一種用于血液中全基因組dna提取試劑盒及其方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種從血液中提取全基因組DNA的試劑盒及其使用方法。其特征在于試劑盒包括紅細胞裂解液、白細胞洗滌液、消化液、蛋白酶K、純化液、gDNA鹽析液、gDNA洗滌液及gDNA洗脫液等。本發(fā)明血液中全基因組DNA提取試劑盒使用方法的特征在于采用裂解紅細胞后洗滌得到白細胞，將含有蛋白酶K的消化液裂解白細胞，通過改進的氯化鋰純化液進一步純化后鹽析液層析獲得高純度全基因組DNA。本發(fā)明試劑盒提取血液中全基因組DNA時，不用事先對血液中進行血漿和血清分離，只需取新鮮或冰凍的抗凝全血，最低需要的血量可達到20μl或者血斑即可。本發(fā)明試劑盒獲得純度更高的全基因組DNA可完全解鏈和高效地進行PCR擴增，用于PCR擴增、基因表達、基因測序、全基因組測序、外顯子組測序、基因突變和單核苷酸多態(tài)性等科研或臨床診斷分析。
【專利說明】—種用于血液中全基因組DNA提取試劑盒及其方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種從血液中提取全基因組DNA的試劑盒及利用其從血液中提取全基因組DNA的方法。本發(fā)明所述試劑盒提取血液中全基因組DNA時，不用事先對血液中進行血漿和血清分離，只需取新鮮或冰凍的抗凝全血，最低需要的血量可達到20 μ I或者血斑即可。其高效提取獲得的高純度的全基因組DNA，可用于PCR擴增、基因表達、基因測序、全基因組測序、外顯子組測序、基因突變和單核苷酸多態(tài)性等科研或臨床診斷分析。。
【背景技術(shù)】
[0002]全基因組DNA (genomic DNA, gDNA)為單倍體細胞中包括編碼序列和非編碼序列在內(nèi)的全部基因信息。所有的生命信息均可以從全基因組DNA中發(fā)現(xiàn)，包括與疾病密切相關(guān)的基因表達、基因突變和單核苷酸多態(tài)性等問題。從基因水平分析可以早發(fā)現(xiàn)、早診斷所用疾病的發(fā)生，在分子遺傳學(xué)和臨床檢測中DNA檢查已有逐步取代血清學(xué)檢查(ELISA檢測)。因而，獲取全基因組DNA是所有相關(guān)的科研和臨床檢測的第一步，聞效率提取獲得聞純度的全基因組DNA是至關(guān)重要的。
[0003]目前經(jīng)典基因組DNA提取方法主要分為4個步驟:1.使用淋巴細胞分離液梯度離心分離得到血液中白細胞，或者直接低滲透裂解紅細胞后離心收集白細胞；2.使用細胞裂解液裂解白細胞釋放出基因組DNA，如高氯酸鈉法、SDS法、NaI法和尿素提取法等；3.有機溶劑抽提去除蛋白質(zhì)和血紅素等雜質(zhì)，即酚/氯仿抽提；4.用乙醇沉淀或透析等沉淀分離DNA。該方法具有提取的DNA純度高、蛋白質(zhì)和血紅素等雜質(zhì)少的優(yōu)點，但該方法需要的血液樣本大，殘留DNA溶液中含有酚類等有機物質(zhì)對DNA聚合酶有抑制作用，特別是在PCR擴增過程中會對擴增過程產(chǎn)生抑制作用。另外，酚、氯仿和異丙醇等有機溶劑易造成環(huán)境污染，有損操作者健康，使得該方法的應(yīng)用受到一定的限制。
[0004]基因組DNA非有機溶劑提取法采用細胞裂解液使白細胞釋放DNA，使用蛋白酶K、蛋白酶E、蛋白酶K和核糖核酸酶和強堿(NaOH或Κ0Η)等對蛋白質(zhì)和RNA進行允分消化分解。在高鹽的條件下用乙醇直接沉淀分離純化DNA。該方法避免了使用有毒作用的有機溶劑，提取的DNA純度較高和提取效率高，但其需要的血量大，單獨使用蛋白酶消化時間很長，可能對白細胞裂解不充分，另外使用強堿對操作者健康不利，也可能影響后續(xù)PCR擴增效率。
[0005]硅膠膜離心吸附柱方法利用硅膠膜特異性吸附DNA能力，通過漂洗取出蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)，后用低鹽溶液洗脫得到基因組DNA，操作中未用到酚、氯仿等有機溶劑以及強堿，但用離心柱提取的gDNA容易產(chǎn)生拖尾，表明其提取的gDNA純度不高，或有降解的產(chǎn)生。
[0006]血液中全基因組DNA提取方法必須減少有機溶劑或強堿對操作者健康和后續(xù)實驗的影響，在微量的血液樣本時也能高效提取全基因組DNA，因此，使用高效裂解白細胞和純化gDNA以及不進行血清和血漿分離的試劑盒，對高效提取高純度全基因DNA具有廣泛應(yīng)用價值。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明提供一種從血液中高效地提取全基因組DNA的試劑盒及其從血液中提取全基因組DNA的方法，用以解決減少有機溶劑或強堿對操作者健康和后續(xù)實驗的影響等問題，即使在微量的血液樣本時也能高效提取得到高純度的全基因組DNA。
