一種哺乳動(dòng)物血液基因組dna提取試劑盒及提取哺乳動(dòng)物血液基因組dna的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種哺乳動(dòng)物血液基因組DNA提取試劑盒，由以下成分組成：紅細(xì)胞裂解液、白細(xì)胞裂解液、蛋白沉淀液和DNA沉淀液。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下技術(shù)效果：1）不采用有機(jī)試劑，環(huán)保，對(duì)人體也無(wú)不良影響。2）可獲得較高濃度和純度的DNA，保留大片段DNA。3）采用“一步去除法”，操作簡(jiǎn)單，適用人群的范圍廣。4）操作時(shí)間短，可在短時(shí)間內(nèi)獲得實(shí)驗(yàn)所需要的DNA樣品，大大提高了實(shí)驗(yàn)的效率。5）成本較低，價(jià)格低廉。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種晡乳動(dòng)物血液基因組DNA提取試劑盒及提取晡乳動(dòng)物血液基因組DNA的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種哺乳動(dòng)物血液基因組DNA提取試劑盒及提取哺乳動(dòng)物血液基因組DNA的方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]DNA提取是分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)技術(shù)，目前已經(jīng)發(fā)展了多種從血樣中提取DNA的方法。在血液中含有大量的蛋白質(zhì)及鹽類(lèi)，其性質(zhì)與核酸的物理性質(zhì)非常相似。在血樣DNA提取過(guò)程中處理不當(dāng)極易與DNA共同沉淀下來(lái)，并且難以分離，這將大大影響血樣DNA的提取質(zhì)量。
[0003]為降低或清除蛋白質(zhì)及鹽類(lèi)對(duì)血樣DNA提取的影響，現(xiàn)有的血樣提取DNA過(guò)程中常常采用有機(jī)試劑，并需要多步操作，以盡可能地去除蛋白質(zhì)及鹽類(lèi)。
[0004]普遍采用的方法為:
I)采用酚、氯仿抽提法來(lái)去除蛋白質(zhì)和鹽，通過(guò)多次抽提來(lái)提高提取的DNA樣品的質(zhì)量。苯酚、氯仿提取DNA是利用苯酚作為蛋白質(zhì)的變性劑，反復(fù)抽提去除蛋白質(zhì)。此方法可有效分離DNA和蛋白質(zhì)，但使用的有機(jī)試劑揮發(fā)性大，對(duì)人體有較大的毒害性，且耗時(shí)長(zhǎng)、導(dǎo)致DNA降解的可能性也相應(yīng)增加。步驟也相對(duì)繁雜，所需要的操作技能較高。
[0005]2)使用SDS并配合使用純化柱的方法進(jìn)行血液DNA的提取。此方法提取時(shí)間短，但因采用純化柱吸附，得到的DNA量較少。
[0006]在此方面，目前已公開(kāi)報(bào)道的提取血液DNA的方法，主要步驟為在血樣中加入細(xì)胞洗滌液，離心分離后得到殘留細(xì)胞團(tuán)，加入SDS、醋酸銨、鹽酸胍、蛋白酶K置于60°C水浴15~30分鐘，然后經(jīng)純化柱充分結(jié)合DNA，離心取沉淀物加入硅膠膜洗滌液洗滌兩次，離心后加入TE緩沖液，最后得到含DNA的保存液。實(shí)驗(yàn)采用了純化柱吸附的方法，能有效地增加提取的DNA濃度，保障最大程度地回收樣品中的DNA。但此方法并不能保證DNA的純度，可能會(huì)對(duì)后期的PCR等實(shí)驗(yàn)造成不可預(yù)估的影響。
