一種提高半胱氨酸利用率生物合成谷胱甘肽的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種提高半胱氨酸利用率生物合成谷胱甘肽的方法和一種胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)底物結(jié)合蛋白重組質(zhì)粒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。本發(fā)明提供的胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)底物結(jié)合蛋白重組質(zhì)粒包括胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)底物結(jié)合蛋白基因fliY序列和一段合適的載體片段；這種方法的原理在于：通過在合適時間添加誘導(dǎo)劑使fliY表達(dá)而提高半胱氨酸利用率；最終發(fā)酵產(chǎn)物中谷胱甘肽的合成量顯著高于原始菌株，提高了原料利用率，可為進(jìn)一步研究生物法合成谷胱甘肽建立一個基礎(chǔ)模型。除此之外，該方法及思路可以用于其他因原料利用率低限制產(chǎn)量提高的目的產(chǎn)物，為生產(chǎn)有價值的產(chǎn)品提供了新的思路。
【專利說明】一種提高半胱氨酸利用率生物合成谷胱甘肽的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說，是關(guān)于一株提高半胱氨酸利用率的菌株高產(chǎn)谷胱甘肽的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]谷胱甘肽(Y-L-glutamyl-cysteinyl-glycine, GSH)是細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化劑和主要的非蛋白巰基化合物。在大部分動物、植物和微生物的細(xì)胞與組織中，谷胱甘肽以氧化型和還原型兩種形式存在，兩者通過谷胱甘肽還原酶保持動態(tài)平衡從而使還原型谷胱甘肽發(fā)揮有效的生化反應(yīng)。例如:谷胱甘肽通過還原，共軛或與其他非酶抗氧化劑協(xié)同以發(fā)揮抗氧化作用，清除內(nèi)生或外源的氧化物質(zhì)和親電子體，維持內(nèi)環(huán)境氧化還原穩(wěn)態(tài)并起到細(xì)胞保護(hù)作用；作為輔酶參與氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝(如Y-谷氨酰基循環(huán))，保持抗壞血酸復(fù)位狀態(tài)并形成脫氧核糖核酸類物質(zhì)和一些小分子化合物(如半胱氨酸，甘氨酸，谷氨酸)；此外，谷胱甘肽間接調(diào)控DNA的合成，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞乃至組織的生長和死亡，進(jìn)而對抗或誘發(fā)腫瘤，免疫缺陷，心血管疾病，肝腎疾病或神經(jīng)性疾病。鑒于此，谷胱甘肽大量應(yīng)用于醫(yī)藥保健，護(hù)膚美容，食品添加等行業(yè)。
[0003]目前GSH的生產(chǎn)方法主要有溶劑萃取法、化學(xué)合成法和生物酶催化法和生物發(fā)酵法。相比之下，生物發(fā)酵法具有反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)步驟簡單、成本低、轉(zhuǎn)化效率高、生產(chǎn)速率快等優(yōu)勢，是今后生產(chǎn)谷胱甘肽的主要趨勢，但目前大部分研究還停留在實(shí)驗(yàn)室階段，實(shí)現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)的國家主要是日本。
[0004]近年來基于發(fā)酵法對GSH產(chǎn)量提高的方法漸漸由傳統(tǒng)的育種策略，培養(yǎng)條件優(yōu)化和控制轉(zhuǎn)向?qū)Υx的調(diào)控和分子機(jī)制的研究，一些數(shù)理知識的引入在發(fā)酵條件優(yōu)化，發(fā)酵過程控制及動力學(xué)模型的建立上起著重要作用，近來分子生物學(xué)的發(fā)展也為研究者從分子水平探究、提高GSH產(chǎn)量提供了新思路。L-半胱氨酸是合成谷胱甘肽的前體氨基酸之一，細(xì)胞內(nèi)L-半胱氨酸的供應(yīng)不足嚴(yán)重影響了谷胱甘肽的合成速度及產(chǎn)量。因此可以采用分子生物學(xué)方法使L-半胱氨酸大量進(jìn)入細(xì)胞，最終使細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的合成量增加。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于，提供一種胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)底物結(jié)合蛋白重組質(zhì)粒，以用于構(gòu)建表達(dá)胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)底物結(jié)合蛋白的菌株。
[0006]本發(fā)明還有一個目的在于，提供一種胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)底物結(jié)合蛋白重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法。
[0007]本發(fā)明還有一個目 的在于，提供一種胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)底物結(jié)合蛋白重組質(zhì)粒的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明還有一個目的在于，提供一種過表達(dá)胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)底物結(jié)合蛋白生物合成谷胱甘肽的方法。