[0008]通過發(fā)明人多年來對上萬例臨床血液樣本的提取全基因組DNA工作經(jīng)驗和技術(shù)改進，發(fā)現(xiàn)在含有 lmol/L Tris-HCl (pH 值 8.0)，0.5mol/L EDTA (pH 值 8.0)，0.2mol/LNaCl，10% SDS的消化液中添加20mg/ml蛋白酶K，處理后能高效地裂解白細胞，可以分解與DNA結(jié)合在一起的核蛋白，使DNA被游離釋放在消化液中。也發(fā)現(xiàn)采用LiCl可沉淀糖類、脂類、大量蛋白質(zhì)和高分子RNA，在向水浴過夜后白細胞的裂解混合液中加入含7.5mol/L LiCl的純化液可大量去除糖類、脂類、蛋白質(zhì)和高分子RNA等雜質(zhì)，該過程無需再使用RNA酶消化處理，即可去除大量RNA。
[0009]本發(fā)明采用價格廉價的預(yù)冷無水乙醇即可析出大量全基因組DNA，不需要通過有機溶劑進行抽提。并且應(yīng)用80%乙醇的洗滌液進行洗滌和含lmol/LTris-HCl (pH值8.0)，
0.5mol/LEDTA(pH值8.0)的洗脫液進行洗脫，將獲得高純度的全基因組DNA。因而，在此基礎(chǔ)上研發(fā)可高效從血液中提取高純度的全基因組DNA的試劑盒及其方法。
[0010]本發(fā)明所提供的一種血液中全基因組DNA提取試劑盒，其特征在于各組成分別為:
[0011]I)紅細胞裂解液:滅菌的去離子超純水(電阻率大于18MQ*cm)，400ml/瓶；
[0012]2)白細胞洗滌液:為0.1% (體積比)聚乙二醇辛基苯基醚(Triton-XlOO)，300ml/ 瓶:
[0013]3)消化液:含lmol/L三羥甲基氨基甲烷(Tris-HCl) (pH值8.0),0.5mol/L乙二胺四乙酸(EDTA) (pH值 8.0)，0.2mol/L NaCl, 10% (質(zhì)量體積比)十二烷基硫酸(SDS)，40ml/支；
[0014]4)蛋白酶K:為20mg/ml蛋白酶K, Iml/支；
[0015]5)純化液:為5-7.5mol/L氯化鋰(LiCl)、氯化鈉或氯化鉀，40ml/瓶；
[0016]6) gDNA鹽析液:無水乙醇，500ml/瓶；
[0017]7) gDNA洗滌液:為80% (體積比)乙醇，40ml/瓶；
[0018]8) gDNA 洗脫液:含 lmol/L Tris-HCl (pH 值 8.0)，0.5mol/L EDTA (pH值 8.0)，IOml/支。
[0019]上述gDNA提取試劑盒組份可用于Iml血量的50次血液中全基因組DNA提取，并可組成100次、200次和500次等gDNA提取試劑盒，含使用說明書一份，試劑盒保存在4°C冰箱。
[0020]所述血液中全基因組DNA提取試劑盒中純化液，優(yōu)選地為7.5mol/L氯化鋰(LiCl)。
[0021]本發(fā)明所提供的血液中提取全基因組DNA的方法，其特征在于包括以下步驟:
[0022]I)血液紅細胞裂解:先向每個15ml離心管中加入等于血液樣本8倍體積的紅細胞裂解液，將血液樣本加入該離心管中，手動振蕩混勻，4°C放置20~30min后2000rpm(轉(zhuǎn)每分鐘)低速離心15min ;離心結(jié)束后，將上清液棄之(凍存血液需先放入37°C水浴鍋中水浴，至血液樣本融化后加入到紅細胞裂解液中)；[0023]2)白細胞洗滌:向含白細胞沉淀的15ml離心管中加入2~3ml的白細胞洗滌液，混勻后放入低速水平離心機，2000rpm低速離心15min，將上清液小心棄之，可重復(fù)洗滌一次；
[0024]3)白細胞消化裂解:取0.2ml蛋白酶K加入到消化液中混勻，向每一份白細胞沉淀中加入700 μ I “消化液+蛋白酶K”的混合溶液，吹打混勻后，轉(zhuǎn)移至2.0ml離心管中，56°C水浴2-3h，沉淀消失后37°C水浴過夜；
[0025]4)細胞雜質(zhì)沉淀:向水浴過夜后的混合液中分別加入800μ I純化液，振蕩混勻，放入-20°C冰箱30min-lh ;然后13000rpm高速離心10min，將離心后的上清液倒入新的
2.0ml離心管中；
[0026]5) gDNA析出:上述離心后上清液快速充分震蕩混勻，并迅速倒入裝有13ml預(yù)冷無水乙醇的15ml離心管中；待gDNA逐漸析出，用移液器將肉眼可見的絮狀漂浮物小心地挑起，轉(zhuǎn)移至加有800 μ I gDNA洗滌液的1.5ml離心管中；
[0027]6) gDNA洗漆:收集完析出的gDNA后15000rpm高速離心10min,棄上清,可重復(fù)洗滌一次；洗滌完畢的gDHA敞口在超凈臺中開風(fēng)機放置，至gDNA洗滌液完全揮發(fā)；