[0007]3)利用SDS、蛋白質(zhì)和K離子形成蛋白質(zhì)的沉淀，并進(jìn)行去除，從而得到DNA樣品。這種方法主要用于提取質(zhì)粒，即所稱(chēng)的堿裂法。但該方法得出的DNA純度也較低。
[0008]4 )通過(guò)磁珠吸附DNA后，在磁場(chǎng)的作用下，DNA-磁珠復(fù)合體吸附至管底或管壁，除去上清液，再對(duì)DNA-磁珠復(fù)合體進(jìn)行洗脫，來(lái)獲得純化的DNA溶液。
[0009]在此方面，目前已公開(kāi)報(bào)道的磁珠法提取DNA的方法:主要通過(guò)菌體重懸、裂解、中和、磁珠結(jié)合、洗滌、洗脫幾個(gè)步驟獲得DNA。這種方法簡(jiǎn)單有效地提取出了 DNA。但在實(shí)際操作中操作時(shí)，需要多次的重懸，因此操作步驟較多、時(shí)間也較長(zhǎng)。
[0010]5)通過(guò)將核酸吸附于玻璃粒子或二氧化硅粒子從而達(dá)到分離和純化DNA的目的。
[0011]在此方面，目前已公開(kāi)報(bào)道的基于二氧化硅磁性微粒的超低量DNA提取的方法。利用表面具有小尺寸的納米級(jí)突起的二氧化硅磁性復(fù)合微粒，高效實(shí)現(xiàn)超低量DNA的提取。然而，采用此純化方法同樣需要多次重懸操作，以致時(shí)間較長(zhǎng)。
[0012]同時(shí)，已公開(kāi)專(zhuān)利中涉及的其它一些DNA提取方法，其得率、質(zhì)量均不理想。為此，本發(fā)明公開(kāi)了一種哺乳動(dòng)物血液基因組DNA提取試劑盒及提取哺乳動(dòng)物血液基因組DNA的方法。
[0013]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種哺乳動(dòng)物血液基因組DNA提取試劑盒及提取哺乳動(dòng)物血液基因組DNA的方法。
[0015]本發(fā)明的哺乳動(dòng)物血液基因組DNA提取試劑盒，由以下成分組成:紅細(xì)胞裂解液、白細(xì)胞裂解液、蛋白沉淀液和DNA沉淀液，
其中，所述的紅細(xì)胞裂解液的組成成分及各成分終濃度如下=Tris 10mM-150mM, NH4Cl100mM-300mM, EDTA 二鈉鹽(分子式為:CltlH14N2Na2O8CH2O) 5mM-100mM ；pH 為 7.6-8.0 ；
所述的白細(xì)胞裂解液的組成成分及各成分終濃度如下:Tris 10mM-150mM, EDTA 二鈉鹽(分子式為:C10H14N2Na2O8.2H20)5mM-1OOmM, 0.1%-2% (w/v)的 SDS，蛋白酶 K (0.5_4)g/L，PH 為 7.6-8.0 ；
所述的蛋白沉淀液為NaCl、CaCl2, NH4Cl和MgCl2中的一種或幾種，終濃度濃度為5-6M ；
所述的DNA沉淀液的組成成分及各成分終濃度如下:NaAC 1-3M，異丙醇50%_70% (v/V)。
[0016]本發(fā)明的提取哺乳動(dòng)物血液基因組DNA的方法，包括如下步驟:
1)裂解紅細(xì)胞:在血樣中加入紅細(xì)胞裂解液，混合均勻，離心，去除上部液體后得到沉
淀；
2)裂解白細(xì)胞并去除RNA:加入白細(xì)胞裂解液，充分反應(yīng)后，加入RNA酶；
3)沉淀蛋白質(zhì):加入蛋白沉淀液，離心后，取上清液；
4)沉淀DNA:加入DNA沉淀液，離心后，得DNA沉淀；
5)將DNA沉淀加入70%乙醇洗滌，洗滌干凈后，離心得DNA樣品。
[0017]優(yōu)選地，
所述的步驟(1)中血樣與紅細(xì)胞裂解液的體積比為1: (31)。
[0018]所述的步驟(1)、(3)、(4)、(5)中離心時(shí)的離心速為8000~14000rpm。
