檢測(cè)印度紫檀的專(zhuān)用探針、引物、基因芯片和方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了檢測(cè)印度紫檀（Pterocarpus?indicus?Wiild.）的專(zhuān)用探針、引物、基因芯片和方法。該專(zhuān)用探針是核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO.8所示的DNA片段，或者是核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO.8所示序列的反向互補(bǔ)序列的DNA片段。通過(guò)該基因芯片能夠在短時(shí)間內(nèi)對(duì)常見(jiàn)的花梨木印度紫檀進(jìn)行鑒別，實(shí)現(xiàn)了在“種”的水平上對(duì)紅木進(jìn)行的鑒定，提升了紅木鑒定的準(zhǔn)確性和分辨率。
【專(zhuān)利說(shuō)明】檢測(cè)印度紫擅的專(zhuān)用探針、引物、基因芯片和方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及檢測(cè)印度紫檀的專(zhuān)用探針、引物、基因芯片和方法。
【背景技術(shù)】
[0002]紅木是一類(lèi)外表呈紅色的優(yōu)質(zhì)硬木的統(tǒng)稱(chēng)，多產(chǎn)于熱帶亞熱帶地區(qū)，歷來(lái)就受到世界各地人民的青睞。尤其是在中國(guó)的明清兩代，經(jīng)傳統(tǒng)工藝制成的紅木家具更是創(chuàng)造了中國(guó)古典家具的典范。根據(jù)我國(guó)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB18107-2000《紅木》，“紅木”范圍確定為5屬8類(lèi)、33個(gè)主要品種。目前，傳統(tǒng)的鑒定方法依據(jù)心材顏色、氣味、管孔弦向直徑、氣干密度、射線等指標(biāo)將紅木分為八類(lèi)，鑒定結(jié)果只分辨到“類(lèi)”，很難再深入到“種”的層面進(jìn)行鑒定。
[0003]基因芯片是DNA識(shí)別技術(shù)的一種體現(xiàn)，利用芯片高通量的優(yōu)勢(shì)，可以在一張芯片上同時(shí)對(duì)多種紅木的多個(gè)DNA條形碼進(jìn)行檢測(cè)，不僅極大地提高了鑒定的準(zhǔn)確性，而且還可以區(qū)分紅木種與種之間的微小DNA差異，即基因芯片可以在“種”的水平上對(duì)不同紅木進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是，針對(duì)目前在“種”的水平上對(duì)不同紅木進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定的缺陷，提供一種檢測(cè)印度紫檀的專(zhuān)用探針、引物、基因芯片和方法，該方法能夠在“種”的水平上對(duì)印度紫檀的紅木進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。
[0005]本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方`案如下:
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案之一為:檢測(cè)印度紫檀(Pterocarpus indicus Wiild.)的專(zhuān)用探針，其是核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.8所示的DNA片段，或者是核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.8所示序列的反向互補(bǔ)序列的DNA片段。
[0007]上述探針檢測(cè)印度紫檀的靶序列是核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.5所示的DNA片段，或者是核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.5所示序列的反向互補(bǔ)序列的DNA片段。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)方案之二為:檢測(cè)印度紫檀的基因芯片，其含有所述的專(zhuān)用探針。本發(fā)明所述的基因芯片如本領(lǐng)域常規(guī)，而其上的檢測(cè)探針則是如上所述的專(zhuān)用探針。
[0009]本發(fā)明的技術(shù)方案之三為:檢測(cè)印度紫檀的裝置，其包括所述的專(zhuān)用探針或者所述的DNA芯片。本發(fā)明所述的裝置如本領(lǐng)域常規(guī)，其中，優(yōu)選的，所述的裝置還包括引物對(duì)，所述的引物對(duì)中，一條引物的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID N0.6，另一條引物的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID N0.7所示。其中，優(yōu)選的，所述的引物上含有熒光標(biāo)記。
[0010]本發(fā)明的技術(shù)方案之四為:檢測(cè)印度紫檀的引物，其是核苷酸序列如序列表中SEQID N0.6或SEQ ID N0.7所示的DNA片段。其中，優(yōu)選的，所述的引物上含有熒光標(biāo)記。
