變異鏈球菌rnc基因突變株及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株長鏈狀、低致齲能力的變異鏈球菌（Streptococcusmutans）rnc基因突變株及其在預(yù)防齲病方面的應(yīng)用。該突變菌株通過變異鏈球菌UA159構(gòu)建、篩選和鑒定而獲得，保藏編號為：CCTCCM2013211,分類命名為StreptococcusmutansHT120211。本發(fā)明變異鏈球菌rnc基因突變株可制成微生態(tài)制劑，作為變異鏈球菌的替代菌株，調(diào)整口腔菌群失調(diào)，減少高致齲能力的變異鏈球菌數(shù)量，預(yù)防齲病的發(fā)生。
【專利說明】變異鏈球菌rnc基因突變株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一株通過變異鏈球菌UA159構(gòu)建、篩選和鑒定而獲得的長鏈狀、低致頻能力的變異鏈球菌(Streptococcusmutans)rnc基因突變株及其在預(yù)防頻病方面的應(yīng)用。該變異鏈球菌rnc基因突變株可制成微生態(tài)制劑，作為變異鏈球菌的替代菌株，調(diào)整口腔菌群失調(diào)，減少高致齲能力的變異鏈球菌數(shù)量，預(yù)防齲病的發(fā)生，屬于齲病預(yù)防【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]齲病發(fā)病率高，是最常見的人類感染性疾病之一，WHO調(diào)查發(fā)現(xiàn)全球約有50億人患有齲病。在我國，2005年全國第三次口腔流行病學(xué)調(diào)查顯示，5歲兒童的患齲率約為66 %，中年人群為88.1 %，65歲以上老年人群則高達(dá)98 %，但齲病的治療率則不足10 %。5歲組乳牙齲齒個數(shù)3.5顆(dmft)，35-44歲組恒牙齲齒個數(shù)4.51顆(DMFT)，65-74歲組恒牙齲齒個數(shù)14.65顆(DMFT)。
[0003]變異鏈球菌是與齲病發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切的主要致齲菌。它通過代謝口腔內(nèi)的碳水化合物產(chǎn)酸、導(dǎo)致牙菌斑生物膜的PH值下降來抑制其他共生菌的生長，從而奠定自己在生物膜中的優(yōu)勢地位。變異鏈球菌通過生物膜的形成，依靠細(xì)胞外基質(zhì)的保護和其他信號傳導(dǎo)通路來應(yīng)對環(huán)境變化帶來的壓力。其分泌的葡糖基轉(zhuǎn)移酶和果糖基轉(zhuǎn)移酶可以有效合成細(xì)胞外多糖，一方面促進細(xì)菌與牙齒表面的黏附，一方面為其他的細(xì)菌的定植提供結(jié)合位點，促進穩(wěn)定生物膜的形成。變異鏈球菌的主要致齲毒力因子主要包括其產(chǎn)酸、耐酸、胞外多糖合成、生物膜形成能力等。 [0004]rnc基因是近年來在其他細(xì)菌中被廣泛研究的基因。其在大腸桿菌中編碼雙鏈RNA特異性的內(nèi)切核糖核酸酶RNase III，參與編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子gadX-gadW的mRNA處理過程，從而控制大腸桿菌對酸的反應(yīng)。RNase III還被認(rèn)為影響一些噬菌體、質(zhì)粒和細(xì)胞基因的表達(dá)，在RNA處理、轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)控制、防御病毒入侵方面起著非常重要的作用。在天藍(lán)色鏈霉菌中，RNase III被認(rèn)為與孢子的形成和抗生素的產(chǎn)生有關(guān)。盡管RNaseIII在一些細(xì)菌內(nèi)的生理功能被大量研究，但是在變異鏈球菌中存在的編碼RNase III酶的rnc基因的功能并未被研究。其是否參與變異鏈球菌的一些生物學(xué)特性的調(diào)控，是否與變異鏈球菌致齲性有關(guān)尚不清楚。
