一種磁性納米顆粒對核酸的提取方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種磁性納米顆粒對核酸的提取方法。該方法包括：步驟一，使用裂解緩沖液裂解樣品，得到樣品裂解液；步驟二，將5μL-100μL的磁性納米顆粒的溶液加入到20μL-100μL所得的樣品裂解液中，再加入20μL-500μL的結(jié)合緩沖液，混勻，轉(zhuǎn)移入離心管中，置磁力架上10秒-50秒，待磁性納米顆粒吸附分離核酸后，移除液體，得到吸附了核酸的磁性納米顆粒；步驟三，向吸附了核酸的磁性納米顆粒中加入50μL-200μL的洗滌緩沖液，混勻，置磁力架上10秒-50秒，待至少一次的洗滌后，移除液體；步驟四，向洗滌過后的吸附了核酸的磁性納米顆粒中加入20μL-50μL的洗脫緩沖液，混勻，置磁力架上10秒-50秒，待充分洗脫后收集洗脫液，核酸即在所得洗脫液中。本發(fā)明首次實現(xiàn)對miRNA的提取，且提取效率高。
【專利說明】一種磁性納米顆粒對核酸的提取方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種磁性納米顆粒對核酸的提取方法和應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]當(dāng)代生物學(xué)，醫(yī)學(xué)研究等已經(jīng)深入到分子水平，比如核酸層面，高效的核酸提取分離技術(shù)顯得尤為重要。比如在血清/血漿等體液中篩查miRNA腫瘤標(biāo)志物的研究，就需要一種簡單高效的miRNA提取技術(shù)。
[0003]目前最常規(guī)的技術(shù)是經(jīng)典的酚/氯仿提取方法，利用萃取的原理，分離出核酸。但是酚/氯仿這些有機溶劑對人體有巨大的毒害，對環(huán)境的影響也不利，而且操作過程復(fù)雜，結(jié)果受人為因素影響較大，不易實現(xiàn)自動化操作。
[0004]另外還有一些商業(yè)公司提供基于離心柱法的提取試劑盒，將樣品過柱，利用核酸在不同條件下和柱子的吸附能力不同，達到分離的效果。操作也比較復(fù)雜，得率偏低，不易實現(xiàn)自動化操作。
[0005]也有一些商業(yè)化的磁珠法提取試劑盒，基于納米磁珠的超高比表面積，利用靜電引力等物理特性實現(xiàn)核酸的分離純化，但是這些試劑盒的提取過程還是比較復(fù)雜，步驟繁多，而且尚未有專門針對miRNA提取的產(chǎn)品出現(xiàn)，現(xiàn)有的試劑盒的提取效果也難以讓人滿
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【發(fā)明內(nèi)容】

`[0006]鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明的目的是提出一種磁性納米顆粒對核酸的提取方法和應(yīng)用，能夠提取miRNA，能夠提高核酸的提取效率，能夠簡化操作以利于實現(xiàn)自動化提取。
[0007]本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案得以實現(xiàn):
一種磁性納米顆粒對核酸的提取方法，包括如下步驟:
步驟一，使用裂解緩沖液裂解樣品，得到樣品裂解液，其中，裂解緩沖液的用量和樣品的用量的比例關(guān)系為每40 μ L的裂解緩沖液對應(yīng)IO6細胞數(shù)量的樣品；
步驟二，將5 μ L-100 μ L的磁性納米顆粒的溶液加入到20 μ L-100 μ L所得的樣品裂解液中，再加入20μ L-500y L的結(jié)合緩沖液，混勻，轉(zhuǎn)移入離心管中，放置在磁力架上磁性分離10秒-50秒，待磁性納米顆粒吸附分離核酸后，移除液體，得到吸附了核酸的磁性納米顆粒;
步驟三，向吸附了核酸的磁性納米顆粒中加入50 μ L-200 μ L的洗滌緩沖液，混勻，放置在磁力架上磁性分離10秒-50秒，待至少一次的洗滌后，移除液體；
步驟四，向洗滌過后的吸附了核酸的磁性納米顆粒中加入20μ?-50μ L的洗脫緩沖液，混勻，放置在磁力架上磁性分離10秒-50秒，待充分洗脫后收集洗脫液，核酸即在所得洗脫液中。[0008]上述的提取方法中，樣品包括細胞、組織、石蠟切片，對于核酸游離的樣本則不需要裂解，比如血清、血漿和尿液，直接進行步驟二的操作。對于細胞樣品，需要先收集培養(yǎng)細胞，離心，去上清液，然后再加入裂解緩沖液進行步驟一的操作。對于石蠟切片需要先添加二甲苯溶解，然后離心移除二甲苯，水溶液反復(fù)清洗兩遍再再加入裂解緩沖液進行步驟一的操作。
[0009]上述的磁性納米顆粒對核酸的提取方法中，優(yōu)選的，所述裂解緩沖液包含如下組分:十二烷基硫酸鈉(SDS)0.05wt%-0.5wt%、異硫氰酸胍(GITC)0.1M-4M、蛋白酶k 10 μ g/mL-800 μ g/mL、EDTA lmmol/L-10mmol/L, NaCl 10mmol /1,-1 50mmoI /L