[0019]所述的步驟(2)中白細(xì)胞裂解液的量為400-700μ I。
[0020]所述的步驟(3)中白細(xì)胞裂解液與蛋白沉淀液的體積比為(1-2): (1-3)。
[0021]所述的步驟(3)中上清液與DNA沉淀液的體積比為3: (4~6)。
[0022]優(yōu)選地，
所述的提取哺乳動(dòng)物血液基因組DNA的方法，包括如下步驟:
O紅細(xì)胞裂解:
取200μ I血樣、1200μ I紅細(xì)胞裂解液加入到微量離心管中，顛倒混勻5min ;于12000rpm離心3min,去盡上部紅色液體；
2)裂解白細(xì)胞并去除RNA:加入550 μ I白細(xì)胞裂解液，于56 °C恒溫水浴20min;加入25 μ IRNA酶，室溫放置2min ；
3)沉淀蛋白質(zhì)
加入180 μ I蛋白沉淀液,靜置5min ;于12000rpm離心5min,取上清液至新的EP管中；
4)沉淀DNA
加入DNA沉淀液1200 μ I，加異丙醇至終濃度50%-70% (v/v )，室溫沉淀20min ；于12000rpm離心5min,去除上清液；
5)洗滌DNA
加入200 μ I 70%乙醇溶液,輕輕搖晃兩下,室溫沉淀20min ;于12000rpm離心5min,去除上清液。室溫倒置干燥5min，加50 μ I雙蒸水溶解。
[0023本發(fā)明的技術(shù)原理如下:紅細(xì)胞裂解液成分能夠有效裂解紅細(xì)胞，通過(guò)離心從而有效去除了紅細(xì)胞雜質(zhì)。白細(xì)胞裂解液成分能夠有效裂解白細(xì)胞，使DNA釋放出來(lái)，從而提高了 DNA提取效率。蛋白沉淀液有效的使蛋白質(zhì)沉淀，DNA保持在溶液中，從而有效的去除蛋白質(zhì)雜質(zhì)，提聞提取純度。
[0024]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下技術(shù)效果:
O不采用有機(jī)試劑，環(huán)保，對(duì)人體也無(wú)不良影響。
[0025]2)以含有蛋白酶K和SDS的白細(xì)胞裂解液，可以有效裂解細(xì)胞釋放DNA，
提高DNA提取率。
[0026]3)在蛋白沉淀液中，蛋白質(zhì)在高鹽濃度條件下析出形成沉淀，而溶液中的陽(yáng)離子與帶負(fù)電的DNA結(jié)合成DNA鹽，這時(shí)DNA在溶液中呈溶解狀態(tài)，從而有效與蛋白雜質(zhì)分離，提高DNA提取純度。
[0027]4)本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)單，適用范圍廣。
[0028]5)操作時(shí)間短，可在短時(shí)間內(nèi)獲得實(shí)驗(yàn)所需要的DNA樣品，大大提高了實(shí)驗(yàn)的效率。
[0029]6)本發(fā)明所用紅細(xì)胞裂解液、白細(xì)胞裂解液、蛋白沉淀液配方成分簡(jiǎn)單高效，價(jià)格低廉，可極大程度上減少提取成本。
[0030]
【具體實(shí)施方式】
[0031]下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。說(shuō)明書(shū)內(nèi)實(shí)施案例提供了本發(fā)明的實(shí)施方案的事例，但不限為本發(fā)明的范圍。
[0032]實(shí)施例1