[0005]迄今為止尚未見到有關(guān)變異鏈球菌rnc基因突變菌株的構(gòu)建及其在防治齲病中的應(yīng)用的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對上述齲病高發(fā)，且沒有特效藥物防治的現(xiàn)狀，本發(fā)明的目的是提供一株長鏈狀、低致頻能力的變異鏈球菌(Streptococcusmutans)rnc基因突變株及其在預(yù)防頻病方面的應(yīng)用。該變異鏈球菌rnc基因突變株可制成微生態(tài)制劑，作為變異鏈球菌的替代菌株，調(diào)整口腔菌群失調(diào)，減少高致齲能力的變異鏈球菌數(shù)量，預(yù)防齲病的發(fā)生。[0007]本發(fā)明的技術(shù)思路是:首先，基于齲病的防治尚無特效的藥物，且由于變異鏈球菌是口腔最常見的致齲菌，因此選擇致齲菌的變異鏈球菌作為內(nèi)源性生態(tài)防齲的突破口，實施基因突變技術(shù)對目的基因進行敲除，可穩(wěn)定地產(chǎn)生一株呈長鏈狀、低致齲能力的變異鏈球菌基因突變株；然后，采用PCR技術(shù)以及DNA測序的方法，該株鑒定為變異鏈球菌rnc基因敲除突變株；最后，對含該株細(xì)菌的培養(yǎng)液進行人類齲病動物模型的致齲試驗，結(jié)果顯示出該突變菌株具有能夠減少SPF級Vistar大鼠齲病的發(fā)生率的效果。
[0008]具體講，本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:
本發(fā)明獲得具有呈長鏈狀、低致齲能力的變異鏈球菌rnc基因突變株的方法是(見圖1):采用從位于中國四川省成都市的口腔疾病研究國家重點實驗室處獲取的變異鏈球菌UA159(以下簡稱為“S.mutans UA159”)作為父本株(注:是采用單株進行基因突變)，用BHI培養(yǎng)基培養(yǎng)后，采用PCR連接誘變技術(shù)進行突變株的構(gòu)建，得到一株抗紅霉素、呈長鏈狀、低致齲能力，能改善大鼠口腔的菌群結(jié)構(gòu)，減少大鼠齲病的發(fā)生率的變異鏈球菌的rnc基因突變菌株，然后進行產(chǎn)酸、耐酸、耐氧化、早期粘附、生物膜形成及胞外多糖形成能力以及細(xì)菌毒力相關(guān)因子的比較試驗。通過PCR擴增出突變菌株的DNA片段，經(jīng)測序，獲得目的基因序列，證實rnc基因被成功的敲除，確定該分離的菌株突變成功，該菌株為變異鏈球菌rnc基因缺失突變株(Streptococcus mutans HT120211),它擁有更長的鏈狀結(jié)構(gòu),產(chǎn)生更少的致齲毒力因子，已于2013年5月16日送交位于湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏日期為2013年5月16日，保藏編號為=CCTCCN0:M2013211o
[0009]本發(fā)明變異鏈球菌rnc基因突變株Streptococcus mutans HT120211 (以下文章中簡稱為 “Str印tococcus mutans HT12021ICCTCC M2013211”,圖片中簡稱“HT100211” )按照常規(guī)甘油冷凍方法保 藏。
[0010]本發(fā)明也提供“Str印tococcus mutans HT12021ICCTCC M2013211” 在人類齲病大鼠模型中和父本株變異鏈球菌UA159的致齲能力的差異比較。
[0011]分別使用過夜培養(yǎng)的S.mutans UA159 和 Streptococcus mutans HT12021ICCTCCM2013211菌液，感染SPF級Wistar大鼠細(xì)菌接種成功后，大鼠繼續(xù)喂養(yǎng)3周，處死，取下頜骨，包埋、對下頜磨牙進行切片觀察，照改良的Keyes法對齲壞數(shù)目及齲壞程度進行分級，并記錄分析。結(jié)果表明 Streptococcus mutans HT12021ICCTCC M2013211 具有與 S.mutansUA159完全不同的致頻能力，突顯出本發(fā)明Streptococcus mutans HTl 2021ICCTCCM2013211具有減少人類齲病大鼠模型窩溝釉質(zhì)齲損和牙本質(zhì)淺層齲損的發(fā)生率的作用和效果。
[0012]本發(fā)明具有以下效果:
(I)本發(fā)明對變異鏈球菌UA159在正常條件下采用PCR連接誘變技術(shù)，通過基因重組，使紅霉素抗性基因定點替換目的基因rnc，然后經(jīng)過抗性培養(yǎng)基篩選，PCR+瓊脂糖電泳、RT-PCR以及DNA核苷酸測序進行驗證，從而可重復(fù)、穩(wěn)定性得到本發(fā)明的變異鏈球菌rnc基因突變株“Str印tococcus mutans HT12021ICCTCC M2013211，，。
[0013](2)本發(fā)明“Str印tococcus mutans HTUOMICCTCC M2Ol32Il'具有抗紅霉素、呈長鏈狀、致齲能力低，能改善大鼠口腔的菌群結(jié)構(gòu)，減少大鼠齲病的發(fā)生。
[0014](3)本發(fā)明“Str印tococcus mutans HTl2O2IICCTCC M2Ol32II”可制成微生態(tài)制劑(以作為本發(fā)明變異鏈球菌的替代菌株)，調(diào)整口腔菌群失調(diào)，減少高致齲能力的變異鏈球菌數(shù)量，預(yù)防齲病的發(fā)生。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]本發(fā)明的變異鏈球菌rnc基因突變株(Streptococcus mutans HT120211),已于2013年5月16日由位于武漢的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏編號為=CCTCCN0:M2013211o
[0016]圖1為本發(fā)明的技術(shù)流程圖
圖 2— 4 為本發(fā)明“Str印tococcus mutans HT12021ICCTCC M2013211”細(xì)菌形態(tài)鑒定結(jié)
果圖
圖 5 為本發(fā)明 “Str印tococcus mutans HT12021ICCTCC M2013211” 生化鑒定結(jié)果圖圖 6，7 為本發(fā)明“Str印tococcus mutans HT12021ICCTCC M201321I^PCR 片段的 1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測圖
圖 8 —13 為本發(fā)明“Streptococcus mutans HT12021ICCTCC M2013211’T1P4PCR 產(chǎn)物的測序圖譜
圖 14 為本發(fā)明 “Str印tococcus mutans HT12021ICCTCC M2013211 與變異鏈球菌UA159”生長曲線的比較圖
圖 15 為本發(fā)明 “Str印tococcus mutans HT12021ICCTCC M2013211 與變異鏈球菌UA159”產(chǎn)酸曲線的比較圖
圖 16 為本發(fā)明 “Str印tococcus mutans HT12021ICCTCC M2013211 與變異鏈球菌UA159"環(huán)境應(yīng)激耐受能力的比較圖
圖 17 為本發(fā)明 “Streptococcus mutans HT12021ICCTCC M2013211 與變異鏈球菌UA159”早期蔗糖依賴性粘附實驗實驗流程圖
圖 18 為本發(fā)明 “Str印tococcus mutans HT12021ICCTCC M2013211 與變異鏈球菌UA159”早期蔗糖依賴性粘附實驗結(jié)果圖
圖 19 為本發(fā)明 “Str印tococcus mutans HT12021ICCTCC M2013211 與變異鏈球菌UA159”在不同培養(yǎng)基(ΒΗΙ，ΒΗΙ+0.5%蔗糖，BHI+1%蔗糖)中，生物膜形成實驗實驗流程圖圖 20 為本發(fā)明 “Str印tococcus mutans HT12021ICCTCC M2013211 與變異鏈球菌UA159”在不同培養(yǎng)基(ΒΗΙ，ΒΗΙ+0.5%蔗糖，BHI+1%蔗糖)中，生物膜形成情況圖
圖 21 — 26 為本發(fā)明 “Str印tococcus mutans HT12021ICCTCC M2013211 與變異鏈球菌UA159”在不同培養(yǎng)基(ΒΗΙ，ΒΗΙ+0.5%蔗糖，BHI+1%蔗糖)中，生物膜電鏡觀察圖片