[0010]上述的磁性納米顆粒對核酸的提取方法中，優(yōu)選的，所述裂解緩沖液包含如下組分:十二烷基硫酸鈉0.05wt%，異硫氰酸胍0.5M，蛋白酶k 800 μ g/mL，EDTA 10mmol/L,NaCl 150mmol/L。
[0011]上述的磁性納米顆粒對核酸的提取方法中，優(yōu)選的，所述結(jié)合緩沖液包含如下組分:NaCl 0.5M-5M，異硫氰酸胍0.01M-4M，磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液調(diào)整結(jié)合緩沖液pH為 2.2-6。
[0012]上述的磁性納米顆粒對核酸的提取方法中，優(yōu)選的，所述結(jié)合緩沖液包含如下組分:NaCl 3M，異硫氰酸胍0.05M，磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液調(diào)整結(jié)合緩沖液的pH為4。
[0013]上述的磁性納米顆粒對核酸的提取方法中，優(yōu)選的，所述洗滌緩沖液包含如下組分=NaCl 0.5M-5M，異硫氰酸胍0.05M-0.5 M，乙醇10v% _70v%，磷酸緩沖液調(diào)整洗滌緩沖液 pH 為 2.2-6。
`[0014]上述的磁性納米顆粒對核酸的提取方法中，優(yōu)選的，所述洗滌緩沖液包含如下組分:NaCl 1M，異硫氰酸胍0.05M,乙醇20v%，磷酸緩沖液調(diào)整洗滌緩沖液pH為5。
[0015]上述的磁性納米顆粒對核酸的提取方法中，優(yōu)選的，所述洗脫緩沖液為pH8.0-10.0的Tris-鹽酸緩沖液。優(yōu)選的，所述洗脫緩沖液為pH10.0的Tris-鹽酸緩沖液。
[0016]上述的磁性納米顆粒對核酸的提取方法中，優(yōu)選的，所述磁性納米顆粒為納米磁珠，其直徑為100nm-30 μ m,其表面修飾基團包括羧基、氨基。
[0017]上述的提取方法中，采用的磁性納米顆粒(即納米磁珠)是核殼式聚苯乙烯磁性微球，表面修飾羧基、氨基或其它基團。但是其他類型的磁珠也可以替代使用。其原理是:納米磁珠表面攜帶的基團在結(jié)合緩沖液的條件下，表面顯正電荷，吸附帶負電荷的核酸；在洗脫液的條件下，表面顯負電荷，和核酸分離。
[0018]本發(fā)明還提供一種上所述的磁性納米顆粒對核酸的提取方法的應(yīng)用，用于提取miRNA,或用于提取RNA或DNA。
[0019]本發(fā)明的技術(shù)方案是以具有順磁性的納米磁珠為載體(比如表面羧基修飾的聚苯乙烯核殼式磁珠在低PH條件下，表面帶正電荷)，直接與待提取樣本，比如:體液(血清、血漿、尿液等等)或者細胞裂解液等，相互作用。其中帶負電荷的核酸通過靜電作用和納米顆粒形成復(fù)合物，在外磁場的作用下，實現(xiàn)復(fù)合物和待提取樣本的分離。之后在洗脫液的作用下，磁珠表面電荷轉(zhuǎn)為負電荷，和核酸電荷互斥，核酸溶解于洗脫液中，再在外磁場的作用下，實現(xiàn)磁珠和核酸的分離。最后得到的核酸溶液可以用于下游的實驗，比如RT-PCR等。
[0020]本發(fā)明的突出效果為:首次實現(xiàn)對miRNA的提取，對RNA和DNA也能提??；綠色環(huán)保，不使用酚氯仿等有毒的化學(xué)試劑；提取效率高，尤其對于miRNA等小片段核酸；簡單快捷，無需復(fù)雜設(shè)備；適合自動化提取。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1是本發(fā)明磁性納米顆粒對核酸的提取方法的流程圖；
圖2是實施例2中外源cel-mir-39的梯度提取的RT-qPCR圖(擴增曲線圖)；
圖3是實施例6本發(fā)明方法和RNeasy Plus Mini Kit提取細胞中基因U6的RNA的效率比較圖。
【具體實施方式】
[0022]以下便結(jié)合實施例附圖，對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步的詳述，以使本發(fā)明技術(shù)方案更易于理解、掌握，但本發(fā)明并不局限于此。下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。
[0023]實施例1
本實施例提供一種磁性納米顆粒對核酸的提取方法，如圖1所示(血清樣本不需要添加裂解緩沖液)，用于血清中內(nèi)源的miRNA的提取，包括如下步驟:
步驟一，取100 μ L血清樣本，加入100 μ L結(jié)合液緩沖液(包含組分:NaCl 3M，異硫氰酸胍0.05M，磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液調(diào)整結(jié)合緩沖液的pH為4)、40 μ L固含量0.5%的納米磁珠(表面羧基修飾的聚苯乙烯核殼式磁珠)，振蕩混勻后放置10分鐘，置于磁力架上磁性分離，靜置15秒，移除液體；
步驟二，加入100 μ L洗滌液緩沖液(包含組分:NaCl 1M，異硫氰酸胍0.05M，乙醇20v%，磷酸緩沖液調(diào)整洗滌緩沖液pH為5)，振蕩混勻后置于磁力架上磁性分離，靜置15秒，移除液體，重復(fù)一次；