[0009]本發(fā)明提供的胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)底物結(jié)合蛋白重組質(zhì)粒包括胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)底物結(jié)合蛋白基因fliY序列和一個合適的載體片段；所述序列fliY如NCBI上Gene ID為948833的序列所不。
[0010]根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施例，在胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)底物結(jié)合蛋白重組質(zhì)粒中，fliY連接在一個合適的載體上，通過合適的誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)，從而使fliY過量表達(dá)，進(jìn)而使合成谷胱甘肽的前體氨基酸之一半胱氨酸可以大量的進(jìn)入細(xì)胞，最終使細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的合成量增加。
[0011]根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實(shí)施例，所述胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)底物結(jié)合蛋白重組質(zhì)粒包括一個卡那霉素抗性基因，用以篩選基因重組菌。
[0012]本發(fā)明提供的谷胱甘肽合成酶系重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法包括以下步驟:
[0013]A)PCR擴(kuò)增獲得fliY序列；
[0014]B)將 fliY 序列克隆入 pET28a。
[0015]本發(fā)明提供的胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)底物結(jié)合蛋白重組質(zhì)粒可用于構(gòu)建表達(dá)胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)底物結(jié)合蛋白的菌株。
[0016]本發(fā)明提供的方法可用于合成谷胱甘肽。
[0017]本發(fā)明提供的合成谷胱甘肽的方法通過發(fā)酵培養(yǎng)本發(fā)明提供的胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)底物結(jié)合蛋白重組菌株，合成谷胱甘肽。
[0018]使用本發(fā)明提供的質(zhì)?？梢詷?gòu)建合成谷胱甘肽大腸桿菌，可以明顯地提高半胱氨酸利用率，提高了谷胱甘肽生產(chǎn)量，降低了成本和能耗，可為進(jìn)一步研究生物法合成谷胱甘肽建立一個基礎(chǔ)模型。除此之外，該方法構(gòu)建的菌株及思路可以用于其他因原料利用率低限制產(chǎn)量提高的目的產(chǎn)物，為生`產(chǎn)有價值的產(chǎn)品提供了新的思路。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1是PCR擴(kuò)增獲得的fliY的凝膠電泳檢測結(jié)果，其中泳道I為fliY。
[0020]圖2是BL21_f IiY質(zhì)粒雙酶切的凝膠檢測結(jié)果，其中泳道I中5350bp左右的條帶為質(zhì)粒
[0021]pET-28a(+)的DNA片段，800bp左右的條帶為基因fliY的DNA片段。
[0022]圖3是質(zhì)粒pET28a_fliY的結(jié)構(gòu)示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023]以下結(jié)合具體實(shí)施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。
[0024]以下實(shí)施例中為注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，如《分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊》(New York:CoLd Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件或廠商提供的方案進(jìn)行。
[0025]在本發(fā)明的下述實(shí)施例中，使用的膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、基因組提取試劑盒均購自生工生物公司。
[0026]在本發(fā)明的下述實(shí)施例中，使用的pMD-19TSimpLe Vector,Hind III,EcoR I,TaqDNA聚合酶，T4DNA連接酶，DNA Marker,均購自TAKARA公司。
[0027]在本發(fā)明的下述實(shí)施例中，使用的表達(dá)載體pET28a、菌種E.coli BL21(DE3)、菌種E.coli K12、E.coli DH5 α，為中國藥科大學(xué)生命中心實(shí)驗(yàn)室保存，其中菌種E.coliBL21 (DE3)的 ATCC 編號為 BAA-1025?。
[0028]在本發(fā)明的下述實(shí)施例中，使用的E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞、E.coli DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，購自天根生化科技有限公司。
[0029]在本發(fā)明的下述實(shí)施例中，使用的LB培養(yǎng)基的配方為:1%胰蛋白棟，0.5%酵母浸粉，1% NaCl ;使用的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為:1%胰蛋白棟，0.5%酵母浸粉，i%NaCl。配置固體LB平板培養(yǎng)基時，按照上述配方添加2%瓊脂粉。
[0030]在本發(fā)明的下述實(shí)施例中，感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化，按照《分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊》提供的方法進(jìn)行。