其中:圖21 — 23是變異鏈球菌UA1598hl6h24h生物膜掃描電鏡結(jié)果(ΙΟΟΟΟχ)圖；圖24—26 是變異鏈球菌 Streptococcus mutans HT12021ICCTCC M20132118hl6h24h 生物膜掃描電鏡結(jié)果(ΙΟΟΟΟχ)圖
圖 27 為本發(fā)明 “Str印tococcus mutans HT12021ICCTCC M2013211 與變異鏈球菌UA159”胞外多糖形成能力的研究圖
圖 28-29 為本發(fā)明 “Streptococcus mutans HT12021ICCTCC M2013211 與變異鏈球菌UA159”致齲毒力因子基因表達(dá)的體外研究結(jié)果圖
圖 30-31 為本發(fā)明 “Streptococcus mutans HT12021ICCTCC M2013211 與變異鏈球菌UA159”致齲毒力因子基因表達(dá)的人類齲病大鼠模型內(nèi)研究結(jié)果圖
圖 32— 34 為本發(fā)明 “Streptococcus mutans HT12021ICCTCC M2013211、變異鏈球菌UA159與空白對照”人類齲病大鼠模型中導(dǎo)致的試驗Vistar大鼠牙面齲壞圖
【具體實施方式】
[0017]實施例1:本發(fā)明 “Str印tococcus mutans HT12021ICCTCC M2013211” 的獲取與鑒定，流程見圖1
1、本發(fā)明 “Str印tococcus mutans HT12021ICCTCC M2013211” 的構(gòu)建與鑒定 1.1菌株的培養(yǎng)
從位于中國四川省成都市的口腔疾病研究國家重點實驗室處獲取的變異鏈球菌UA159 (即:Streptococcus mutans UA159,簡稱 “S.mutans UA159”)接種于牛腦心浸液(BHI)培養(yǎng)基(Sigma-Aldrich Corp, Saint Louis, MO, USA)，細(xì)菌常規(guī)傳代過夜培養(yǎng)于 DY-2型厭氧培養(yǎng)箱(37°C，5% C02,10% H2,85% N2 ;浙江，中國)待用。
[0018]1.2Streptococcus mutans HT120211 突變菌株的構(gòu)建
查閱NCBI數(shù)據(jù)庫，獲得rnc基因，及其上下游片段的DNA序列，并在rnc基因上游約500bp與rnc基因內(nèi)5’端約IOObp的片段內(nèi)設(shè)計引物(rnc_Pl, rnc_P2)擴增rnc上游片段，同樣在rnc基因下游約500bp與rnc基因內(nèi)3’端約IOObp的片段內(nèi)設(shè)計引物(rnc_P3, rnc_P4)擴增rnc下游片段。所設(shè)計引物的特異性通過NCBI Blast (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/BLAST)驗證。同時使用erm-PF/erm-PR引物對從紅霉素抗性基因盒 (ermAM cassette)中擴增紅霉素抗性片段。采用TaKaRa DNA純化回收試劑盒,按照試劑盒的操作說明書，分別對rnc-Pl/P2、rnc_P3/P4和erm-PF/erm-PR擴增的三個DNA產(chǎn)物進行純化回收。然后37°C水浴下，分別使用限制性核酸內(nèi)切酶FseI (New England Biolabs,USA)過夜酶切純化的111(3-?1?2、限制性核酸內(nèi)切酶48(31(他￥ England Biolabs, USA)過夜酶切rnc-P3P4片段；AscI和FseI對純化后的紅霉素抗性基因erm-PFPR片段進行雙酶切；酶切完成后將反應(yīng)液置于65°C水浴中15min滅活限制性核酸內(nèi)切酶，然后T4DNA連接酶(NewEnglandBiolabs, USA)連接酶切后的三個DNA片段，獲得由以上三個DNA片段連接產(chǎn)生的rnc-PlP4 片段。
[0019]取20 μ I 111(3-?1?4連接片段加入5(^ I過夜培養(yǎng)的S.mutans UA159菌液與0.5ml新鮮BHI液體培養(yǎng)基(含有終濃度為I μ g/ml變異鏈球菌感受肽CSP)中，37°C厭氧培養(yǎng)3小時進行連接片段的轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后接種于帶有紅霉素BHI平板(含終濃度10 μ g/ml紅霉素)37°C厭氧培養(yǎng)48小時，篩選得到具有紅霉素抗性的菌落。將抗性菌落分別傳代培養(yǎng)48小時，進行菌落形態(tài)和顯微鏡細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查(圖2-4)。