[0011]本發(fā)明的技術(shù)方案之五為:一種檢測(cè)印度紫檀的方法，包括以下步驟:[0012](I)制備待測(cè)樣本的總DNA，作為模板，用含檢測(cè)標(biāo)記的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得PCR產(chǎn)物，所述的引物對(duì)中，一條引物的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID N0.6，另一條引物的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID N0.7所示；
[0013](2)將專(zhuān)用探針結(jié)合于基因芯片的片基上，洗去未結(jié)合的探針，獲得檢測(cè)印度紫檀的基因芯片，所述的專(zhuān)用探針是核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.8所示的DNA片段，或者是核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.8所示序列的反向互補(bǔ)序列的DNA片段；
[0014](3)在步驟(2)所得的檢測(cè)印度紫檀的基因芯片中加入步驟(1)所得的PCR產(chǎn)物，進(jìn)行雜交，洗去未雜交的PCR產(chǎn)物；
[0015](4)檢測(cè)步驟(3)所得的雜交后的基因芯片。
[0016]其中，步驟(1)所述的制備待測(cè)樣本的總DNA的方法是常規(guī)的。所述PCR的擴(kuò)增方法也是常規(guī)的，較佳的PCR擴(kuò)增程序如下:95°C預(yù)熱5min ；35個(gè)循環(huán):95°C 30s, 55°C 30s，72°C 30s ;最后 72°C延伸 5min。
[0017]其中，步驟(2)所述的將專(zhuān)用探針結(jié)合于基因芯片的片基上的方法是常規(guī)的。基因芯片的片基是常規(guī)的，優(yōu)選的，所述的片基是醛基片基，所述的探針是氨基化探針。優(yōu)選的，在步驟(2)所述的基因芯片的另外的加樣孔中加入花梨木管家基因檢測(cè)探針，所述的花梨木管家基因檢測(cè)探針是常規(guī)的，優(yōu)選的是序列如序列表中SEQ ID N0.16所示序列的核苷酸片段。優(yōu)選的，在步驟(2)所述的基因芯片的另外的加樣孔中還可以加入其它試劑，如作為各種對(duì)照的試劑、檢測(cè)其他種花梨木的檢測(cè)探針等。
[0018]其中，步驟(3 )所述的雜交是常規(guī)的。
[0019]其中，步驟(4)所述的檢測(cè)方法是常規(guī)的，優(yōu)選激光共聚焦掃描儀檢測(cè)基因芯片，獲得雜交結(jié)果。優(yōu)選的，根據(jù)步驟(4)檢測(cè)所得的雜交結(jié)果評(píng)判如下:雜交結(jié)果為陽(yáng)性，則所述待測(cè)樣本為印度紫檀；雜交結(jié)果不為陽(yáng)性，則所述待測(cè)樣本不為印度紫檀。
[0020]在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí)例。
[0021]本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。
[0022]本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于:
[0023]本發(fā)明提供了鑒別印度紫檀的專(zhuān)用探針、引物、基因芯片和方法。對(duì)印度紫檀進(jìn)行DNA鑒定，在“種”的水平上對(duì)該花梨木進(jìn)行檢測(cè)和鑒定，為傳統(tǒng)的木材鑒定提供了一種新的技術(shù)和思路。
[0024]本發(fā)明的特點(diǎn)包括:
[0025](I)高通量:能同時(shí)鑒定多個(gè)印度紫檀樣品；若將多個(gè)花梨木的檢測(cè)探針置于同一芯片上，能同時(shí)鑒定多個(gè)花梨木品種；
[0026](2)準(zhǔn)確性:基于DNA差異的檢測(cè)，結(jié)果更可靠；
[0027](3)時(shí)效性:相比于傳統(tǒng)紅木鑒定耗時(shí)15天，本發(fā)明只需要8小時(shí)即可完成對(duì)紅木品種的鑒定。
[0028](4)可靠性:含有內(nèi)對(duì)照點(diǎn)，對(duì)檢測(cè)操作的準(zhǔn)確性進(jìn)行質(zhì)控。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0029]圖1為安達(dá)曼紫檀的檢測(cè)結(jié)果圖。圖中Pd為安達(dá)曼紫檀的檢測(cè)位點(diǎn)；Pi為印度紫檀的檢測(cè)位點(diǎn)；Pe為的檢測(cè)位點(diǎn)；QC為管家基因的檢測(cè)位點(diǎn)，也是芯片的質(zhì)控位點(diǎn)。
[0030]圖2為印度紫檀的檢測(cè)結(jié)果圖。圖中Pd為安達(dá)曼紫檀的檢測(cè)位點(diǎn)；Pi為印度紫檀的檢測(cè)位點(diǎn)；Pe為的檢測(cè)位點(diǎn)；QC為管家基因的檢測(cè)位點(diǎn)；也是芯片的質(zhì)控位點(diǎn)。
[0031]圖3為的檢測(cè)結(jié)果圖。圖中Pd為安達(dá)曼紫檀的檢測(cè)位點(diǎn)；Pi為印度紫檀的檢測(cè)位點(diǎn)；Pe為的檢測(cè)位點(diǎn)；QC為管家基因的檢測(cè)位點(diǎn)，也是芯片的質(zhì)控位點(diǎn)。
[0032]圖4對(duì)照組越柬紫檀的檢測(cè)結(jié)果。圖中Pc為越柬紫檀的檢測(cè)位點(diǎn)；Dc為刀狀黑黃檀的檢測(cè)位點(diǎn)；Df為絨毛黃檀的檢測(cè)位點(diǎn)；QC為管家基因的檢測(cè)位點(diǎn)，也是芯片的質(zhì)控位點(diǎn)。