[0031]實(shí)施例1表汰質(zhì)粒的構(gòu)律
[0032]1.1引物設(shè)計(jì)
[0033]根據(jù)NCBI報(bào)道的fliY序列，設(shè)計(jì)以下2條引物:
[0034]fIiYUP:GAGGAATTCATGAAATTAGCACATCTGGGA ；
[0035]fIiYDOffN:GCCAAGCTTTTATTTGGTCACATCAGCAC。
[0036]其中fliYUP和fliYDOWN用于擴(kuò)增fliY編碼區(qū)；fliYUP、fIiYDOWN上的下劃線表示在fliYUP、fIiYDOWN上分別引入的EcoR1、Hind III酶切位點(diǎn)。
[0037]1.2PCR 擴(kuò) 增 fliY 序列
[0038]抽提得到大腸桿菌E.coli K12基因組。
[0039]以大腸桿菌E.coli K12基因組為模板，分別以步驟1.1中設(shè)計(jì)的fliYUP和fliYDOffN為引物對，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，具體如下:
[0040]擴(kuò)增fliY 的反應(yīng)體系均為:10XPCR Buffer5 μ L, 2mM dNTPs5 μ L, 25mMMgS042 y L，上下游引物(10 μ M)各 lyL’E.coli BL21(DE3)基因組 DNAl μ L，Taq DNA 聚合酶I μ L，加入去離子水，至體系總體積為50 μ L。
[0041]擴(kuò)增fliY 的反應(yīng)條件:95°C 4min ；95 °C 30s，56°C 40s, 72 °C lmin，34 個循環(huán)；72°C IOmin。
[0042]PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖1所示。根據(jù)圖1的結(jié)果，獲得的產(chǎn)物的大小為801bp，符合fliY產(chǎn)物的預(yù)期大小。
[0043]1.3表達(dá)載體的構(gòu)建
[0044]1.3.1構(gòu)建預(yù)處理
[0045]使用膠回收試劑盒純化步驟1.2中獲得的PCR產(chǎn)物，然后和pMD-19T SimpLe載體，用T4DNA連接酶，于16°C連接過夜，反應(yīng)體系如下:
[0046]4 μ L 的 PCR 產(chǎn)物，I μ LpMD-19Τ SimpLe 載體，5 μ L T4DNA 連接酶。
[0047]連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α并涂布含有50 μ g/mL氨芐青霉素的固體LB平板，37°C培養(yǎng)至轉(zhuǎn)化子長出。其中E.coli DH5a是無氨芐青霉素抗性菌株，不能在含有氨芐青霉素的固體LB平板上生長，因此，平板上長出的轉(zhuǎn)化子均為轉(zhuǎn)化了 pMD-fIiY質(zhì)粒的大腸桿菌。挑取轉(zhuǎn)化子鑒定，根據(jù)鑒定結(jié)果，最終獲得質(zhì)粒pMD-fliY。
[0048]質(zhì)粒pMD-fIiY經(jīng)測序驗(yàn)證，包含fliY編碼區(qū)(fliY編碼區(qū)序列分別如SQ ID N0.1所示)，而且編碼區(qū)無氨基酸殘基突變。
[0049]1.3.2表達(dá)載體的構(gòu)建[0050]將1.3.1中雙酶切產(chǎn)物fliY凝膠回收純化，分別與EcoR I/Hind III雙酶切的表達(dá)載體pET28a連接，將連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化入宿主菌E.coli DH5 α，并涂布含有100 μ g/mL卡那霉素固體LB平板，37°C培養(yǎng)至轉(zhuǎn)化子長出。其中E.coli DH5 α是無卡那霉素抗性菌株，不能在含有卡那霉素的固體LB平板上生長，因此，平板上長出的轉(zhuǎn)化子均為轉(zhuǎn)化了 pET28a-fliY質(zhì)粒的大腸桿菌。挑取轉(zhuǎn)化子鑒定，根據(jù)鑒定結(jié)果，最終獲得質(zhì)粒pET28a-fliY0
[0051]質(zhì)粒pET28a_fliY的雙酶切鑒定:提取陽性克隆的質(zhì)粒pET28a_fliY，并用EcoRI/Hind III 進(jìn)行雙酶切，酶切體系為:EcoR Il μ L, Hind IIIl μ L，質(zhì)粒 pET28a_fliY8 μ L，IOXK Buffer2yL，補(bǔ)水至20yL。37°C酶切4小時，將酶切產(chǎn)物凝膠電泳，結(jié)果如圖2。根據(jù)圖2的結(jié)果，獲得的產(chǎn)物的大小分別為800bp和5350bp的DNA片段，符合fliY產(chǎn)物的預(yù)
期大小。
[0052]質(zhì)粒pET28a_fliY經(jīng)測序,并對測序結(jié)果進(jìn)行分析獲得pET28a_fliY質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖，結(jié)果如圖3所示。該質(zhì)粒中包含fliY編碼區(qū)(fliY編碼區(qū)序列SQ ID N0.1所示)，其中fliY編碼區(qū)置于T7啟動子、Lac操縱子之下，而且編碼區(qū)無氨基酸殘基突變。
[0053]實(shí)施例2表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化合成谷胱甘肽細(xì)菌株
[0054]將1.3.2中得到的帶有質(zhì)粒pET28a_fliY的大腸桿菌，抽提質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化入宿主菌E.coli BL21(DE3)，并涂布含有60μg/mL卡那霉素的固體LB平板，37°C培養(yǎng)至轉(zhuǎn)化子長出。其中E.coli BL21 (DE3)是無卡那霉素抗性菌株，不能在含有卡那霉素的固體LB平板上生長，因此，平板上長出的轉(zhuǎn)化子均為轉(zhuǎn)化了 pET28a-f IiY質(zhì)粒的大腸桿菌。
