一種四重rt-pcr同時(shí)檢測(cè)多種大蒜病毒的方法及其引物組合的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種四重RT-PCR同時(shí)檢測(cè)多（10）種大蒜病毒的方法及其引物組合。具體采用四對(duì)引物，一次RT-PCR同時(shí)檢測(cè)大蒜主要病毒洋蔥黃矮病毒(OYDV),韭蔥黃條病毒(LYSV)，蔥潛隱病毒(SLV)以及青蔥X病毒屬病毒（Allexivirus，包括GarV-A、GarV-B、GarV-C、GarV-D、GarV-E、GarV-X和ShV-X）等多種大蒜病毒。因此，本發(fā)明一次檢測(cè)的病毒種類(lèi)增多，檢測(cè)效率極大提高，檢測(cè)的成本極大降低。
【專利說(shuō)明】—種四重RT-PCR同時(shí)檢測(cè)多種大蒜病毒的方法及其引物組合
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于作物病毒檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種同時(shí)檢測(cè)多種大蒜病毒的方法及其引物組合。
【背景技術(shù)】
[0002]大蒜(Allium sativum L.)屬于百合科蔥屬植物,為無(wú)性繁殖作物。大蒜具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，獨(dú)特的風(fēng)味，是消費(fèi)者喜食的調(diào)味品，在全世界廣泛種植，全球種植面積約為110萬(wàn)hm2，總產(chǎn)約為1400萬(wàn)t。隨著對(duì)大蒜藥用價(jià)值的研究和應(yīng)用的深入，大蒜已經(jīng)備受?chē)?guó)際醫(yī)學(xué)界與消費(fèi)者的青睞?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明大蒜和天然大蒜制劑有非常好的防病治病功效，大蒜具有抗菌消炎、防癌抗癌，改善肝臟機(jī)能障礙，抗衰老、提高機(jī)體免疫力，降血脂、降血壓、防動(dòng)脈硬化及血栓形成等功能。
[0003]大蒜的病毒病廣泛分布于世界各地，導(dǎo)致其產(chǎn)量減少和品質(zhì)的降低。由于大蒜通過(guò)鱗莖進(jìn)行無(wú)性繁殖，病毒在鱗莖里積累，癥狀越來(lái)越嚴(yán)重。大蒜能感染多種病毒，而且存在多種病毒的復(fù)合感染。常見(jiàn)的病毒有馬鈴薯病毒屬的洋蔥黃矮病毒(Onion yellowdwarf virus, OYDV)、韭蔥黃條病毒(Leek yellow stripe virus ，LYSV)和蔥黃條紋病毒(Shallot yellow stripe virus, SYSV)，香石竹潛隱病毒屬(Carlavirus)的大蒜普通潛隱病毒(Garlic common latent virus, GCLV),大蒜潛隱病毒(Garlic latent virus,GLV)和蔥潛隱病毒(Shallot latent virus, SLV),青蔥 X 病毒屬病毒(Allexivirus)的GarV-A、GarV-B、Ga;rV-C、Ga;rV-D、Ga;rV-E、GarV-X 和蔥病毒 X(shallot virus x , ShV-X)。Tsuneyoshi (Tsuneyoshi T, Matsumi T., Natsuaki K.Τ., Sumi S., 1998.Nucleotidesequence analysis of virus isolates indicates the presence of three potyvirusspecies in Allium plants.Archives of Virology 143:97-113.)證明 GLV 和 SLV 為同一種病毒；我國(guó)大蒜收獲面積為64萬(wàn)hm2,產(chǎn)量為1050萬(wàn)噸，占全球75%,但是我國(guó)脫毒大蒜種植面積較少，農(nóng)民多進(jìn)行留種，病毒感染嚴(yán)重；我國(guó)大蒜常見(jiàn)的病毒有洋蔥黃矮病毒(OYDV)，韭蔥黃條病毒(LYSV)，蔥潛隱病毒(SLV)和青蔥X病毒屬病毒(包括GarV_A、GarV-B, GarV-C, GarV-D, GarV-E, GarV-X和ShV-X)，而且普遍存在多種病毒復(fù)合侵染的現(xiàn)象，嚴(yán)重影響了大蒜的品質(zhì)和產(chǎn)量。