本實(shí)施例的哺乳動(dòng)物血液基因組DNA提取試劑盒，由以下成分組成:紅細(xì)胞裂解液、白細(xì)胞裂解液、蛋白沉淀液和DNA沉淀液，紅細(xì)胞裂解液的成分及各成分終濃度如下=TrisIOmM, NH4Cl IOOmM, EDTA 二鈉鹽5mM ；pH為7.6 ;白細(xì)胞裂解液的成分及各成分終濃度如下:Tris IOmM, EDTA 二鈉鹽 5mM，SDS 0.1% (w/v)，蛋白酶 K 0.5g/L, pH 為 7.6 ;蛋白沉淀液的成分及終濃度如下=NaCl 5M ;DNA沉淀液的成分及各成分終濃度如下:NaAC 1M，異丙醇50% (v/v)。
[0033]試劑盒中各個(gè)成分的配制方法如下:紅細(xì)胞裂解液配制方法為:稱(chēng)量 Tris 1.21g (1Ommol)jNH4Cl 5.35g (100mmol), EDTA二鈉鹽1.86 g (5mmol)于1000mL燒杯中，加入約800mL雙蒸水充分溶解后，用鹽酸調(diào)制PH7.6，轉(zhuǎn)至1000mL容量瓶中定容，滅菌后使用。
[0034]白細(xì)胞裂解液配制方法為:稱(chēng)量Tris L 21g (1Ommol)，EDTA 二鈉鹽 L 86 g(5mmol), SDS 1g于1000mL燒杯中，加入約800mL雙蒸水充分溶解后,用鹽酸調(diào)制pH7.6,轉(zhuǎn)至1000mL容量瓶中定容，滅菌后加入0.5g蛋白酶K充分溶解備用。
[0035]蛋白沉淀液配制方法為:稱(chēng)量292.2g (5mol) NaCl，加入800mL雙蒸水充分溶解后，轉(zhuǎn)至1000mL容量瓶中定容，滅菌后使用。
[0036]DNA沉淀液配制方法:稱(chēng)量無(wú)水乙酸鈉82.03g (Imol)于1000mL燒杯中，加入800mL雙蒸水充分溶解后，用乙酸調(diào)節(jié)pH轉(zhuǎn)至5.2，轉(zhuǎn)至1000mL容量瓶中定容，滅菌后使用。異丙醇現(xiàn)用現(xiàn)加。
[0037]使用上述試劑盒提取哺乳動(dòng)物血液基因組DNA，包括如下步驟:
1、紅細(xì)胞裂解:
(1)取200 μ l血樣、1200 μ l紅細(xì)胞裂解液(RLB)加入到Eppendorf管中，顛倒混勻5min。
[0038](2)于12000rpm離心3min，去盡上部紅色液體。
[0039]2、裂解白細(xì)胞并去除RNA:
(I)加入550 μ l白細(xì)胞裂解液(TB)，于56°C恒溫水浴20min。
[0040](2)加入 25 μ lRNA 酶，室溫放置 2min。
[0041]3、沉淀蛋白質(zhì)
(I)加入180 μ l蛋白沉淀液(PB)，靜置5min。
[0042](2)于12000rpm離心5min,取上清液至新的EP管中。
[0043]4、沉淀 DNA
(I)加入DNA沉淀液1200 μ l，異丙醇至終濃度50%，室溫沉淀20min。
[0044](2)于12000rpm離心5min,去除上清液。
[0045]5、洗滌 DNA
加入200 μ l 70%乙醇溶液,輕輕搖晃兩下,室溫沉淀20min。與12000rpm離心5min,去除上清液。室溫倒置干燥5min，加50 μl雙蒸水溶解。
[0046]6、用紫外分光光度法測(cè)定DNA含量為283.3ng/ μl，OD260/OD280=l.85。
[0047]實(shí)施例2
本實(shí)施例的哺乳動(dòng)物血液基因組DNA提取試劑盒，由以下成分組成:紅細(xì)胞裂解液(RLB)、白細(xì)胞裂解液(TB)、蛋白沉淀液和DNA沉淀液，紅細(xì)胞裂解液的成分及各成分終濃度如下:Tris 50mM, NH4Cl 200mM, EDTA 二鈉鹽50mM ；pH為7.8 ;白細(xì)胞裂解液的成分及各成分終濃度如下:Tris 50mM, EDTA 二鈉鹽50mM，SDS 1% (w/v)，蛋白酶K 2g/L，PH為
7.8 ;蛋白沉淀液的成分及終濃度如下:NaCl 5.5M ；DNA沉淀液的成分及各成分終濃度如下:NaAC 2M,異丙醇 60% (v/v)。