[0020]1.3Streptococcus mutans HT120211 突變菌株的鑒定
1.3.1Streptococcus mutans HT120211突變菌株的形態(tài)學(xué)與生化鑒定將抗性細(xì)菌接種于BHI固體培養(yǎng)基(含終濃度10 μ g/ml紅霉素)中。37°C (5% CO2,10% H2,85% N2)厭氧培養(yǎng)18h，涂片顯微鏡觀察細(xì)菌形態(tài)，確定為純培養(yǎng)后，采用反應(yīng)板快速生化實驗對變異鏈球菌Streptococcus mutans HT120211進行生化特征鑒定(圖5)。
[0021]結(jié)果顯示:連接產(chǎn)物rnc_PlP4轉(zhuǎn)化入變異鏈球菌UA159后，抗性平板篩選，成功的得到具有紅霉素抗性的單菌落(如圖2);革蘭染色鑒定為革蘭陽性長鏈狀球菌。紅霉素抗性菌株經(jīng)反應(yīng)板快速生化實驗鑒定為變異鏈球菌，能夠代謝七葉苷、精氨酸、甘露醇、山梨醇、棉子糖和密二糖。同時在液體培養(yǎng)基中，突變株與野生菌株顯示出不同的生長方式Streptococcus mutans HT120211,突變菌株呈團塊狀,懸浮于較為清亮的培養(yǎng)基內(nèi)，而野生菌株S.mutans UA159則在培養(yǎng)基內(nèi)分布均勻，顯示出均質(zhì)的混池懸液。
[0022]1.3.2Streptococcus mutans HT120211 突變菌株的 PCR 擴增及 DNA 測序鑒定 采用特異性引物對rncPl/P2、rncP3/P4、rncPl/P4對突變體基因組DNA進行擴增，反應(yīng)
產(chǎn)物純化回收后進行瓊脂糖凝膠電泳和核苷酸序列測定，以驗證紅霉素抗性片段的正確插入(圖6，圖7)。
[0023]反應(yīng)產(chǎn)物純化回收后進行核苷酸序列測定(圖8-13)，結(jié)果顯示了紅霉素抗性片段替代rnc基因，正確插入rnc編碼區(qū)域，證實了我們得到了一株新的突變株就是變異鏈球菌rnc基因突變菌株,根據(jù)國際通用命名原則,命名為Streptococcus mutans HT120211。該菌株已于2013年5月16日由中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏號為CCTCCN0:M2013211，簡稱 “Str印tococcus mutans HT12021ICCTCC M2013211”。
[0024]Streptococcus mutans生長與產(chǎn)酸能力的研究
取變異鏈球菌 UA159 和 Str印tococcus mutans HT12021ICCTCC M2013211 對數(shù)生長中期菌懸液，接種于2ml新鮮BHI液體培養(yǎng)基的12孔板中(細(xì)菌終濃度為5xl05CFU/ml)，于37°C>5% C02培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。在開始培養(yǎng)時、及每間隔lh，取出一個孔板，進行PH值與600nm波長吸光度值測定，監(jiān)測細(xì)菌生長24h。以時間點為橫坐標(biāo)值，0D600值、pH值為縱坐標(biāo)值分別繪制細(xì)菌的生長曲線與產(chǎn)酸曲線。
[0025]24 小時細(xì) 菌生長曲線(圖 14)來看，Streptococcus mutans HT12021ICCTCCM2013211與S.mutans UA159到達(dá)對數(shù)生長期的時間一致，對數(shù)生長期細(xì)菌倍增時間相同，在穩(wěn)定期突變株的細(xì)菌菌細(xì)胞要多于S.mutans UA159。由細(xì)菌生長24h產(chǎn)酸曲線(圖15)來看，突變株在對數(shù)生長期的PH值下降較UAl59要慢，最終兩者都達(dá)到PH值5.0，說明與野生菌株 S.mutans UA159 相比，Streptococcus mutans HT12021ICCTCC M2013211 細(xì)菌產(chǎn)酸速度變慢。