[0028]7) gDNA洗脫:向揮發(fā)干的gDNA中加入100-200 μ I的gDNA洗脫液，震蕩混勻，在4°C冰箱中至gDNA完全溶解，即得到高純度全基因組DNA，于_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0029]本發(fā)明提供的用于血液中全基因組DNA提取試劑盒及其方法不限于人類的抗凝血，還可以用于哺乳 動物、禽類、兩棲類動物等；需要的血液樣品量最低可以達到20μ 1，甚至血斑和血跡，均可提取得到高純度的全基因組DNA。優(yōu)選地，本發(fā)明提供的用于血液中全基因組DNA提取試劑盒及其方法還可以用于冷凍儲存的血液，包括在_20°C冰箱、-80°C冰箱或液氮儲存的血液樣本。
[0030]通過本發(fā)明所述的試劑盒及其方法得到的高純度gDNA，其特征在于經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測為單一條帶，無拖尾和雜帶；超微量分光光度計檢測A260 /A280比值大于1.8，表明無蛋白和酚類物質(zhì)污染；A260/A230的比值大于2.0，表明無碳水化合物(糖類)、鹽類或有機溶劑污染；超微量分光光度計檢測Iml血量提取的gDNA效率可達到20 μ g/ml以上；滿足所有基因研究和檢測的樣品要求。
[0031]與其它方法相比，本發(fā)明的技術(shù)優(yōu)勢主要表現(xiàn)在:
[0032]1.不用對血液中進行預(yù)處理，直接使用血液進行全基因組DNA提取，特別是使用冷凍儲存的血液，因此減少二次污染機會，在科研工作和臨床檢測中提高了檢測的準確度，使結(jié)果更加真實可信。
[0033]2.如果血液樣本量很低或是血斑時，傳統(tǒng)方法很難獲取到數(shù)量高的gDNA，本發(fā)明利用了血液中基因組DNA充分從白細胞中釋放出來并減少蛋白質(zhì)和RNA的干擾，大大提高了檢測的靈敏度，適用于微量的gDNA提取和檢測。
[0034]3.本發(fā)明使用的試劑中不含苯、氯仿等有毒物質(zhì)，對人體無危害。
[0035]4.本發(fā)明所用的LiCl純化液可沉淀糖類、脂類、大量蛋白質(zhì)和高分子RNA，無需用RNA酶，提取出來的gDNA純度高和數(shù)量多，可以直接進行PCR擴增檢測和后續(xù)工作。
[0036]本發(fā)明提供的血液中全基因組DNA提取試劑盒及其方法用于科研或臨床診斷用的PCR擴增、基因表達、基因測序、全基因組測序、外顯子組測序、基因突變和單核苷酸多態(tài)性等分析?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0037]圖1表示本發(fā)明所述的試劑盒及其方法提取血液中的全基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測圖。
[0038]圖2表示本發(fā)明所述的試劑盒及其方法提取血跡中的全基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測圖。
【具體實施方式】
[0039]本發(fā)明通過自主設(shè)計的含有l(wèi)mol/L Tris-HCl (pH 值 8.0)，0.5mol/L EDTA (pH 值
8.0),0.2mol/L NaCl, 10% SDS的消化液中聯(lián)合20mg/ml蛋白酶K，經(jīng)過56°C水浴2_3h，沉淀消失后37°C水浴過夜處理能高效地裂解白細胞，可以分解與DNA結(jié)合在一起的核蛋白，使DNA被游離釋放在消化液中。在向水浴過夜后白細胞的裂解混合液中加入含7.5mol/LLiCl的純化液可大量去除蛋白質(zhì)和高分子RNA等雜質(zhì)。
[0040]本發(fā)明采用價格廉價的預(yù)冷無水乙醇即可析出大量全基因組DNA，不需要通過有機溶劑進行抽提。并且應(yīng)用80%乙醇的洗滌液進行洗滌和含lmol/LTris-HCl (pH值8.0)，
0.5mol/LEDTA(pH值8.0)的洗脫液進行洗脫，將獲得高純度的全基因組DNA。因而，在此基礎(chǔ)上研發(fā)可高效從血液中提取高純度的全基因組DNA的試劑盒及其方法。
[0041]本發(fā)明所提供的一種血液中全基因組DNA提取試劑盒，其特征在于各組成分別為:
[0042]I)紅細胞裂解液:滅菌的去離子超純水(電阻率大于18MQ*cm)，400ml/瓶；
[0043]2)白細胞洗滌液:為0.1% (體積比)聚乙二醇辛基苯基醚(Triton-XlOO)，300ml/ 瓶:
[0044]3)消化液:含lmol/L三羥甲基氨基甲烷(Tris-HCl) (pH值8.0),0.5mol/L乙二胺四乙酸(EDTA) (pH值 8.0)，0.2mol/L NaCl, 10% (質(zhì)量體積比)十二烷基硫酸(SDS)，40ml/支；
[0045]4)蛋白酶K:為20mg/ml蛋白酶K, Iml/支；
[0046]5)純化液:為 5-7.5mol/L 氯化鋰(LiCl)，40ml/ 瓶；
[0047]6) gDNA鹽析液:無水乙醇，500ml/瓶；
[0048]7) gDNA洗滌液:為8O % (體積比)乙醇，40ml/瓶；
