征在于:所述的編碼靶抗原CVB3結(jié)構(gòu)蛋白VPl基因的序列如SEQ ID NO:1所示。
3.如權(quán)利要求1所述的一種重組病毒，其特征在于:所述CVB3結(jié)構(gòu)蛋白來源于CVB3Nancy 株。
4.如權(quán)利要求1所述的一種重組病毒，其特征在于:所述的水皰型口炎病毒來源于水皰型口炎病毒印第安納株。
5.如權(quán)利要求1所述的一種重組病毒，其特征在于:通過反向遺傳重組質(zhì)粒在BHK21細胞中包裝出重組的水皰型口炎病毒。
6.權(quán)利要求1所述的一種重組病毒的制備方法，其特征在于通過如下方法制備: (1)選擇靶抗原CVB3結(jié)構(gòu)蛋白VPl基因，以質(zhì)粒pXN2為載體，在所述的pXN2載體中插入編碼靶抗原CVB3結(jié)構(gòu)蛋白VPl基因，得到質(zhì)粒PXN2-VPl ； (2)在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)BHK細胞，待細胞長滿40-70%的時候，收集BHK細胞； (3)用含有Τ7RNA聚合酶的痘病毒在無血清DMEM培養(yǎng)基中與BHK細胞共孵育，然后用脂質(zhì)體將水皰型口炎病毒的反向遺傳重組質(zhì)粒pXN2-VPl、pP、pL、pN、和pVSVG的五質(zhì)粒系統(tǒng)轉(zhuǎn)染到BHK細胞中，36-60h后收集細胞上清，過濾膜后高速離心，所述的離心濃縮后的病毒分裝溶解在PBS中備用。
7.一種疫苗，其特征在于:含有有效量的權(quán)利要求1所述的重組病毒。
8.權(quán)利 要求1所述的重組病毒或者權(quán)利要求7所述的疫苗在制備預(yù)防病毒性心肌炎藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/86GK103865890SQ201410125958
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年3月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月27日
【發(fā)明者】熊思東, 董春升, 徐薇, 吳飛 申請人:蘇州大學(xué)