[0004] 應(yīng)用大蒜莖尖脫毒技術(shù)培育脫毒大蒜的研究很早就開(kāi)始進(jìn)行，并且都取得了一定的進(jìn)展(海燕，康明輝，何寧，等.2006.大蒜莖尖脫毒及組織培養(yǎng)研究[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，11:97-98 ;李昌華，李小川，趙美華，等.1 995.大蒜莖尖脫毒技術(shù)及組織培養(yǎng)研究[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，10 (3):20-25;于德才，李學(xué)湛，呂典秋，等.2005.大蒜莖尖脫毒及快繁研究[J].北方園藝，6:84-85 ;曲英華，高樹(shù)英明.2003.低溫處理對(duì)大蒜莖尖離體培養(yǎng)芽形成及生長(zhǎng)的影響[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，8 (4):24-26;許蕊.三種大蒜病毒的RT-PCR及多重RT-PCR檢測(cè)研究.碩士學(xué)位論文.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.)。在培育脫毒大蒜的過(guò)程中，需要對(duì)莖尖繁殖的大蒜進(jìn)行病毒檢測(cè)，以確定病毒是否脫除。目前常用的植物病毒檢測(cè)方法有生物學(xué)方法又叫指示植物法、血清學(xué)方法又叫酶聯(lián)免疫法、電子顯微鏡法、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse transcription polymerase chain reaction,RT- PCR)。生物學(xué)方法測(cè)定耗時(shí)長(zhǎng)、工作量大、靈敏度較差，不同病毒侵染后也常常表現(xiàn)出相似癥狀，顯癥反應(yīng)也會(huì)受到復(fù)合侵染的影響；血清學(xué)檢測(cè)方法在一定范圍內(nèi)可能出現(xiàn)假陰性和假陽(yáng)性的現(xiàn)象，且對(duì)于檢測(cè)樣本較小的試驗(yàn)來(lái)說(shuō)，試劑盒的成本較高；生物學(xué)方法和血清學(xué)方法的每一次檢測(cè)只能針對(duì)單種病毒，檢測(cè)效率低。電鏡法對(duì)于病毒科或?qū)僖韵碌姆诸?lèi)不能判定，且設(shè)備昂貴，樣本數(shù)量不宜過(guò)大。而RT-PCR因其特異性最強(qiáng)、靈敏度最高，已成為當(dāng)前病原檢測(cè)的首選方法，并廣泛應(yīng)用于植物病毒檢測(cè)。對(duì)于多種病毒復(fù)合侵染，可以通過(guò)多重RT-PCR方法同時(shí)檢測(cè)多種病毒，可在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)大量樣本，提高了檢測(cè)效率，降低了檢測(cè)成本，而且檢測(cè)成本低，是其他檢測(cè)方法所不能比擬的。但是大蒜病毒單重RT-PCR檢測(cè)研究較多，但多重RT-PCR研究較少。Majumder等(Majumder S., BaranwalV.K.and Joshi S.2008.Simultaneous detection of onion yellow dwarf virus andshallot latent virus in infected leavers and cloves of garlic by duplex RT-PCR? Journal of Plant Pathology, 90 (2)，371-374)建立了一種雙重 RT-PCR 同時(shí)檢測(cè)OYDV和SLV 2種病毒。許蕊等通過(guò)2個(gè)雙重RT-PCR，檢測(cè)了大蒜潛隱病毒(GLV)、韭蔥黃條病毒(LYSV)、 洋蔥黃矮病毒(OYDV)。雖然 PARK 等(Park KS, Bae YJ, Jung EJ, KangSJ.2005.RT-PCR-based detection of six garlic viruses and their phylogeneticrelationships.Journal of microbiology and biotechnology.15 (5):1110-1114.)