[0049]8) gDNA 洗脫液:含 lmol/L Tris-HCl (pH 值 8.0)，0.5mol/L EDTA (pH值 8.0)，IOml/支。
[0050]本發(fā)明所提供的血液中全基因組DNA提取試劑盒的各組成制備方法如下:
[0051]I)紅細胞裂解液，去離子超純水(ddH20)(電阻率大于18ΜΩ*αιι)，經(jīng)121°C，100千帕壓強下滅菌20分鐘處理；
[0052]2)白細胞洗滌液，50ml Triton-XlOO加入400ml滅菌的去離子超純水中，68°C助溶，定容至500ml，制備成10% Triton-XlOO的母液；然后將IOml 10% Triton-XlOO母液加入990ml滅菌的去離子超純水中配制成0.1% Triton-XlOO的白細胞洗滌液；
[0053]3)消化液:60.55g Tris 堿溶于 400mlddH20 中，用 HCl 調(diào) pH 值 8.0 (濃 HCl 約加2.0ml)，用ddH20定容至500ml,經(jīng)121 °C, 100千帕壓強下滅菌20分鐘配制成lmol/LTris-HCl (pH 值 8.0)；
[0054]93.05g EDTA-Na 鹽磁力攪拌溶于 400ml ddH20 中，用 NaOH 調(diào) pH 值 8.0 (NaOH 顆粒約加入IOg)，用ddH20定容至500ml，經(jīng)121 °C，100千帕壓強下滅菌20分鐘配制成0.5mol/L EDTA (pH 值 8.0)；
[0055]5.844g NaCl 溶于 400ml ddH20 中，定容至 500ml，經(jīng) 121 °C，100 千帕壓強下滅菌 20分鐘配制成0.2mol/L NaCl ；
[0056]20.0g SDS溶于160ml滅菌的ddH20中，68°C助溶,用滅菌的ddH20定容至200ml,配制成10% SDS ；
[0057]分別取lmol/L Tris-HCl (pH 值 8.0) 5ml,0.5mol/L EDTA(pH 值 8.0) 10ml,0.2mol/LNaC125mlU0% SDS25ml，用滅菌的ddH20定容至500ml，配制成消化液。
[0058]4)蛋白酶K, IOOmg蛋白酶K干粉,加入5ml滅菌的ddH20,顛倒混勻，分裝成20ng/ul 200ul，存放于-20°C冰箱中備用；
[0059]5)純化液，158.96g無水LiCl磁力攪拌，溶于400ml滅菌的ddH20中，用滅菌的ddH20定容至500ml,配制成純化液；
[0060]6) gDNA析出液，分析純無水乙醇，-20°C冰箱預(yù)冷，即為gDNA析出液；
[0061]7) gDNA洗滌液，取400ml分析純無水乙醇至500ml無菌玻璃瓶中，加100mL滅菌的ddH20,顛倒混勻，配制成gDNA洗漆液；
[0062]8) gDNA 洗脫液，60.55g Tris 堿溶于 400ml ddH20 中，用 HCl 調(diào) pH 值 8.0 (濃 HCl約加2.0ml)，用ddH20定容至500ml，經(jīng)121。。，100千帕壓強下滅菌20分鐘配制成lmol/LTris-HCl(pH值 8.0)；
[0063]93.05g EDTA-Na 鹽磁力攪拌溶于 400ml ddH20 中，用 NaOH 調(diào) pH 值 8.0 (NaOH 顆粒約加入IOg)，用ddH20定容至500ml，經(jīng)121 °C，100千帕壓強下滅菌20分鐘配制成0.5mol/L EDTA (pH 值 8.0)；
[0064]分別取lmol/L Tris-HCl (pH 值 8.0) 5ml 和 0.5mol/L EDTA (pH 值 8.0) Iml 用滅菌的ddH20定容至500ml,配制成gDNA洗脫液。
[0065]上述gDNA提取試劑盒組份可用于Iml血量的50次血液中全基因組DNA提取，并可組成100次、200次和500次等gDNA提取試劑盒，含使用說明書一份，試劑盒保存在4°C冰箱，有效期I年。
[0066]所述血液中全基因組DNA提取試劑盒中純化液，優(yōu)選地為7.5moI/L氯化鋰(LiCl)。
[0067]本發(fā)明所提供的血液中提取全基因組DNA的方法，其特征在于包括以下步驟:
[0068]I)血液紅細胞裂解:先向每個15ml離心管中加入等于血液樣本8倍體積的紅細胞裂解液，將血液樣本加入該離心管中，手動振蕩混勻，4°C放置20~30min后2000rpm(轉(zhuǎn)每分鐘)低速離心15min ;離心結(jié)束后，將上清液棄之(凍存血液需先放入37°C水浴鍋中水浴，至血液樣本融化后加入到紅細胞裂解液中)；
[0069]2)白細胞洗滌:向含白細胞沉淀的15ml離心管中加入2~3ml的白細胞洗滌液，混勻后放入低速水平離心機，2000rpm低速離心15min，將上清液小心棄之，可重復(fù)洗滌一次；