[0048]試劑盒中各個(gè)成分的配制方法如下:
紅細(xì)胞裂解液配制方法為:稱(chēng)量 Tris 6.05g (50mmol), NH4Cl 10.7g (200mmol),EDTA二鈉鹽18.61 g (50mmol)于1000mL燒杯中，加入約800mL雙蒸水充分溶解后，用鹽酸調(diào)制pH7.8，轉(zhuǎn)至1000mL容量瓶中定容，滅菌后使用。
[0049]白細(xì)胞裂解液配制方法為:稱(chēng)量Tris 6.05g (50mmol)，EDTA 二鈉鹽 18.61 g(50mmol),SDS IOg于1000mL燒杯中，加入約800mL雙蒸水充分溶解后，用鹽酸調(diào)制ρΗ7.8，轉(zhuǎn)至1000mL容量瓶中定容，滅菌后加入2g蛋白酶K充分溶解備用。
[0050]蛋白沉淀液配制方法為:稱(chēng)量321.42g (5.5mol) NaCl，加入800mL雙蒸水充分溶解后，轉(zhuǎn)至1000mL容量瓶中定容，滅菌后使用。
[0051]DNA沉淀液配制方法:稱(chēng)量無(wú)水乙酸鈉164.06g (2mol)于1000mL燒杯中，加入800mL雙蒸水充分溶解后，用乙酸調(diào)節(jié)pH轉(zhuǎn)至5.2，轉(zhuǎn)至1000mL容量瓶中定容，滅菌后使用。異丙醇現(xiàn)用現(xiàn)加。
[0052]使用上述試劑盒提取哺乳動(dòng)物血液基因組DNA，包括如下步驟:
1、紅細(xì)胞裂解:
(1)取200 μ I血樣、1200 μ I紅細(xì)胞裂解液(RLB)加入到Eppendorf管中，顛倒混勻5min。
[0053](2)于12000rpm離心3min，去盡上部紅色液體。
[0054]2、裂解白細(xì)胞并去除RNA:
(I)加入550 μ I白細(xì)胞裂解液(TB)，于56°C恒溫水浴20min。
[0055](2)加入 25 μ I RNA 酶，室溫放置 2min。
[0056]3、沉淀蛋白質(zhì)
(I)加入180 μ I蛋白沉淀液(PB)，靜置5min。
[0057](2)于12000rpm離心5min,取上清液至新的EP管中。
[0058]4、沉淀 DNA
(I)加入DNA沉淀液1200 μ I，異丙醇至終濃度60%，室溫沉淀20min。
[0059](2)于12000rpm離心5min,去除上清液。
[0060]5、洗滌 DNA
加入200 μ I 70%乙醇溶液,輕輕搖晃兩下,室溫沉淀20min。與12000rpm離心5min,去除上清液。室溫倒置干燥5min，加50 μ I雙蒸水溶解。
[0061]6、用紫外分光光度法測(cè)定DNA含量為224.5ng/y I, OD260/OD280=l.83 實(shí)施例3
本實(shí)施例的哺乳動(dòng)物血液基因組DNA提取試劑盒，由以下成分組成:紅細(xì)胞裂解液(RLB)、白細(xì)胞裂解液(TB)、蛋白沉淀液和DNA沉淀液，紅細(xì)胞裂解液的成分及各成分終濃度如下:Tris 150mM,NH4Cl 300mM，EDTA 二鈉鹽IOOmM ;pH為8.0 ;白細(xì)胞裂解液的成分及各成分終濃度如下:Tris 150mM,EDTA 二鈉鹽IOOmM, SDS 2% (w/v)，蛋白酶K 4g/L，PH為
8.0 ;蛋白沉淀液的成分及終濃度如下:NaCl 6M ；DNA沉淀液的成分及各成分終濃度如下:NaAC 3M，異丙醇 70% (v/v)。
[0062]試劑盒中各個(gè)成分的配制方法如下:
紅細(xì)胞裂解液配制方法為:稱(chēng)量 Tris 18.17g (150mmol), NH4Cl 16.05g (300mmol),EDTA 二鈉鹽37.22 g (100 mmol)于1000mL燒杯中，加入約800mL雙蒸水充分溶解后，用鹽酸調(diào)制PH8.0，轉(zhuǎn)至1000mL容量瓶中定容，滅菌后使用。