[0055]分別隨機(jī)挑取若干含pET28a_fliY質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，并選取一株谷胱甘肽合成量較高的大腸桿菌菌株，命名為BL21-fliY。
[0056]抽提BL21-f I iY的質(zhì)粒DNA，分別以引物f I iYUP和f I iYDOffN對上述抽提物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了長度為0.Skb的片段。經(jīng)測序驗(yàn)證，fliY的表達(dá)框已插入質(zhì)粒pET28a-fliY0
[0057]根據(jù)上述結(jié)果，質(zhì)粒pET28a_fliY已成功轉(zhuǎn)化入宿主菌E.coli BL21 (DE3)，命名為 BL21-fliY0
[0058]實(shí)施例3BL21_fliY和E.coli BL21 (DE3)搖瓶發(fā)酵谷胱甘肽
[0059]將于37°C固體LB平板上生長過夜的BL21-fliY和E.coli BL21(DE3)(原始菌，命名為BL21)的單菌落，分別接入液體LB培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)過夜。
[0060]分別取適量菌液轉(zhuǎn)接入搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)llh。其中，在適當(dāng)時間加入誘導(dǎo)劑；適時添加合適濃度的半胱氨酸并于發(fā)酵的Ilh取樣，檢測發(fā)酵產(chǎn)物中谷胱甘肽的合成量，結(jié)果表明本發(fā)明構(gòu)建的BL21-fliY工程菌產(chǎn)谷胱甘肽達(dá)522.7mg/L發(fā)酵液，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對照組E.coli BL21 (DE3)產(chǎn)谷胱甘肽193.7mg/L發(fā)酵液。
[0061]綜上所述，使用本發(fā)明提供的質(zhì)?？梢赞D(zhuǎn)化累積谷胱甘肽的原始細(xì)菌株，獲得的重組菌發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵產(chǎn)物中谷胱甘肽合成量顯著高于合成谷胱甘肽的原始細(xì)菌株
E.coliBL21 (DE3)。這說明采用本發(fā)明提供的生物合成方法，可以明顯的提高半胱氨酸利用率，提高了谷胱甘肽生產(chǎn)量，降低了成本和能耗，可為進(jìn)一步研究生物法合成谷胱甘肽建立一個基礎(chǔ)模型。除此之外，該方法構(gòu)建的菌株及思路可以用于其他因原料利用率不高限制產(chǎn)量提高的目的產(chǎn)物，為生產(chǎn)有價值的產(chǎn)品提供了新的思路。[0062]最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實(shí)施例子。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例子，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，`均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)底物結(jié)合蛋白重組質(zhì)粒，其特征在于，重組質(zhì)粒由胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)底物結(jié)合蛋白基因fliY序列和一段合適的載體片段連接而成，所述fliY序列如NCBI上Gene ID為948833的序列所示，載體片段為pET28a。
2.如權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒，其特征在于，所述fliY序列分別置于T7啟動子、Lac操縱子之下。
3.如權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒，其特征在于，所述fliY序列為來源于E.coli K12的fliY基因。
4.如權(quán)利要求1或2所述的重組質(zhì)粒，其特征在于，所述重組質(zhì)粒還包括一段抗性基因片段一卡那霉素抗性基因。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: A)PCR擴(kuò)增獲得fliY序列； B)將fliY序列克隆到合適的表達(dá)載體。
6.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的重組質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化合成谷胱甘肽的原始細(xì)菌株大腸桿菌E.coli BL21(DE3)的應(yīng)用。
7.一種提高半胱氨酸利用率生物合成谷胱甘肽的方法，其特征在于，所述方法為，將權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化合成谷胱甘肽原始細(xì)菌株大腸桿菌E.coliBL21(DE3)，獲得重組菌。·
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，通過發(fā)酵培養(yǎng)所述重組菌，并在發(fā)酵培養(yǎng)一定時間后，用誘導(dǎo)劑乳糖誘導(dǎo)胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)底物結(jié)合蛋白基因fliY的表達(dá)，提高半胱氨酸利用率，進(jìn)一步提高谷胱甘肽的合成量。
【文檔編號】C12N1/21GK103849639SQ201410116362
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2014年3月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月27日
【發(fā)明者】許激揚(yáng), 卞筱泓, 劉榮, 趙玉成, 沃龍飛, 張雪霞 申請人:中國藥科大學(xué)