[0070]3)白細胞消化裂解:取0.2ml蛋白酶K加入到消化液中混勻，向每一份白細胞沉淀中加入700 μ I “消化液+蛋白酶K”的混合溶液，吹打混勻后，轉(zhuǎn)移至2.0ml離心管中，56°C水浴2-3h，沉淀消失后37°C水浴過夜；
[0071]4)細胞雜質(zhì)沉淀:向水浴過夜后的混合液中分別加入800μ I純化液，振蕩混勻，放入-20°C冰箱30min-lh ;然后13000rpm高速離心10min，將離心后的上清液倒入新的
2.0ml離心管中；
[0072]5) gDNA析出:上述離心后上清液快速充分震蕩混勻，并迅速倒入裝有13ml預(yù)冷無水乙醇的15ml離心管中；待gDNA逐漸析出，用移液器將肉眼可見的絮狀漂浮物小心地挑起，轉(zhuǎn)移至加有800 μ I gDNA洗滌液的1.5ml離心管中；
[0073]6) gDNA洗漆:收集完析出的gDNA后15000rpm高速離心10min,棄上清,可重復(fù)洗滌一次；洗滌完畢的gDNA敞口在超凈臺中開風(fēng)機放置，至gDNA洗滌液完全揮發(fā)；
[0074]7) gDNA洗脫:向揮發(fā)干的gDNA中加入100-200 μ I的gDNA洗脫液，震蕩混勻，在4°C冰箱中至gDNA完全溶解，即得到高純度全基因組DNA，于_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0075]本發(fā)明提供的用于血液中全基因組DNA提取試劑盒及其方法不限于人類的抗凝血，還可以用于哺乳動物的血液，如鼠、兔、豬、羊、狗和貓；禽類、兩棲類動物等；需要的血液樣品量最低可以達到20μ 1，甚至血斑和血跡，均可提取得到高純度的全基因組DNA。優(yōu)選地，本發(fā)明提供的用于血液中全基因組DNA提取試劑盒及其方法還可以用于冷凍儲存的血液，包括在_20°C冰箱、-80°C冰箱或液氮儲存的血液樣本。
[0076]通過本發(fā)明所述的試劑盒及其方法得到的高純度gDNA，其特征在于通過如下質(zhì)量控制:
[0077]提取的全基因組DNA提取效果用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，染料為溴化乙錠(EthidiumBromide, EB)替代物,在制膠的時候加入凝膠中。分別取3μ1 gDNA提取樣品，加入2 μ I上樣緩中液混合點樣，并點樣5 μ I DNA分子標準品(marker)，電泳條件為120V電壓，電泳20min，電泳結(jié)果用凝膠成像系統(tǒng)(藍盾-621)觀察拍照，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測為單一條帶，無拖尾和雜帶，表明提取的gDNA無其他DNA污染。。
[0078]取2 μ I gDNA提取樣品，以無菌去離子水為空白，用超微量分光光度計(Spectrophotometer:NanoDrop2000)測定波長為 230nm、260nm 和 280nm 的吸光度值，即A230、A260 和 A280。
[0079]利用純dsDNA的A260/A280和A260/A230比值，評估提取DNA的純度。本發(fā)明的試劑盒及其方法提取得到的gDNA經(jīng)超微量分光光度計檢測，A260/A280比值均大于1.8，表明無蛋白和酚類物質(zhì)污染；A260/A230的比值均大于2.0，表明無碳水化合物(糖類)、鹽類或有機溶劑污染；
[0080]按照dsDNA的換算公式:DNA含量(μ g/mL全血)=A260 X 50 μ g/ml X 10 (稀釋倍數(shù))Χ50(50μ I DNA溶液)/1000(用于DNA提取的全血量為1000 μ I)，計算提取的DNA含量，超微量分光光度計檢測Iml血量提取的gDNA效率可達到20 μ g/ml以上；滿足所有基因研究和檢測的樣品要求。
[0081]質(zhì)檢合格的DNA將濃度調(diào)整到50ng/ml，_20°C儲存?zhèn)溆谩?br> [0082]本發(fā)明提供的血液中全基因組DNA提取試劑盒及其方法用于科研或臨床診斷，提取得到的高純度和數(shù)量gDNA可完全解鏈和高效地進行PCR擴增，滿足基因表達、基因測序、外顯子組測序、基因突變和單核苷酸多態(tài)性等分析。[0083]以下，結(jié)合實施例對本發(fā)明做更具體的描述，但本發(fā)明不限于此。
[0084]實施例一血液中全基因組DNA提取試劑盒
[0085]試劑盒各組份如下:
[0086]I)紅細胞裂解液:去離子超純水(ddH20)，電阻率大于18MQ*cm)，經(jīng)121 °C，100千帕壓強下滅菌20分鐘處理；滅菌后每400ml分裝到500ml無菌塑料瓶中；