[0063]白細(xì)胞裂解液配制方法為:稱(chēng)量Tris 18.17g (150mmol)，EDTA 二鈉鹽 37.22g (IOOmmol), SDS 20g于1000mL燒杯中，加入約800mL雙蒸水充分溶解后，用鹽酸調(diào)制PH8.0，轉(zhuǎn)至1000mL容量瓶中定容，滅菌后加入4g蛋白酶K充分溶解備用。
[0064]蛋白沉淀液配制方法為:稱(chēng)量350.64g (6mol)無(wú)水NaCl，加入800mL雙蒸水充分溶解后，轉(zhuǎn)至1000mL容量瓶中定容，滅菌后使用。
[0065]DNA沉淀液配制方法:稱(chēng)量無(wú)水乙酸鈉246.09g (3mol)于1000mL燒杯中，加入800mL雙蒸水充分溶解后，用乙酸調(diào)節(jié)pH轉(zhuǎn)至5.2，轉(zhuǎn)至1000mL容量瓶中定容，滅菌后使用。異丙醇現(xiàn)用現(xiàn)加。
[0066]使用上述試劑盒提取哺乳動(dòng)物血液基因組DNA，包括如下步驟:
1、紅細(xì)胞裂解:
(I)取200 μ I血樣、1200 μ I紅細(xì)胞裂解液(RLB)加入到Eppendorf管中，顛倒混勻5min。
[0067](2)于12000rpm離心3min，去盡上部紅色液體。
[0068]2、裂解白細(xì)胞并去除RNA:
(I)加入550 μ I白細(xì)胞裂解液(TB)，于56°C恒溫水浴20min。
[0069](2)加入 25 μ I RNA 酶，室溫放置 2min。 [0070]3、沉淀蛋白質(zhì)
(I)加入180 μ I蛋白沉淀液(PB)，靜置5min。
[0071](2)于12000rpm離心5min,取上清液至新的EP管中。
[0072]4、沉淀 DNA
(I)加入DNA沉淀液1200 μ I，異丙醇至終濃度70%，室溫沉淀20min。
[0073](2)于12000rpm離心5min,去除上清液。
[0074]5、洗滌 DNA
加入200 μ I 70%乙醇溶液,輕輕搖晃兩下,室溫沉淀20min。與12000rpm離心5min,去除上清液。室溫倒置干燥5min，加50 μ I雙蒸水溶解。
[0075]6、用紫外分光光度法測(cè)定DNA含量為232.4ng/ μ 1，OD260/OD280=l.85。
[0076]對(duì)照例I市售試劑盒提取DNA
用市售商業(yè)化血液DNA提取試劑盒作為對(duì)照例，按說(shuō)明書(shū)步驟操作，提取DNA樣品濃度測(cè)定結(jié)果為:151.5ng/y I, OD260/OD280=l.82。
[0077]從測(cè)定結(jié)果可以看出本發(fā)明方法DNA提取率及純度均較高，且操作簡(jiǎn)單，用時(shí)較短，成本低廉。
【權(quán)利要求】
1.一種哺乳動(dòng)物血液基因組DNA提取試劑盒，其特征在于，由以下成分組成:紅細(xì)胞裂解液、白細(xì)胞裂解液、蛋白沉淀液和DNA沉淀液， 其中， 所述的紅細(xì)胞裂解液的組成成分及各成分終濃度如下=Tris 10mM-150mM, NH4Cl100mM-300mM, EDTA 二鈉鹽(分子式為:CltlH14N2Na2O8CH2O) 5mM-100mM ；pH 為 7.6-8.0 ； 所述的白細(xì)胞裂解液的組成成分及各成分終濃度如下:Tris 10mM-150mM, EDTA 二鈉鹽(分子式為:C10H14N2Na2O8.2H20)5mM-1OOmM, 0.1%-2% (w/v)的 SDS，蛋白酶 K (0.5_4)g/L，PH 為 7.6-8.0 ； 所述的蛋白沉淀液為NaCl、CaCl2, NH4Cl和MgCl2中的一種或幾種，終濃度濃度為5-6M ； 所述的DNA沉淀液的組成成分及各成分終濃度如下:NaAC 1-3M，異丙醇50%_70% (v/V)。
