一種解淀粉芽孢桿菌zh1及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種解淀粉芽孢桿菌ZH1及其應(yīng)用，屬于微生物領(lǐng)域，該解淀粉芽孢桿菌（Bacillus?amyloliquefaciens?ZH1），于2014年1月22日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，分類名為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus?amyloliquefaciens），保藏號CGMCC?No.8803。該菌株能利用難溶性磷酸鹽為磷源進行生長，提高肥料的利用率，促進植物根系發(fā)育和對肥料的吸收，增加土壤有效磷含量。
【專利說明】一種解淀粉芽孢桿菌ZH1及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種微生物，具體地說涉及一種解淀粉芽孢桿菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]我國南方紅壤地區(qū)占全國土地總面積20%以上，人口占全國40%，耕地占全國的30%。紅壤地區(qū)是我國主要糧食產(chǎn)區(qū)和熱帶-亞熱帶經(jīng)濟作物一橡膠、油棕、咖啡、可可、柑橘、茶葉、油桐。桑蠶的主要產(chǎn)區(qū)，歷來在我國農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和生態(tài)環(huán)境建設(shè)中發(fā)揮著重要作用。雖然該地區(qū)具有豐富的光、熱、水、土和生物資源，但紅壤質(zhì)量的退化已成為限制這一地區(qū)農(nóng)業(yè)持續(xù)發(fā)展的障礙因素。
[0003]在土壤中許多微生物能夠溶解難溶態(tài)磷，促進植物對磷的吸收，增加作物產(chǎn)量和改善作物品質(zhì)，將解磷微生物作為生物肥料，不但可以提高土壤中磷的利用效率，節(jié)肥增產(chǎn)，而且可改善土壤結(jié)構(gòu)，提高土壤有機質(zhì)含量。植物促生菌(Plant Growth PromotingBacteria,簡稱PGPB)被界定為在一定條件下有利于植物生長的自由生活在土壤、根際、根表、葉際的細菌。這些細菌能夠固氮、溶磷、溶鐵，并產(chǎn)生植物激素，如生長素、赤霉素、細胞分裂素和乙烯。此外，它們還能提高植物的抗逆性，包括干旱、高鹽、重金屬毒害和農(nóng)藥。但現(xiàn)在大部分植物促生菌還為被馴化成可有效應(yīng)用于促進植物生長并具有較好固氮溶磷效果的菌種，未必適應(yīng)紅壤 的土壤環(huán)境。因此從紅壤中分離得到植物促生菌，和作物形成共生體系，利用生物修復(fù)改善紅壤，成為當前研究的熱點。
[0004]紅壤的主要肥力特征是酸、粘、瘦、旱，施入的磷肥非常容易被紅壤中的活性鐵、鋁固定從而大大地降低了利用率。由于紅壤的肥力特點，從其他土壤中篩選出來的溶磷性細菌由于受土壤酸堿度的限制，導致溶磷效果不明顯。
[0005]基于以上因素，本實驗從供試紅壤中篩選出一株植物促生菌ZH1，通過實驗發(fā)現(xiàn)ZHl能夠適應(yīng)紅壤的生活環(huán)境，并且具有較高的解磷效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的一個目的是提供一種植物促生菌，可在紅壤環(huán)境中有效促進作物生長，并且可將難溶性磷酸鹽轉(zhuǎn)化為可被生物利用的可溶性磷酸鹽。
[0007]本發(fā)明的另一個目的是提供一種植物促生菌在花生栽培上的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實現(xiàn):
[0009]本發(fā)明的一種解淀粉芽抱桿菌(Bacillusamyloliquefaciens) ZHl,于 2014年I月22日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為CGMCCN0.8803。
[0010]所述解淀粉芽孢桿菌ZHl菌落較小為白色、隆起，邊緣整齊，表面光滑濕潤，半透明，不規(guī)則桿狀排列，產(chǎn)芽孢。