[0087]2)白細胞洗滌液:50ml Triton-XlOO加入400ml滅菌的去離子超純水中，68°C助溶，定容至500ml，制備成10% Triton-XlOO的母液；然后將IOml 10% Triton-XlOO母液加入990ml滅菌的去離子超純水中配制成0.1% Triton-XlOO的白細胞洗滌液；每300ml分裝到300ml無菌塑料瓶中；
[0088]3)消化液:60.55g Tris 堿溶于 400ml ddH20 中，用 HCl 調(diào) pH 值 8.0 (濃 HCl 約加2.0ml)，用ddH20定容至500ml,經(jīng)121 °C, 100千帕壓強下滅菌20分鐘配制成lmol/LTris-HCl(pH 值8.0)；
[0089]93.05g EDTA-Na 鹽磁力攪拌溶于 400ml ddH20 中，用 NaOH 調(diào) pH 值 8.0 (NaOH 顆粒約加入IOg)，用ddH20定容至500ml，經(jīng)121 °C，100千帕壓強下滅菌20分鐘配制成0.5mol/L EDTA (pH 值 8.0)；
[0090]5.844g NaCl 溶于 400ml ddH20 中，定容至 500ml，經(jīng) 121 °C，100 千帕壓強下滅菌 20分鐘配制成0.2mol/LNaCl ；
[0091]20.0g SDS溶于160ml滅菌的ddH20中，68°C助溶,用滅菌的ddH20定容至200ml,配制成10% SDS ；
[0092]分別取lmol/L Tris-HCl (pH 值 8.0) 5ml,0.5mol/L EDTA(pH 值 8.0) 10ml,0.2mol/LNaC125mlU0% SDS25ml，用滅菌的 ddH20 定容至 500ml，配制成含 lmol/L Tris-HCl (pH 值8.0)，0.511101/1^01六(？!1值8.0)，0.211101/1恥(:1，10%十二烷基硫酸(SDS)的消化液，每40ml分裝到50ml無菌塑料瓶中；
[0093]4)蛋白酶K:IOOmg蛋白酶K干粉,加入5ml滅菌的ddH20,顛倒混勻，配制成20ng/ul蛋白酶K，每1ml分裝到Iml無菌塑料管中，存放于_20°C冰箱中備用；
[0094]5)純化液:158.96g無水LiCl磁力攪拌，溶于400ml滅菌的ddH20中，用滅菌的ddH20定容至500ml，配制成純化液含7.5mol/L LiCl，每40ml分裝到50ml無菌塑料瓶中；
[0095]6) gDNA鹽析液:分析純無水乙醇，每500ml分裝到500ml無菌塑料瓶中；
[0096]7) gDNA洗滌液:取400ml分析純無水乙醇至500ml無菌玻璃瓶中，加100mL滅菌的ddH20，顛倒混勻，配制成gDNA洗滌液；每40ml分裝到50ml無菌塑料瓶中；
[0097]8) gDNA 洗脫液:60.55g Tris 堿溶于 400ml ddH20 中，用 HCl 調(diào) pH 值 8.0 (濃 HCl約加2.0ml)，用ddH20定容至500ml，經(jīng)121C，100千帕壓強下滅菌20分鐘配制成lmol/LTris-HCl(pH值 8.0)；
[0098]93.05g EDTA-Na 鹽磁力攪拌溶于 400ml ddH20 中，用 NaOH 調(diào) pH 值 8.0 (NaOH 顆粒約加入IOg)，用ddH20定容至500ml，經(jīng)121 °C，100千帕壓強下滅菌20分鐘配制成0.5mol/L EDTA (pH 值 8.0)；
[0099]分別取lmol/L Tris-HCl (pH 值 8.0) 5ml 和 0.5mol/L EDTA (pH 值 8.0) Iml 用滅菌的ddH20定容至500ml,配制成gDNA洗脫液,每IOml分裝到IOml無菌塑料管中。
[0100]由上述8種試劑做成的gDNA提取試劑盒可用于Iml血量的50次血液中全基因組DNA提取，并可組成100次、200次和500次等gDNA提取試劑盒，含使用說明書一份，試劑盒保存在4 °C冰箱，有效期為I年。
[0101]實施例二使用本發(fā)明試劑盒提取凍存血液中全基因組DNA
[0102]采集8位臨床糖尿病視網(wǎng)膜病變患者和7位正常人5ml EDTA抗凝血(與合作單位科研合作項目，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會同意，并與志愿者簽署知情同意書)。
[0103]I)血液紅細胞裂解:先將凍存血液從_80°C冰箱中取出放入37°C水浴鍋中水浴，至血液樣本融化。向每個15ml離心管中加入8ml的紅細胞裂解液，并加入1ml血液樣本，手動振蕩混勻，4°C放置20min后2000rpm低速離心15min ;離心結(jié)束后，將上清液棄之；
[0104]2)白細胞洗滌:向含白細胞沉淀的15ml離心管中加入2ml的白細胞洗滌液，混勻后放入低速水平離心機,2000rpm低速離心15min，將上清液小心棄之，可重復(fù)洗滌一次；
[0105]3)白細胞消化裂解:取0.2ml蛋白酶K加入到消化液中混勻，向每一份白細胞沉淀中加入700 μ I “消化液+蛋白酶K”的混合溶液，吹打混勻后，轉(zhuǎn)移至2.0ml離心管中，56°C水浴2-3h，沉淀消失后37°C水浴過夜；