[0026].Streptococcus mutans HT12021ICCTCC M2013211 環(huán)境應(yīng)激耐受性的研究
通過對比 UA159 與 Streptococcus mutans HT12021ICCTCC M2013211 在酸性 pH 值 5.0環(huán)境中暴露2h、在含10 μ M過氧化氫的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)lh、含0.5M氯化鈉的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)
0.5h后細(xì)菌活力的變化，研究rnc基因?qū)ψ儺愭溓蚓退崮芰?、耐氧化壓力、耐滲透壓力的影響。
[0027]離心收集對數(shù)生長中期UA159和 Str印tococcus mutans HT12021ICCTCC M2013211細(xì)菌，重懸于2ml生長培養(yǎng)基(pH值5.0)、2ml含10 μ M過氧化氫的培養(yǎng)基、2ml含0.5M氯化鈉的培養(yǎng)基，分別厭氧37°C培養(yǎng)2h、lh和0.5h。培養(yǎng)前后分別從反應(yīng)體系吸取100 μ I菌液，梯度稀釋，螺旋接種儀接種于BHI培養(yǎng)基，厭氧37°C培養(yǎng)48h，進行活菌菌落計數(shù)。
[0028]經(jīng)三個因素分別處理后的活菌菌落計數(shù)(如圖16)結(jié)果顯示:PH值5.0暴露2h、10 μ M 過氧化氫處理 Ih 后 UA159 活菌較 Str印tococcus mutans HT12021ICCTCC M2013211多，兩者之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。0.5M氯化鈉溶液處理0.5h后，Streptococcusmutans HT12021ICCTCC M2013211活菌數(shù)較UA159多，兩者之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，說明Streptococcus mutans HT12021ICCTCC M2013211 具有更低的環(huán)境耐受力。[0029].Streptococcus mutans HT12021ICCTCC M2013211 蔗糖依賴性粘附實驗
使用 6 孔板對變異鏈球菌 UA159 和 Str印tococcus mutans HT12021ICCTCC M2013211 進
行早期表面黏附的研究。6孔板采用無菌唾液室溫預(yù)處理lh，具體實驗流程如圖17所示。
按照下列公式計算黏附細(xì)菌的百分率:
^ A 孔菌懸液(0D_)ν1ΛΛ。/
黏附細(xì)囷百分率= p ^ B、- X 100%

B孔囷懸液(ODw)
lh、2h、4h的細(xì)菌鹿糖依賴性粘附實驗結(jié)果顯示:Streptococcus mutansHT12021ICCTCC M2013211的蔗糖依賴性粘附能力較UA159低。三個時間點，兩菌株之間的差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義，如圖18所不。特別是4h時，Streptococcus mutans HT12021ICCTCCM2013211的黏附細(xì)菌百分率較UA159明顯減少。
[0030].Streptococcus mutans HT120211CCTCC M2013211 生物膜形成能力的研究
采用96孔板生物膜形成模型，對比變異鏈球菌UA159與Streptococcus mutansHT12021ICCTCC M2013211體外生物膜形成能力，分析rnc基因是否對變異鏈球菌生物膜的形成具有一定影響。實驗流程如圖19所示。