2.使用如權(quán)利要求1所述的哺乳動(dòng)物血液基因組DNA提取試劑盒提取哺乳動(dòng)物血液基因組DNA的方法，其特征在于，包括如下步驟: 1)裂解紅細(xì)胞:在血樣中加入紅細(xì)胞裂解液，混合均勻至溶液清亮，離心，去除上部液體后得到沉淀； 2)裂解白細(xì)胞并 去除RNA:加入白細(xì)胞裂解液，充分反應(yīng)后，加入RNA酶； 3)沉淀蛋白質(zhì):加入蛋白沉淀液，離心后，取上清液； 4)沉淀DNA:加入DNA沉淀液，離心后，盡去上清液； 5)將DNA沉淀加入70%乙醇洗滌，洗滌干凈后，離心得DNA樣品。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的步驟(1)中血樣與紅細(xì)胞裂解液(RLB)的體積比為1: (3~8)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的步驟(1)、(3)、(4)、(5)中離心時(shí)的離心速為8000~14000rpm。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的步驟(2)中白細(xì)胞裂解液(TB)的量為 400-700μ I。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的步驟(3)中白細(xì)胞裂解液與蛋白沉淀液的體積比為(1-2): (1-3)。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的步驟(3)中上清液與DNA沉淀液的體積比為3: (4~6)。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的提取哺乳動(dòng)物血液基因組DNA的方法，其特征在于，包括如下步驟: 1)紅細(xì)胞裂解: 取200μ I血樣、1200μ I紅細(xì)胞裂解液加入到微量離心管中，顛倒混勻5min ;于12000rpm離心3min,去盡上部紅色液體； 2)裂解白細(xì)胞并去除RNA: 加入550 μ I白細(xì)胞裂解液，于56 V恒溫水浴20min ;加入25 μ IRNA酶，室溫放置2min ； 3)沉淀蛋白質(zhì)加入180 μ I蛋白沉淀液,靜置5min ;于12000rpm離心5min,取上清液至新的EP管中； 4)沉淀DNA 加入DNA沉淀液1200 μ1，加異丙醇至終濃度50%-70% (v/v )，室溫沉淀20min ；于12000rpm離心5min,去除上清液； 5)洗滌DNA 加入200 μ1 70%乙醇溶液,輕輕搖晃兩下,室溫沉淀20min ;于12000rpm離心5min,去除上清液；室溫倒置干燥5min，加50 μ 1雙蒸水溶解。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK103898096SQ201410118427
【公開(kāi)日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2014年3月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月27日
【發(fā)明者】潘海波, 邢楠楠, 謝陽(yáng), 華琴 申請(qǐng)人:江蘇佰齡全基因生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司