[0011]所述解淀粉芽孢桿菌ZHl的生理生化特性是:革蘭氏陽性，嚴格好氧，化能異養(yǎng)，接觸酶陽性，M.R和VP試驗陰性，淀粉水解陽性，明膠水解陽性。[0012]本發(fā)明所述的解淀粉芽孢桿菌培養(yǎng)時使用的主要氮源包括但不限于蛋白胨、酵母粉、硝酸鉀、硝酸銨、硫酸銨、尿素、丙氨酸；使用的主要碳源包括但不限于蔗糖、木糖、甘露醇、麥芽糖、乳糖、葡萄糖；使用的無機組分包括但不限于氯化鉀、氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀、磷酸三鈣、二水氯化鈣、七水合硫酸鎂、七水和硫酸亞鐵。本發(fā)明的解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵可在28~32°C，pH4~10的環(huán)境下進行。
[0013]所述解淀粉芽孢桿菌能利用難溶性磷酸鹽為磷源進行生長。
[0014]作為本發(fā)明的進一步優(yōu)化，所述解淀粉芽孢桿菌ZHl采用的碳源為蔗糖，采用的氮源為硫酸銨。利用上述碳源和氮源制得的培養(yǎng)基，培育出的解淀粉芽孢桿菌ZHl解磷能力最強。
[0015]本發(fā)明所述的解淀粉芽孢桿菌ZHl以難溶性磷酸鹽為磷源進行生長，并將其轉(zhuǎn)化為可溶性磷酸鹽。在實驗室搖瓶條件下，所述解淀粉芽孢桿菌ZHl對磷酸三鈣的轉(zhuǎn)化量達228.22mg.L—1。相對于采用接種滅活菌作為空白對照的結(jié)果，所述解淀粉芽孢桿菌ZHl對磷酸三鈣的轉(zhuǎn)化量比空白對照高出213.92mg.L—1。
[0016]本發(fā)明所述的解淀粉芽孢桿菌ZHl在促進植物生長中的應(yīng)用，優(yōu)選在促進紅壤中花生生長的應(yīng)用。通過室內(nèi)盆栽實驗，將ZHl接種到盆栽中，能夠很好的促進花生的生長，相對于對照，花生株高高出4.19cm,花生植株重高出對照的三分之一。
[0017]本發(fā)明所述的解淀粉芽孢桿菌ZHl在花生栽培上的應(yīng)用。通過室內(nèi)盆栽實驗，將ZHl接種到盆栽中，與對照相比接種解淀粉芽孢桿菌能夠提高紅壤的速效磷，促進花生的生長。
[0018]本發(fā)明所述的解淀粉芽孢桿菌ZHl在制備花生促生菌劑中的應(yīng)用。通過盆栽實驗，接種解淀粉芽孢桿菌不僅能夠促進花生的生長而去能夠促進紅壤中難溶性磷的轉(zhuǎn)化，因此可以將ZHl制備成花生促生劑應(yīng)用，既本實驗的接種解淀粉芽孢桿菌。
[0019]有益效果:本發(fā)明的一種解淀粉芽孢桿菌ZHl可將難溶性磷酸鹽轉(zhuǎn)化為可溶性磷酸鹽，提高肥料的利用率，促進植物根系發(fā)育和對肥料的吸收，增加土壤有效磷含量；本發(fā)明針對花生具有良好的促生長效果，土壤有效磷含量的提高也使得花生對磷肥的利用率更聞。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1是本發(fā)明菌株ZHl的菌落圖；
[0021]圖2表示不同裝液量對菌株ZHl解磷能力的影響；
[0022]圖3表示不同初始pH對ZHl菌株解磷能力的影響；
[0023]圖4表示不同碳源對菌株ZHl解磷能力的影響；
[0024]圖5表示不同氮源對ZHl菌株解磷能力的影響；
[0025]圖6表示種植花生30天后接種ZHl和JXl菌株對花生鮮重的影響；
[0026]圖7表示種植花生30天后接種ZHl和JXl菌株對花生株高的影響；
[0027]圖8表示種植花生30天后接種ZHl和JXl菌株對花生全P含量的影響；
[0028]圖9表示種植花生30天后接種ZHl和JXl菌株對花生根總長的影響；
[0029]圖10表示種植花生30天后接種ZHl和JXl菌株對花生根表面積的影響；
[0030]圖11表示種植花生30天后接種ZHl和JXl菌株對花生根平均直徑的影響；[0031]圖12表示種植花生30天后接種ZHl和JXl菌株對花生根尖數(shù)的影響；
[0032]圖13表示種植花生30天后接種ZHl和JXl菌株對土壤有效P含量的影響；
[0033]生物材料保藏信息
[0034]ZHl,分類命名為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens),于2014年I月22日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏號CGMCC N0.8803