另外，將變異鏈 球菌 UA159 與 Str印tococcus mutans HT12021ICCTCC M2013211 接種于12孔板內(nèi)培養(yǎng)生物膜。孔板內(nèi)放置無菌玻片(Icmxlcm)，添加2ml BHI培養(yǎng)基(含1%蔗糖)，細(xì)菌終濃度為5xl05CFU/ml。將12孔板置于37°C厭氧培養(yǎng)8h、16h、24h后，小心吸取微孔中的液相浮游細(xì)菌細(xì)胞，然后使用PBS緩沖液洗滌生物膜3次。將生物膜玻片固定、梯度脫水、置換、干燥噴金后在掃描電子顯微鏡下進行觀察并進行圖像采集
結(jié)果發(fā)現(xiàn):96孔板生物膜形成實驗結(jié)果顯示，S.mutans UA159可以在孔板底部形成均勻致密的生物膜，而Str印tococcus mutans HT12021ICCTCC M2013211所形成的生物膜結(jié)構(gòu)，稀疏不均，形成生物膜的量較UA159明顯減少。在含0.5%蔗糖和I %蔗糖的培養(yǎng)基內(nèi)，UA159形成生物膜的量大于Str印tococcus mutans HT12021ICCTCC M2013211，兩者之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖20)。
[0031]掃描電鏡結(jié)果顯示UA159 與 Str印tococcus mutans HT12021ICCTCC M2013211 在生物膜結(jié)構(gòu)和細(xì)菌形態(tài)上存在較大不同。UA159生物膜的結(jié)構(gòu)更加致密均勻，長短鏈之間結(jié)合緊密,而Str印tococcus mutans HT12021ICCTCC M2013211生物膜內(nèi)長鏈狀的細(xì)菌排列混舌L生物膜空隙較大，生物膜厚度不及UA159 (圖21-26)。
[0032]Streptococcus mutans胞外多糖形成能力的研究
采用12孔板體外培養(yǎng)模型，在BHI液體培養(yǎng)基內(nèi)加入30mM[14C]標(biāo)記的蔗糖(0.02 μCi/ml)。37°C，厭氧培養(yǎng)24h后輕輕取出生物膜標(biāo)本，置于2ml去離子水中，無菌刮勺刮凈玻片表面生物膜，震蕩重懸，10000g4°C離心10分鐘收集上清，再次用2ml去離子水震蕩重懸重復(fù)上述操作兩次，合并上清液即為收集的水溶性多糖。沉淀用0.4M氫氧化鈉溶液2mL洗滌、離心，重復(fù)三次，合并上清，即為收集的水不溶性多糖。加入無水乙醇沉淀18h，采用孔徑0.22 μ m的玻璃纖維濾膜過濾收集多糖，閃爍計數(shù)法測胞外多糖量。
[0033]結(jié)果發(fā)現(xiàn)Str印tococcus mutans HT12021ICCTCC M2013211 生物膜內(nèi)水不溶性的胞外多糖較UA159少，兩者之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p〈0.05)(圖27)。
[0034]“Str印tococcus mutans HT12021ICCTCC M2013211 與變異鏈球菌 UAl59”致齲毒力因子基因表達(dá)的體外研究取上述菌懸液1.5ml培養(yǎng)物，加入3mlRNA穩(wěn)定劑(QIAGEN)，混勻5sec，室溫放置5min。4°C 12000rpm離心2分鐘收集菌體，仔細(xì)去除所有培養(yǎng)基上清。用含有30mg/ml溶菌酶的200 μ ITE緩沖液徹底重懸菌體，37°C孵育lOmin。采用Trizol法提取。樣品使用Nano VuePlus分光光度計測量所提取RNA的純度與濃度。按照PrimeScript RT reagent Kit WithgDNA Eraser (TaKaRa)說明書提供方法進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
[0035]根據(jù)SYBR Premix Ex Taq II (TaKaRa)說明書提供的方法進行反應(yīng)體系加樣和兩步法PCR擴增程序進行目的基因的real-time PCR擴增，擴增后獲得各目的基因Ct (cyclethreshold)值。本實驗采用相對定量的方法，通過2_“Gt法對目的基因的相對表達(dá)水平進行計算分析，獲得變異鏈球菌UA159與Streptococcus mutans HT120211目的基因的表達(dá)差異，通過獨立樣本T檢驗(independent-sample T test)方法對差異進行統(tǒng)計分析(p〈0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義)。