[0033]圖5對(duì)照組刀狀黑黃檀的檢測(cè)結(jié)果。圖中Pc為越柬紫檀的檢測(cè)位點(diǎn)；Dc為刀狀黑黃檀的檢測(cè)位點(diǎn)；Df為絨毛黃檀的檢測(cè)位點(diǎn)；QC為管家基因的檢測(cè)位點(diǎn)，也是芯片的質(zhì)控位點(diǎn)。
[0034]圖6對(duì)照組刀絨毛黃檀的檢測(cè)結(jié)果。圖中Pc為越柬紫檀的檢測(cè)位點(diǎn)；Dc為刀狀黑黃檀的檢測(cè)位點(diǎn)；Df為絨毛黃檀的檢測(cè)位點(diǎn)；QC為管家基因的檢測(cè)位點(diǎn)，也是芯片的質(zhì)控位點(diǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0035]下面通過(guò)實(shí)施例的方式進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說(shuō)明書(shū)選擇。
[0036]實(shí)施例1靶序列的確定
[0037]根據(jù)報(bào)道的安達(dá)曼紫檀(Pteroearpus dalbergioides Benth.)、印度紫檀(Pterocarpus indicus Wii`ld.)、刺猬紫擅(Pterocarpus erinaceus Poir.)基因序列，選擇一段特異性較好、片段長(zhǎng)度適合的基因序列作為檢測(cè)的靶序列。所選取的靶序列經(jīng)過(guò)同源性比對(duì)檢索后，目前確定為一段特異性較高的DNA序列。
[0038]3種花梨木的特異性檢測(cè)靶序列分別為:
[0039]安達(dá)曼紫檀:
【權(quán)利要求】
1.檢測(cè)印度紫檀(Pterocarpusindicus Wiild.)的專(zhuān)用探針,其特征在于,其是核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.8所示的DNA片段，或者是核苷酸序列如序列表中SEQ IDN0.8所示序列的反向互補(bǔ)序列的DNA片段。
2.檢測(cè)印度紫檀的基因芯片，其特征在于，其含有權(quán)利要求1所述的專(zhuān)用探針。
3.檢測(cè)印度紫檀的裝置，其特征在于，其包括如權(quán)利要求1所述的專(zhuān)用探針或者如權(quán)利要求2所述的DNA芯片。
4.如權(quán)利要求3所述的裝置，其特征在于，所述的裝置還包括引物對(duì)，所述的引物對(duì)中，所述的引物對(duì)中，一條引物的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID N0.6，另一條引物的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID N0.7所示。
5.如權(quán)利要求4所述的裝置，其特征在于，所述的引物上含有熒光標(biāo)記。
6.檢測(cè)印度紫檀的引物，其特征在于，其是核苷酸序列如序列表中SEQID N0.6或SEQID N0.7所示的DNA片段。
7.如權(quán)利要求6所述的引物，其特征在于，所述的引物上含有熒光標(biāo)記。
8.—種檢測(cè)印度紫檀的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)制備待測(cè) 樣本的總DNA，作為模板，用含檢測(cè)標(biāo)記的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得PCR產(chǎn)物，所述的引物對(duì)中，一條引物的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID N0.6，另一條引物的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID N0.7所示； (2)將專(zhuān)用探針結(jié)合于基因芯片的片基上，洗去未結(jié)合的探針，獲得檢測(cè)印度紫檀的基因芯片，所述的專(zhuān)用探針是核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.8所示的DNA片段，或者是核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.8所示序列的反向互補(bǔ)序列的DNA片段； (3)在步驟(2)所得的檢測(cè)印度紫檀的基因芯片中加入步驟(1)所得的PCR產(chǎn)物，進(jìn)行雜交，洗去未雜交的PCR產(chǎn)物； (4)檢測(cè)步驟(3)所得的雜交后的基因芯片。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述的基因芯片的片基是醛基片基，所述的探針是氨基化探針。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述的基因芯片的另外的加樣孔中加入花梨木管家基因檢測(cè)探針，所述的花梨木管家基因檢測(cè)探針的序列如序列表中SEQID N0.16所示序列的核苷酸片段。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103820568SQ201410103718
【公開(kāi)日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2014年3月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月20日
【發(fā)明者】李瑤, 周佳海, 張穎, 壽勇明 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所, 上?；瘜W(xué)工業(yè)區(qū)醫(yī)療中心