[0106]4)細胞雜質(zhì)沉淀:向水浴過夜后的混合液中分別加入800μ I純化液，振蕩混勻，放入_20°C冰箱30min ;然后13000rpm高速離心10min，將離心后的上清液倒入新的2.0ml離心管中；
[0107]5) gDNA析出:上述離心后上清液快速充分震蕩混勻，并迅速倒入裝有13ml預(yù)冷無水乙醇的15ml離心管中；待gDNA逐漸析出，用移液器將肉眼可見的絮狀漂浮物小心地挑起，轉(zhuǎn)移至加有800 μ I gDNA洗滌液的1.5ml離心管中；
[0108]6) gDNA洗漆:收集完析出的gDNA后15000rpm高速離心10min,棄上清,可重復(fù)洗滌一次；洗滌完畢的gDNA敞口在超凈臺中開風(fēng)機放置，至gDNA洗滌液完全揮發(fā)；
[0109]7) gDNA洗脫:向揮發(fā)干的gDNA中加入100-200 μ I的gDNA洗脫液，震蕩混勻，在4°C冰箱中至gDNA完全溶解，即得到高純度全基因組DNA，于_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0110]提取的全基因組DNA提取效果用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，染料為溴化乙錠(EthidiumBromide, EB)替代物,在制膠的時候加入凝膠中。分別取3μ1 gDNA提取樣品，加入2 μ I上樣緩沖液混合點樣，并點樣5 μ I DNA分子標準品(marker)，電泳條件為120V電壓，電泳20min，電泳結(jié)果用凝膠成像系統(tǒng)(藍盾-621)觀察拍照，圖1顯示瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的全基因組DNA均為單一條帶，無拖尾和雜帶，表明提取的gDNA無其他DNA污染。
[0111]實施例三使用本發(fā)明試劑盒提取血跡中全基因組DNA
[0112]取8位臨床患者Iml抗凝血分別加入到破舊衣服中，室溫放置2-3天。將沾有血跡的布塊剪下，分別放入加有30ml紅細胞裂解液的50ml離心管中，漩渦振蕩5min，4°C放置20min后用鑷子取出布塊,盡量讓液體滴干,然后2000rpm低速離心15min ;離心后棄上
清液；
[0113]向含白細胞沉淀的50ml離心管中加入30ml的白細胞洗滌液，混勻后低速離心機，1000rpm低速離心10min,將上清液小心棄之,重復(fù)洗漆2次；其余步驟按照實施例二中步驟3-7完成，提取的全基因組DNA經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，圖2顯示瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的全基因組DNA均為單一條帶，無拖尾和雜帶，表明提取的gDNA無其他DNA污染。[0114]實施例四提取的gDNA純度檢測和定量
[0115]取實施例二和三中提取的gDNA2y I樣品，以無菌去離子水為空白，用超微量分光光度計(Spectrophotometer:NanoDrop2000)測定波長為 230nm、260nm 和 280nm 的吸光度值，即A230、A260和A280，按照NanoDrop2000儀器使用說明書進行測定。利用純dsDNA的A260/A280和A260/A230比值，評估提取DNA的純度，以及按照dsDNA的換算公式:DNA含量(μ g/mL 全血)=A260 X 50 μ g/ml X 10 (稀釋倍數(shù))X 50 (50 μ I DNA 溶液)/1000 (用于DNA提取的全血量為ΙΟΟΟμ 1)，計算提取的DNA含量，本發(fā)明的試劑盒及其方法提取得到的gDNA純度和含量測定見表一。
[0116]表一:
[0117]
【權(quán)利要求】
1.一種用于從血液中提取高純度全基因組DNA的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括紅細胞裂解液、白細胞洗滌液、消化液、蛋白酶K、純化液、gDNA鹽析液、gDNA洗滌液及gDNA洗脫液；采用所述試劑盒提取血液中全基因組DNA時，不用事先對血液中進行血漿和血清分離，只需取新鮮或冰凍的抗凝全血。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，各組成分別為: 1)紅細胞裂解液:滅菌的去離子超純水，400ml/瓶； 2)白細胞洗滌液:體積比為0.1 %的聚乙二醇辛基苯基醚(Triton-XlOO)，300ml/瓶； 3)消化液:含lmol/L三羥甲基氨基甲烷(Tris-HCl)，0.5mol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，0.2mol/L NaCl，質(zhì)量體積比為10g/ml的十二烷基硫酸(SDS)，40ml/支； 4)蛋白酶K:為20mg/ml的蛋白酶K, Iml/支； 5)純化液:為5-7.5mol/L的氯化鋰(LiCl)，40ml/瓶；