[0035]根際促生菌JX1，分類命名為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens),2011年12月20日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，保藏號為CGMCC N0.5624。
【具體實施方式】
[0036]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作更進一步的說明。
[0037]實施例1
[0038]首先準備以下三種培養(yǎng)基。
[0039]LB培養(yǎng)基:蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，瓊脂20g，蒸餾水1000ml，ρΗ7.0 - 7.2，121°C滅菌，20min。
[0040]LB液體培養(yǎng)基:不加瓊脂，其它條件同上。
[0041]無機磷細菌培養(yǎng)基(ΡΚ0培養(yǎng)基):磷酸三鈣5g，葡萄糖10g，硫酸銨0.5g，氯化鈉
0.3g，七水合硫酸鎂0.3g，氯化鉀0.3g，硫酸錳0.03g,七水合硫酸亞鐵0.03g, ρΗ7.0瓊脂20g，蒸餾水 1000ml, ρΗ7.0 ~7.2。121°C滅菌，20min。
[0042]無機鹽培養(yǎng)基:硫酸銨2.0g ;磷酸二氫鈉0.5g ;磷酸氫二鉀0.5g ;七水硫酸鎂
0.2g ;二水氯化鈣 0.lg，蒸餾水 1000mL, ρΗ7.0,121°C滅菌，20min。
[0043]將從江西鷹潭紅壤生態(tài)站采取的紅壤挑根過篩后稱取IOg置于盛有100mL滅菌水的250ml的三角瓶中，在搖床中，30°C，150r.mirT1振蕩20min，靜置lOmin，得到土壤懸浮液。該土壤懸浮液中含有若干種促生菌，采用稀釋法稀釋后涂于LB培養(yǎng)基，將平板倒置，于300C，恒溫箱中培養(yǎng)24h后，挑取不同類型典型單個菌落，經(jīng)平板純化后，4°C保存在LB斜面待用。
[0044]下面再通過實驗篩選出可高效解磷的植物促生細菌。
[0045]把得到的菌株進行溶磷情況的篩選測定，將供試菌株接種于盛有30mL無機磷細菌液體培養(yǎng)基的150mL三角瓶，30°C，180r.mirT1培養(yǎng)4d后，將培養(yǎng)液裝入離心管4°C下1000Or.mirT1離心，15min。取上清液用鑰藍比色法測定有效磷含量。
[0046]通過以上測定即可篩選出溶磷能力強的菌株，如圖1所示。該菌株形成的菌落為較小為白色、隆起，邊緣整齊，表面光滑濕潤，半透明，不規(guī)則桿狀排列，產(chǎn)芽孢，株型命名為ZHl。
[0047]將上述方法篩選分離出的菌株，經(jīng)上海英俊生物工程有限公司測序，根據(jù)16SrDNA的測序結(jié)果，在http://www.ncb1.nlm.nih.gov在線查詢分析,利用Blast軟件在GenBank中與其它的16S rDNA序列進行同源性比較，選擇相近的序列與ZHl的序列用MEGAversion3軟件構(gòu)建ZHl的16SrDNA系統(tǒng)進化樹。根據(jù)該菌株的生理生化特征，鑒定為解淀粉芽抱桿菌(Bacillus amyloliquefaciens),同源性為 98%。[0048]該菌種呈革蘭氏陽性、產(chǎn)芽孢的不規(guī)則桿狀。菌落較小為白色、隆起，邊緣整齊，表面光滑濕潤，半透明。嚴格好氧，化能異養(yǎng)。最適生長溫度為30°C，接觸酶陽性。解磷能力強，達到228.22mg.L'將該菌株送交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏日期為2014年I月22日，保藏號為CGMCC N0.8803。
[0049]實施例2
[0050]好氧性試驗
[0051]把滅過菌的LB培養(yǎng)基倒入3個已滅菌的試管中，大約在2/3處，在無菌操作臺上，用接種針挑取斜面培養(yǎng)的解淀粉芽孢桿菌ZH1，穿刺接種到上述培養(yǎng)基中(必須穿刺到管底)。30°C培養(yǎng)，分別在3天至7天觀察結(jié)果。在瓊脂柱表面上生長者為好氧菌，如沿穿刺線生長者為厭氧菌或兼性厭氧菌。試驗結(jié)果表現(xiàn)，菌落沿瓊脂柱表面生長，穿刺線內(nèi)無菌落生長，為嚴格好氧。
[0052]過氧化氫酶的測定
