一種利用趾甲提取dna擴增三線閉殼龜線粒體全長的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用趾甲提取DNA擴增三線閉殼龜線粒體全長的方法，含以下步驟：（1）選取三線閉殼龜的趾甲，預處理后，用MicroElute?Genomic?DNA?Kit試劑盒提取三線閉殼龜DNA；（2）設計能覆蓋三線閉殼龜線粒體全基因組的16對引物，以步驟（1）中提取獲得的三線閉殼龜DNA為模板，利用16對引物進行PCR擴增，將PCR擴增產物進行測序和拼接后，首次擴增獲得三線閉殼龜線粒體全長。該方法步驟簡潔，成本低，屬于非損傷性取樣，能獲得三線閉殼龜線粒體全序列。
【專利說明】一種利用趾甲提取DNA擴增三線閉殼龜線粒體全長的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于三線閉殼龜【技術領域】，具體涉及一種利用趾甲提取DNA擴增三線閉殼龜線粒體全長的方法。
【背景技術】
[0002]龜鱉類是較古老且形態(tài)最為特化的一支爬行動物，在地球上出現的最早記錄是晚三疊紀，距今已有約2.2億年的歷史，被稱為“活化石”。近幾十年來，全世界由于非法捕殺和棲息地喪失而處境危險的龜鱉種類越來越多，絕大部分已被列入瀕危野生動植物種國際貿易公約(CITES)附錄中。特別是在亞洲，作為食物、傳統藥物和寵物貿易的受害者，多數龜鱉成員在野外幾乎已絕跡，引發(fā)了國際關注的亞洲龜類危機(Asian Turtle Crisis)現象。2011年，國際生物保護學會(WCS)和龜生存聯盟(TCC)共同發(fā)布了一個“Turtles inTrouble”的專題，旨在引起全世界對龜鱉類生存現狀的重視。報道指出如果沒有強有力的保護措施，更多的淡水龜和海龜物種將在未來的十年里滅絕。
[0003]目前，關于龜鱉動物的研究主要集中在種質資源調查、形態(tài)學觀察、增養(yǎng)殖研究以及進化和系統學關系等方面。涉及分子遺傳、功能基因、物種鑒定和家系選育等分子生物學方面的研究比較少，遠不及哺乳動物、兩棲類、鳥類甚至魚類研究的深入。造成這種狀況的主要也是重要原因之一，就是研究樣本特別是取樣方式的限制。鑒于目前龜鱉的生存狀態(tài)，龜鱉分子生物學研究的樣本取樣方式值得人們關注。 [0004]三線閉殼龜(Cuora trifasciata)又名金錢龜,是樣本珍貴、極度漸危的物種,被世界自然保護聯盟(IUCN)列為極度瀕危物種并被收錄于瀕危物種貿易公約(CITES)的附錄II中。2006年以來，學術界關于三線閉殼龜(金錢龜)種的界定以及其與閉殼龜屬其它成員之間的系統進化關系都一直存在爭論。但由于非損傷性取樣提取DNA的問題一直沒有得到解決，因此對其的相關研究一直處于初級階段，甚至三線閉殼龜的線粒體全序列至今沒有報道。
[0005]目前，三線閉殼龜常用的取樣方法有三種，即傷害性取樣(destructivesampling)、非傷害性取樣(nondestructive sampling)和非損傷性取樣(noninvasivesampling)。對于一些樣本珍貴、極度瀕危甚至受法律保護的物種、需要大規(guī)模取樣的研究或者長期跟蹤的群體實驗，非傷害性及非損傷性取樣提取DNA用于后續(xù)的實驗研究，則顯得尤為重要。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種利用趾甲提取DNA擴增三線閉殼龜線粒體全長的方法，該方法步驟簡潔，成本低，屬于非損傷性取樣，能獲得三線閉殼龜線粒體全序列。
[0007]本發(fā)明的上述目的是通過以下技術方案來實現的:一種利用趾甲提取DNA擴增三線閉殼龜線粒體全長的方法，含以下步驟:
[0008](I)選取三線閉殼龜的趾甲，預處理后,用MicroElute Genomic DNA Kit試劑盒提取三線閉殼龜DNA ；
[0009](2)設計能覆蓋三線閉殼龜線粒體全基因組的16對引物，以步驟(1)中提取獲得的三線閉殼龜DNA為模板，利用16對引物進行PCR擴增，將PCR擴增產物進行測序和拼接后，首次擴增獲得三線閉殼龜線粒體全長。