用一個(gè)多重RT-PCR檢測(cè)GarV-X、0YDV、大蒜螨傳播的絲狀病毒(Garlic mite-bornefilamentous virus, GarMbFV)、LYSV、大蒜花葉病毒(Garlic mosaic virus, GarMV,經(jīng)序列比對(duì)實(shí)為L(zhǎng)YSV)、GLV等6種病毒，由于擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別為661、693、723、768、825、921bp，片段大小太接近，凝膠電泳后成像時(shí)661、693、723、768bp四個(gè)片段重疊在一起，也因片段大小太接近，無(wú)法根據(jù)電泳圖中的條帶大小判斷是何種病毒，給病毒檢測(cè)帶來(lái)不便，只有檢測(cè)GarV-X、GarMbFV、GarMV (LYSV),GLV的四重RT-PCR比較清楚，可以根據(jù)其片段大小，分別為661、723、825和921bp ;GarMbFV只是一個(gè)暫名病毒，這種病毒不常見(jiàn)，可能屬于青蔥X病毒屬。因此，Park建立的方法只能同時(shí)檢測(cè)常見(jiàn)病毒中的GarV-X、LYSV和GLV等病毒，而已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的青蔥X病毒屬病毒有7種,加上OYDV、LYSY和SLV病毒，常見(jiàn)的病毒有近10種。對(duì)經(jīng)莖尖繁殖的大量大蒜種進(jìn)行病毒檢測(cè)，需要RT-PCR檢測(cè)技術(shù)具有檢測(cè)的病毒種類(lèi)多、檢測(cè)步驟簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，現(xiàn)有大蒜病毒RT-PCR檢測(cè)技術(shù)存在的檢測(cè)病毒種類(lèi)較少，片段區(qū)分較難等問(wèn)題，而且由于病毒種類(lèi)太多，很難建立十重RT-PCR來(lái)檢測(cè)這10種病毒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為提高RT-PCR檢測(cè)效率，降低檢測(cè)成本，本發(fā)明根據(jù)Genbank發(fā)布的這些病毒全基因組或部分序列的保守序列，設(shè)計(jì)通用引物，旨在建立一個(gè)簡(jiǎn)單、高效、靈敏的四重RT-PCR檢測(cè)技術(shù)，同時(shí)檢測(cè)國(guó)內(nèi)發(fā)現(xiàn)的大蒜主要病毒洋蔥黃矮病毒(0YDV)，韭蔥黃條病毒(LYSV)，大蒜潛隱病毒(GLV)或蔥潛隱病毒(SLV)、GarV-A、GarV-B、GarV-C、GarV-D、GarV-E,GarV-X和ShV-X等10種病毒，為研究國(guó)內(nèi)大蒜病毒病流行情況及脫毒大蒜種的病毒檢測(cè)提供技術(shù)支撐。[0006]因而，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是:針對(duì)大蒜病毒種類(lèi)較多、現(xiàn)有RT-PCR檢測(cè)方法的不足，建立一種高效的四重RT-PCR大蒜病毒檢測(cè)方法，同時(shí)檢測(cè)10種大蒜病毒。
[0007]為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:一種四重RT-PCR檢測(cè)多種大蒜病毒的方法，針對(duì)我國(guó)大蒜主要病毒的基因組保守序列設(shè)計(jì)4對(duì)通用引物，并建立四重RT-PCR反應(yīng)體系和程序，同時(shí)檢測(cè)大蒜主要病毒洋蔥黃矮病毒(OYDV)，韭蔥黃條病毒(LYSV)，蔥潛隱病毒(SLV)以及青蔥X病毒屬病毒包括GarV-A、GarV-B, GarV-C, GarV-D,GarV-E> GarV-X和ShV-X等10種大蒜病毒。
[0008]根據(jù)Genbank發(fā)布的這些病毒全基因組或部分序列的保守序列，并根據(jù)四重RT-PCR產(chǎn)物大小不同的要求，設(shè)計(jì)了四對(duì)引物具體請(qǐng)見(jiàn)表1和SEQ ID N0.1至SEQ IDN0.8,其中引物對(duì)allexivirus-?和allexivirus-?為檢測(cè)青蔥X病毒屬病毒GarV-A、GarV-B、GarV-C、GarV-D、GarV-E、GarV-X和ShV-X等7種病毒的通用引物(圖1)，片段大小均在180bp左右。