[0053]在干凈載玻片上滴I滴3%H202，取18~24h的解淀粉芽孢桿菌ZHlLB斜面培養(yǎng)物I環(huán)，在H2O2中涂抹，若有氣泡產(chǎn)生則為陽性，否則為陰性。試驗結(jié)果為接觸酶陽性。
[0054]甲基紅試驗(M.R試驗)
[0055]a.培養(yǎng)基及試劑:蛋白胨5g,葡萄糖5g,氯化鈉5g,蒸懼水1000mL,調(diào)節(jié)pH7.0~
7.2，分裝試管，每管裝4~5mL，121°C滅菌20min。試劑:甲基紅0.1g, 95%酒精300mL，蒸餾水200mL。
[0056]b.菌種培養(yǎng)及結(jié)果觀察接種解淀粉芽孢桿菌ZHl菌株于上述培養(yǎng)液中，30°C培養(yǎng)I~2天。在培養(yǎng)液中加入幾滴甲基紅試劑，如培養(yǎng)液呈現(xiàn)紅色，為甲基紅陽性，黃色為陰性(甲基紅變色范圍4.4紅色~6.0黃色)。
[0057]試驗結(jié)果為M.R陰性。
[0058]乙酞甲基甲醇試驗(VP試驗)
[0059]a.培養(yǎng)基培養(yǎng)基同甲基紅試驗。
[0060]b.菌種培養(yǎng)及結(jié)果觀察接種與培養(yǎng)同甲基紅試驗。做VP試驗時，取解淀粉芽孢桿菌ZHl培養(yǎng)液(約2mL)和等量的40%Na0H相混合，加少量肌酸，充分振蕩2~5min后，如培養(yǎng)液出現(xiàn)紅色，即為VP陽性。
[0061]試驗結(jié)果為VP陰性。
[0062]淀粉水解試驗
[0063]a.培養(yǎng)基及試劑在肉湯蛋白胨瓊脂中添加0.2%的可溶性淀粉，分裝三角瓶，121°C滅菌20min備用。路哥氏碘液:碘片lg，碘化鉀2g，先用少量(3~5mL)蒸餾水溶解碘化鉀，現(xiàn)加入碘片，待碘完全溶解后，加水稀釋至300mL。
[0064]b.菌種培養(yǎng)及結(jié)果觀察取解淀粉芽孢桿菌ZHl菌種點接于平板上，30°C培養(yǎng)2~4天，形成菌落后，在平板上滴加路哥氏碘液，以鋪滿菌落周圍為度，平板呈藍色，而菌落周圍如有無色透明圈出現(xiàn)，說明淀粉已被水解。透明圈的大小一般說明水解淀粉能力的大小。
[0065]試驗結(jié)果為淀粉水解陽性。
[0066]明膠水解試驗
[0067]a.培養(yǎng)基及試劑蛋白胨5g，明膠120g，蒸餾水1000mL。調(diào)節(jié)ρΗ7.2~7.4，分裝試管，培養(yǎng)基高度約為4~5cm，121°C滅菌20min。[0068]b.菌種培養(yǎng)及結(jié)果觀察用穿刺法接種解淀粉芽孢桿菌ZHl在試管中央。在30°C溫箱中培養(yǎng)一個月，觀察明膠是否液化。
[0069]試驗結(jié)果為明膠水解陽性。
[0070]實施例3
[0071]為了進一步驗證實施例1得到的植物促生菌ZHl解磷能力和最適條件，下面針對不同pH、裝液量、不同碳源、不同氮源探索對解磷能力的影響。
[0072]將無機磷液體培養(yǎng)基按25ml，50ml，75ml，100ml, 150ml裝于250mL的三角瓶中，按1% (v/v)接種量接種處于對數(shù)生長期的ZHl后，置于30°C，180r -min^1搖床培養(yǎng)24h，用鑰藍比色法測定有效磷含量。結(jié)果如圖2所示，由于菌株ZHl是好養(yǎng)代謝，通氣量影響菌株解磷能力的強弱，50mL裝液量時，菌株解磷能力最強，之后隨著裝液量增大，能力變?nèi)酢?br> [0073]將無機磷培養(yǎng)基分別調(diào)節(jié)到不同的pH (4、5、6、7、8、9、10)，取50mL裝于250mL的三角瓶中，按1%(v/v)接種量接種處于對數(shù)生長期的ZHl后，置于30°C，180r -min^1搖床培養(yǎng)24h，用鑰藍比色法測定有效磷含量，結(jié)果如圖3所示，該菌種解磷能力的最適pH為4~6。
[0074]在無機磷培養(yǎng)基中(不含葡萄糖)分別加入1% (w/v)的碳源，碳源有葡萄糖、木糖、蔗糖、甘露醇、乳糖 、麥芽糖等，取50ml裝于250ml的三角瓶中，按1% (v/v)接種量接種處于對數(shù)生長期的ZHl后，置于搖床培養(yǎng)24h，用鑰藍比色法測定有效磷含量。結(jié)果如圖4所示，該菌株在供給蔗糖時，解磷能力最強，其次是葡萄糖，木糖的解磷能力最低。