[0010]在上述步驟中:
[0011]本發(fā)明步驟(1)中所述的預處理包括采用無水乙醇浸泡三線閉殼龜的趾甲以及用
IXPBS緩沖液浸泡步驟。
[0012]本發(fā)明步驟(1)中用MicroElute Genomic DNA Kit試劑盒提取三線閉殼龜DNA時，MicroElute Genomic DNA Kit試劑盒中TL Buffer初始加入量優(yōu)選為210~220 μ L ;消化時采用搖床氣浴，溫度優(yōu)選為56~60°C,轉速優(yōu)選為60~70rpm/min,時間優(yōu)選為3~5小時；洗脫液優(yōu)選為無菌蒸餾水25~50 μ L，重復洗脫2次。
[0013]本發(fā)明步驟(1)中用MicroElute Genomic DNA Kit試劑盒提取三線閉殼龜DNA時，TL Buffer初始加入量較好為220 μ L，消化時采用搖床氣浴，溫度較好為56°C，轉速較好為60rpm/min,時間較好為3~5小時,洗脫液較好為無菌蒸懼水25~50 μ L,重復洗脫2次。
[0014]本發(fā)明步驟(2)中所述的16對引物由以下序列所示的引物組成:SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5 和 SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.7 和SEQ ID N0.8,SEQ ID N0. 9和 SEQ ID N0.10,SEQ ID N0.11 和 SEQ ID N0.12,SEQ ID N0.13和 SEQ ID N0.14,SEQ ID N0.15 和 SEQ ID N0.16,SEQ ID N0.17 和 SEQ ID N0.18,SEQ IDN0.19 和 SEQ ID N0.20、SEQ ID N0.21和 SEQ ID N0.22、SEQ ID N0.23 和 SEQ ID N0.24、SEQ ID N0.25 和 SEQ ID N0.26、SEQ ID N0.27 和 SEQ ID N0.28、SEQ ID N0.29 和 SEQ IDN0.30、SEQ ID N0.31 和 SEQ ID N0.32。
[0015]本發(fā)明步驟(2)中PCR擴增時PCR反應體系包括濃度為2.5mM的dNTP2.4yL，三線閉殼龜模板DNAl μ L，濃度為10 μ mol的引物各0.5 μ L，Taq聚合酶0.5 μ L，10 XBuffer4 μ L,加水至 40 μ L。
[0016]本發(fā)明步驟(2)中PCR擴增時PCR反應條件為:95°C變性2min后，進行30個循環(huán)，每個循環(huán)的程序為:95°C變性30s，52°C~60°C退火30s，72°C延伸30s，最后72°C繼續(xù)延伸IOmin0
[0017]本發(fā)明步驟(2)中獲得的三線閉殼龜線粒體全長為16675bp，其核苷酸序列如SEQID N0.33 所示。
[0018]本發(fā)明以三線閉殼龜(Cuora trifasciata)為對象,探討了采集趾甲樣本提取DNA作為分子生物學研究的可行性，并以趾甲提取的DNA為模板，首次擴增獲得了三線閉殼龜完整線粒體基因組全序列，為三線閉殼龜的物種管理和保育研究以及其它龜鱉動物的相關研究和保護提供借鑒。
[0019]與現有技術相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點:
[0020](I)不受樣本限制，活體和標本DNA含量都相對較高，可以滿足實驗需求；
[0021](2)對標本外觀影響不大，對動物個體無傷害或者傷害輕微，屬于非傷害性取樣或者非損傷性取樣(半年內，所采集的240只個體無一例死亡)；
[0022](3)保存運輸簡單，運輸時間相對較長；[0023](4)提取方法簡單，可使用試劑盒大批量的提取群體樣本DNA ；
[0024](5)提取獲得的DNA，可以擴增線粒體全序列；