[0009]表1四重RT-PCR檢測(cè)大蒜病毒的引物及其檢測(cè)的病毒
【權(quán)利要求】
1.一種四重RT-PCR同時(shí)檢測(cè)多種大蒜病毒的方法，其特征在于，其步驟包括: 1)取大蒜葉片，提取其RNA； 2)以步驟I)得到的RNA為模板，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA； 3)以步驟2)得到的cDNA為模板，用四對(duì)引物對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增； 4)PCR產(chǎn)物凝膠電泳，根據(jù)目的片段大小及陽(yáng)性對(duì)照，判斷病毒感染情況； 其中，所述引物如下: 青蔥X病毒屬病毒的引物為:正向引物如SEQ ID N0.1所示；反向引物如SEQ ID N0.2所示； 檢測(cè)洋蔥黃矮病毒的引物為:正向引物如SEQ ID N0.3所示；反向引物如SEQ ID N0.4所示； 檢測(cè)韭蔥黃條病毒的引物為:正向引物如SEQ ID N0.5所示；反向引物如SEQ ID N0.6所示； 檢測(cè)大蒜潛隱病毒和蔥潛隱病毒的引物為:正向引物如SEQ ID N0.7所示；反向引物如 SEQ ID N0.8 所示。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:四重PCR檢測(cè)的反應(yīng)體系，按50μ I計(jì):2Χ PCR mix 25 μ 1、模板(cDNA)4 μ 1、四對(duì)引物的正向引物和反向引物各2 μ 1、超純水補(bǔ)至所需體積。
3.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于四重PCR檢測(cè)的PCR程序:92°C2min預(yù)變性后，40 個(gè)循環(huán)參數(shù)為，92°C 30s，42.5-45.6°C退火 30s，72°C lmin，最后 72°C IOmin0
4.按照權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的方法，其可以同時(shí)檢測(cè)國(guó)內(nèi)發(fā)現(xiàn)的大蒜主要病毒洋蔥黃矮病毒(OYDV)，韭蔥黃條病毒(LYSV)，蔥潛隱病毒(SLV)、GarV-A、GarV-B、GarV-C、GarV-D、GarV-E、GarV-X 和 ShV-X。
5.一種用于四重RT-PCR同時(shí)檢測(cè)多種大蒜病毒的引物對(duì)組合，其特征在于:其由四對(duì)引物組合而成，所述引物分別如下: 青蔥X病毒屬病毒的引物為:正向引物如SEQ ID N0.1所示；反向引物如SEQ ID N0.2所示； 檢測(cè)洋蔥黃矮病毒的引物為:正向引物如SEQ ID N0.3所示；反向引物如SEQ ID N0.4所示； 檢測(cè)韭蔥黃條病毒的引物為:正向引物如SEQ ID N0.5所示；反向引物如SEQ ID N0.6所示； 檢測(cè)大蒜潛隱病毒和蔥潛隱病毒的引物為:正向引物如SEQ ID N0.7所示；反向引物如 SEQ ID N0.8 所示。
6.按照權(quán)利要求5所述的引物對(duì)組合，其可以用于同時(shí)檢測(cè)國(guó)內(nèi)發(fā)現(xiàn)的大蒜主要病毒洋蔥黃矮病毒(OYDV)、韭蔥黃條病毒(LYSV)、蔥潛隱病毒(SLV)、GarV-A、GarV-B、GarV-C、GarV-D、GarV-E、GarV-X 和 ShV-X。
7.—種檢測(cè)青蔥X病毒屬病毒的引物對(duì)，其特征在于:正向引物如SEQ ID N0.1所示；反向引物如SEQ ID N0.2所示。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103911461SQ201410092027
【公開(kāi)日】2014年7月9日 申請(qǐng)日期:2014年3月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月13日
【發(fā)明者】胡新喜, 熊興耀, 雷艷, 汪沛, 何長(zhǎng)征, 宋勇, 湯琳菲 申請(qǐng)人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)