6)gDNA鹽析液:無水乙醇，500ml/瓶； 7)gDNA洗滌液:體積比為80%的乙醇，40ml/瓶；
8)gDNA 洗脫液:含 lmol/L Tris-HCl, 0.5mol/L EDTA，10ml/支。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述gDNA提取試劑盒組份可用于Iml血量的50次血液中全基因組DNA提取，并可組成100次、200次和500次gDNA提取試劑盒，含使用說明書一份，試劑盒保存在4°C冰箱。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的試劑盒，其特征在于，所述純化液優(yōu)選地為7.5mol/L的氯化鋰(LiCl)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述的試劑盒，其特征在于，將提取得到的所述gDNA采用瓊脂糖凝膠電泳檢測，該瓊脂糖凝膠電泳檢測為單一條帶，無拖尾和雜帶。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述的試劑盒，其特征在于，將提取得到的所述gDNA采用超微量分光光度計檢測，檢測結(jié)果為A260/A280比值大于1.8，無蛋白和酚類物質(zhì)污染；A260/A230的比值大于2.0，無碳水化合物、鹽類或有機溶劑污染。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項所述的試劑盒，其特征在于，將提取得到的所述gDNA采用超微量分光光度計檢測，超微量分光光度計檢測Iml血量提取的gDNA效率達到20μ g/ml以上；滿足所有基因研究和檢測的樣品要求。
8.根據(jù)權(quán)利要求2-7任一項所述的試劑盒，其特征在于，所述滅菌的去離子超純水的電阻率大于18ΜΩ*αιι;所述Tris-HCl、EDTA的pH值均為8.0。
9.一種采用權(quán)利要求1-8任一項所述的試劑盒從血液中提取高純度全基因組DNA的方法，其特征在于，其包括以下步驟: 1)血液紅細胞裂解:先向每個15ml離心管中加入等于血液樣本8倍體積的紅細胞裂解液，將血液樣本加入該離心管中，手動振蕩混勻，4°C放置20~30min后2000rpm低速離心15min ;離心結(jié)束后，將上清液棄之； 2)白細胞洗滌:向含白細胞沉淀的15ml離心管中加入2~3ml的白細胞洗滌液，混勻后放入低速水平離心機,2000rpm低速離心15min，將上清液小心棄之，重復(fù)洗滌一次； 3)白細胞消化裂解:取0.2ml蛋白酶K加入到消化液中混勻，向每一份白細胞沉淀中加入700 μ I消化液與蛋白酶K的混合溶液，吹打混勻后，轉(zhuǎn)移至2.0ml離心管中，56°C水浴2_3h，沉淀消失后37°C水浴過夜；4)細胞雜質(zhì)沉淀:向水浴過夜后的混合液中分別加入800μ I純化液，振蕩混勻，放入-20°C冰箱30min-lh ;然后13000rpm高速離心10min,將離心后的上清液倒入新的2.0ml離心管中； 5)gDNA析出:將上述離心后的上清液快速充分震蕩混勻，并迅速倒入裝有13ml預(yù)冷無水乙醇的15ml離心管中；待gDNA逐漸析出，用移液器將肉眼可見的絮狀漂浮物挑起，轉(zhuǎn)移至加有800 μ I gDNA洗滌液的1.5ml離心管中； 6)gDNA洗滌:收集完析出的gDNA后15000rpm高速離心10min，棄上清，可重復(fù)洗滌一次；洗滌完畢的gDNA敞口在超凈臺中開風(fēng)機放置，至gDNA洗滌液完全揮發(fā)； 7)gDNA洗脫:向揮發(fā)干的gDNA中加入100-200 μ I的gDNA洗脫液，震蕩混勻，在4°C冰箱中至gDNA完全溶解，即得到高純度全基因組DNA，于_20°C保存?zhèn)溆谩?br> 10.權(quán)利要求1-9任一項所述試劑盒在基因表達、基因測序、全基因組測序、外顯子組測序、基因突變或單核苷 酸多態(tài)性分析上的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/10GK104017800SQ201410276330
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年6月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月20日
【發(fā)明者】曾沃坦, 黃啟明, 梁辰, 陳建勛, 鄭英海 申請人:益百尚(北京)生物技術(shù)有限責(zé)任公司