[0036]體外實驗中RT-PCR 結(jié)果顯不 S.mutans UA159 與 Streptococcus mutans HT120211CCTCC M2013211 相比，Streptococcus mutans HT120211CCTCC M2013211 的 gtfB、vicRKX 基因的表達(dá)水平明顯上調(diào)，gtfC、gtfD、ftf和gbpB基因的表達(dá)水平也略有上調(diào)(圖2829)。
[0037]實施例2:本發(fā)明 “Str印tococcus mutans HT12021ICCTCC M2013211” 在人類齲病大鼠模型中和父本株變異鏈球菌UA159的致齲能力的差異比較
1.人類齲病大鼠模型中，變異鏈球菌UA159和Str印tococcus mutans HT12021ICCTCCM2013211接種于IOml BHI (補充I %蔗糖)過夜培養(yǎng)后，離心，棄上清后重懸于IOml新鮮的BHI培養(yǎng)基中。吸取菌懸液1 00 μ I于2ml BHI培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至光密度值0.4(0D600)。
[0038]體內(nèi)實驗中菌株定植成功后動物連續(xù)飼養(yǎng)3周，CO2窒息法處死大鼠，取下頜骨標(biāo)本，滅菌的生理鹽水輕輕的沖洗3次。右側(cè)下頜骨室溫條件下放入裝有5mlRNA組織樣品保護液的滅菌15ml試管中l(wèi)h。超聲波細(xì)胞破碎儀將牙面上的菌斑震落(脈沖幅度10S，功率7W)，將含有頜骨的菌斑懸濁液4°C離心20min(5500g)，棄上清，小心取出頜骨，將沉淀轉(zhuǎn)移至滅菌的1.5ml離心管，用于RNA的提取。
[0039]主要儀器和分析軟件
NanoVue Plus Spectrophotometer (GE Healthcare, England)
ABI PRISM?3730XL DNA Analyzer (Applied Biosystems, USA)
1.1細(xì)菌總RNA提取與純化
取上述菌懸液1.5ml培養(yǎng)物，加入3mlRNA穩(wěn)定劑(QIAGEN)，混勻5sec，室溫放置5min。4°C 12000rpm離心2分鐘收集菌體，仔細(xì)去除所有培養(yǎng)基上清。用含有30mg/ml溶菌酶的200 μ ITE緩沖液徹底重懸菌體，37°C孵育lOmin。采用Trizol法提取RNA。按照PrimeScriptRT reagent Kit With gDNA Eraser (TaKaRa)說明書提供方法進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
[0040]1.2實時定量PCR
SYBR Green I嵌合熒光法進行Real-time PCR擴增。共擴增6個目的基因(引物序列如表1-1)，采用ABI PRISM7300按照兩步法進行PCR擴增程序。
[0041]表l-lReal-time PCR 引物序列
【權(quán)利要求】
1.一株變異鏈球菌kStreptococcusmutans')rnc基因突變株,其特征在于該菌株呈長鏈狀、低致齲能力，能改善大鼠口腔的菌群結(jié)構(gòu)，減少大鼠齲病的發(fā)生；該菌株已于2013年5月16日由中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏號為CCTCC NO: M 2013211。
2.權(quán)利要求1所述的菌株或含有該菌株的微生物制劑在防治齲病方面的應(yīng)用。
【文檔編號】C12R1/46GK103992962SQ201410082324
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年3月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月7日
【發(fā)明者】胡濤, 楊英明, 李克增, 張茹, 劉思茗, 毛夢瑩, 雷蕾, 陽燕 申請人:四川大學(xué)