步驟三，加入30 μ L的洗脫緩沖液(ρΗΙΟ.0的Tris-鹽酸緩沖液)，振蕩混勻后置于磁力架上磁性分離，靜置15秒，收集洗脫液，核酸即在所得洗脫液中。
[0024]取6個不同個體的血清樣本A、B、C、D、E、F，操作如上，提取產(chǎn)物用RT-qPCR方法檢測miRNA。
[0025]具體實驗數(shù)據(jù)如表1所示，表1為各個血清樣本中提取的miRNA的測得值。
[0026]表1
【權(quán)利要求】
1.一種磁性納米顆粒對核酸的提取方法，包括如下步驟: 步驟一，使用裂解緩沖液裂解樣品，得到樣品裂解液，其中，裂解緩沖液的用量和樣品的用量的比例關(guān)系為每40 μ L的裂解緩沖液對應(yīng)IO6細胞數(shù)量的樣品； 步驟二，將5 μ L-100 μ L的磁性納米顆粒的溶液加入到20 μ L-100 μ L所得的樣品裂解液中，再加入20μ L-500y L的結(jié)合緩沖液，混勻，轉(zhuǎn)移入離心管中，放置在磁力架上磁性分離10秒-50秒，待磁性納米顆粒吸附分離核酸后，移除液體，得到吸附了核酸的磁性納米顆粒; 步驟三，向吸附了核酸的磁性納米顆粒中加入50 μ L-200 μ L的洗滌緩沖液，混勻，放置在磁力架上磁性分離10秒-50秒，待至少一次的洗滌后，移除液體； 步驟四，向洗滌過后的吸附了核酸的磁性納米顆粒中加入20 μ L-50 μ L的洗脫緩沖液，混勻，放置在磁力架上磁性分離10秒-50秒，待充分洗脫后收集洗脫液，核酸即在所得洗脫液中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磁性納米顆粒對核酸的提取方法，其特征在于:所述裂解緩沖液包含如下組分:十二烷基硫酸鈉0.05wt%-0.5wt%，異硫氰酸胍0.1M-4M，蛋白酶k10 μ g/mL-800 μ g/mL, EDTA lmmol/L-10mmol/L, NaCl 10mmol /1,-1 50mmoI /L
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的磁性納米顆粒對核酸的提取方法，其特征在于:所述裂解緩沖液包含如下組分:十二烷基硫酸鈉0.05wt%，異硫氰酸胍0.5M，蛋白酶k 800 μ g/mL,EDTA 10mmol/L, NaCl 150mmol/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磁性納米顆粒對核酸的提取方法，其特征在于:所述結(jié)合緩沖液包含如下組分:NaCl 0.5M-5M，異硫氰酸胍0.01M-4M，磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液調(diào)整結(jié)合緩沖液PH為2.2-6。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的磁性納米顆粒對核酸的提取方法，其特征在于:所述結(jié)合緩沖液包含如下組分:NaCl 3M，異硫氰酸胍0.05M，磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液調(diào)整結(jié)合緩沖液的PH為4。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磁性納米顆粒對核酸的提取方法，其特征在于:所述洗滌緩沖液包含如下組分=NaCl 0.5M-5M，異硫氰酸胍0.05M-0.5 M，乙醇10v% _70v%，磷酸緩沖液調(diào)整洗滌緩沖液PH為2.2-6。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的磁性納米顆粒對核酸的提取方法，其特征在于:所述洗滌緩沖液包含如下組分=NaCl 1M，異硫氰酸胍0.05M,乙醇20v%，磷酸緩沖液調(diào)整洗滌緩沖液pH 為 5。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磁性納米顆粒對核酸的提取方法，其特征在于:所述洗脫緩沖液為PH8.0-10.0的Tris-鹽酸緩沖液，優(yōu)選的，所述洗脫緩沖液為pH10.0的Tris-鹽酸緩沖液。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磁性納米顆粒對核酸的提取方法，其特征在于:所述磁性納米顆粒為納米磁珠，其直徑為100nm-30 μ m,其表面修飾基團包括羧基、氨基。
10.一種權(quán)利要求1-9任一項所述的磁性納米顆粒對核酸的提取方法的應(yīng)用，用于提取miRNA，或用于提取RNA或DNA。
【文檔編號】C12N15/10GK103834637SQ201410104294
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年3月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月20日
【發(fā)明者】陸欣華, 代廣穎 申請人:陸欣華