[0025](6)可修復性強、可再生、可多次取樣，對試驗樣本珍貴或需要大量群體樣本的采集實驗來說，可以大量節(jié)約成本。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1是實施例1中趾甲DNA提取的電泳結果，N1-N8分別對應表2中的樣本編號；
[0027]圖2是實施例1中DNA樣本梯度稀釋TF片段PCR擴增結果，其中M為DL2000 (Takara) 1-6 為 N7 稀釋 20、50、100、150、200 倍，7-12 為 N3 稀釋 20、50、100、150、200倍，13-18 為 N8 稀釋 20、50、100、150、200 倍。
【具體實施方式】
[0028]實施例1
[0029]本實施例提供的利用趾甲提取DNA擴增三線閉殼龜線粒體全長的方法，含以下步驟:
[0030](I)趾甲取樣
[0031]用手術剪剪取三線閉殼龜的趾甲，無水乙醇浸泡保存于-20°C，待用；
[0032](2)基因組DNA的`提取
[0033]提取DNA前，趾甲用I X PBS緩沖液4 V浸泡過夜，期間換洗2~3次。取樣本趾甲各約 10 ~20mg，用 MicroElute Genomic DNA Kit (OMEGA，USA)試劑盒提取 DNA，①將趾甲樣本加入到1.5mL離心管中，加入210~220 μ L的TLBuffer ;②將趾甲樣本盡量剪碎，加入20 μ L的OB溶液；③置于溫度為轉速為60~70rpm/min的搖床氣浴，56~60°C消化3~5小時；@ 20，OOOxg離心2min，取上清；⑤加入220 μ L的BL Buffer，混合后70°C水浴IOmin ;⑥加入220 μ L無水乙醇,混合15秒后過結合柱,8，OOOxg離心Imin,倒掉廢液；⑦加入500 μ L的HB Buffer, 8, OOOxg離心Imin,倒掉廢液；⑧加入650 μ L的DNA WashBuffer, 8, OOOxg離心lmin,倒掉廢液,重復兩次；⑨空柱36，OOOxg離心2min,空氣中室溫干燥3min ;⑩無菌蒸餾水25~50 μ L，洗脫液DNA，可重復洗脫2次。
[0034](3) DNA質量檢測
[0035]提取的樣本DNA使用0.7%瓊脂糖凝膠電泳(樣本DNA5 μ L，marker5 μ L)以及微型分光光度計(樣本DNA1.6 μ L)檢測樣本DNA質量、純度和濃度。
[0036]把樣本DNA分別稀釋20、50、100、150、200倍后，取IyL用一對轉鐵蛋白基因(Transferrin，TF)保守序列區(qū)的引物 TFF(5' -GTAACCTGTGGACTTCC ATTCC-3')和 TFR(5' -CAAATTTCATGACCACCTGCC-3')做PCR檢測，檢測趾甲提取的DNA可稀釋倍數，PCR反應結果使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(樣本DNA3uL, marker5uL)。
[0037](4)線粒體DNA全序列擴增
[0038]根據已知的閉殼龜屬其他物種(潘氏閉殼龜、金頭閉殼龜、黃額閉殼龜、黃緣閉殼龜以及鋸緣箱龜等)的線粒體全序列，用DNASTAR和ClustalXl.8進行對比，并用primer5.0設計連續(xù)的、有重疊區(qū)的、可覆蓋三線閉殼龜線粒體全基因組的引物16對(見表1)考慮到當前的測序能力，PCR產物長度均不超過1600，PCR反應體系為40μL:dNTP (2.5mM) 2.4 μ L,模板 DNAl μ L,弓 I 物(IOymol)各 0.5 μ L，Taq 聚合酶 0.5 μ L，10父81^€64 4 1^，加水至4(^1^ PCR反應條件為:95°C變性2min后，進行30個循環(huán)，程序為:95°C變性30s，52°C _60°C退火30s，72°C延伸30s，最后72°C繼續(xù)延伸IOmin0 PCR反應產物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(樣本DNA3uL，marker5uL)，并經純化試劑盒Gel ExtractPurification Kit (Omega, USA)純化后，委托上海生工公司進行測序。