[0075]在無機磷培養(yǎng)基(不包括硫酸銨)中分別加入0.1% (w/v)的氮源，氮源包括硝酸銨、硫酸銨、硝酸鉀、蛋白胨、酵母粉、尿素、丙氨酸等，取50ml裝于250ml的三角瓶中按1%(v/v)接種量接種處于對數(shù)生長期的ZHl后，置于30°C，180r.mirT1搖床培養(yǎng)24h，用鑰藍比色法測定有效磷含量。結(jié)果如圖5所示，說明取硫酸銨為氮源時，解磷能力最強。
[0076]實施例4
[0077]本發(fā)明對花生具有明顯促生長作用，下面通過盆栽試驗進行說明。
[0078]采集自然條件下O~20cm 土層的新鮮紅壤，過5mm篩，每盆裝土 200g,種植花生，調(diào)節(jié)含水量至田間最大持水量的60%，30天后采樣，用根系掃描儀(LA1600+scanner，Canada)掃描獲得根系圖像后,用根系分析軟件(Winrhizo2003b, Canada)進行相關(guān)根系指標分析，用鑰藍比色法測定土壤有效磷含量。
[0079]花生種子:花生種子進行20%雙氧水表面消毒20min，無菌水沖洗多次，催芽2d，選取發(fā)芽一致的種子備用。
[0080]接菌處理:將本發(fā)明的解淀粉芽孢桿菌ZHl接種于LB液體培養(yǎng)基，30°C，180r.mirT1搖床培養(yǎng),培養(yǎng)菌長至對數(shù)生長期,然后將菌懸液1000Or.mirT1離心10min,再用無菌水重懸同樣離心三次，接種量為IO8CFU.g'
[0081]對照處理:作為對照1，土壤不噴灑ZHl菌液，加等量無菌水。為對比溶磷性細菌的效果，接種其它溶磷性細菌(保藏號為CGMCC N0.5624的解淀粉芽孢桿菌JXl)作為對照2。
[0082]結(jié)果如圖6、圖7、圖8、圖9、圖10、圖11、圖12、圖13所示。從圖6圖7可以看
出，經(jīng)接菌處理后，植株的株高及地上部鮮重都有顯著增加，促進了花生生長；從圖8可以看出，經(jīng)接種處理后，花生植株的全磷含量較對照組明顯增加；從圖9、圖10、圖11、圖12可以看出，接種ZHl處理與不接菌處理進行對比，花生根系總長度，根平均直徑，根表面積和根尖數(shù)都顯著增加，促進了花生根系的發(fā)育；從圖13可以看出，經(jīng)接菌處理后，土壤有效磷含量有所提高。結(jié)合以上結(jié)果可以看出，本發(fā)明的解淀粉芽孢桿菌ZHl對根基的生長、發(fā)育具有明顯效果，解磷能力好，可以有效促進紅壤中作物生長發(fā)育。與接種其它溶磷菌對照，接種解淀粉芽孢桿菌ZHl效果比接種解淀粉芽孢桿菌JXl具有更好的解磷效果，對花生有更好的促進作用。通過以上結(jié)論可以看出，JXl的解磷效果以及對花生的促生作用在紅壤中作用不明顯。
[0083]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當指出:對于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護 范圍。
【權(quán)利要求】
1.解淀粉芽抱桿菌(Bacillusamyloliquefaciens) ZHl,于2014年I月22日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號CGMCC N0.8803。
2.權(quán)利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌ZHl在促進植物生長中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的解淀粉芽孢桿菌ZHl在促進紅壤中花生生長中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌ZHl在花生栽培上的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌ZHl在制備花生促生菌劑中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N1/20GK103952332SQ201410095857
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年3月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月14日
【發(fā)明者】王華平, 鄭文波, 焦加國, 李輝信, 陳雄, 閆小梅, 申飛, 劉滿強, 陳小云, 胡鋒 申請人:南京博農(nóng)生物科技有限公司