[0039]表1用premier5.0設計的可覆蓋三線閉殼龜線粒體全基因組的引物
【權利要求】
1.一種利用趾甲提取DNA擴增三線閉殼龜線粒體全長的方法，其特征是含以下步驟: (1)選取三線閉殼龜的趾甲，預處理后，用MicroEluteGenomic DNA Kit試劑盒提取三線閉殼龜DNA ； (2)設計能覆蓋三線閉殼龜線粒體全基因組的16對引物，以步驟(1)中提取獲得的三線閉殼龜DNA為模板，利用16對引物進行PCR擴增，將PCR擴增產物進行測序和拼接后，首次擴增獲得三線閉殼龜線粒體全長。
2.根據權利要求1所述的利用趾甲提取DNA擴增三線閉殼龜線粒體全長的方法，其特征是:步驟(1)中所述的預處理包括采用無水乙醇浸泡三線閉殼龜的趾甲以及用IXPBS緩沖液浸泡步驟。
3.根據權利要求1所述的利用趾甲提取DNA擴增三線閉殼龜線粒體全長的方法，其特征是:步驟(1)中用MicroElute Genomic DNA Kit試劑盒提取三線閉殼龜DNA時，MicroElute Genomic DNA Kit試劑盒中TL Buffer初始加入量為210~220 μ L ;消化時采用搖床氣浴，溫度為56~60°C,轉速為60~70rpm/min,時間為3~5小時；洗脫液為無菌蒸餾水25~50 μ L，重復洗脫2次。
4.根據權利要求1所述的利用趾甲提取DNA擴增三線閉殼龜線粒體全長的方法，其特征是:步驟(2)中所述的16對引物由以下序列所示的引物組成:SEQ ID N0.1和SEQ IDN0.2、SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5 和 SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.7 和 SEQ IDN0.8,SEQ ID N0.9和 SEQ ID N0.10,SEQ ID N0.11和 SEQ ID N0.12,SEQ ID N0.13和 SEQID N0.14、SEQ ID N0.15 和 SEQ ID N0.16、SEQ ID N0.17 和 SEQ ID N0.18、SEQ ID N0.19和 SEQ ID N0.20,SEQ ID N0.21 和 SEQ ID N0.22,SEQ ID N0.23 和 SEQ ID N0.24,SEQ IDN0.25 和 SEQ ID N0.26、SEQ ID N0.27 和 SEQ ID N0.28、SEQ ID N0.29 和 SEQ ID N0.30、SEQ ID N0.31和 SEQ ID N0.32。
5.根據權利要求1所述的利 用趾甲提取DNA擴增三線閉殼龜線粒體全長的方法，其特征是:步驟(2)中PCR擴增時PCR反應體系包括濃度為2.5mM的dNTP2.4 μ L，三線閉殼龜模板DNAl μ L，濃度為10 μ mo I的引物各0.5 μ L, Taq聚合酶0.5 μ L，10 X Buffer4 μ L，加水至40 μ L0
6.根據權利要求1所述的利用趾甲提取DNA擴增三線閉殼龜線粒體全長的方法，其特征是:步驟(2)中PCR擴增時PCR反應條件為:95°C變性2min后，進行30個循環(huán)，每個循環(huán)的程序為:95°C變性30s，52°C~60°C退火30s，72°C延伸30s，最后72°C繼續(xù)延伸lOmin。
7.根據權利要求1所述的利用趾甲提取DNA擴增三線閉殼龜線粒體全長的方法，其特征是:步驟(2)中獲得的三線閉殼龜線粒體全長為16675bp，其核苷酸序列如SEQ ID N0.33所示。
【文檔編號】C12N15/10GK103865921SQ201410068690
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年2月27日 優(yōu)先權日:2014年2月27日
【發(fā)明者】朱新平, 李偉, 趙建, 洪孝友 申請人:中國水產科學研究院珠江水產研究所