一種白靈菇及其分子標(biāo)記鑒定方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于白靈菇領(lǐng)域，更具體涉及一種白靈菇及其分子標(biāo)記鑒定方法。本發(fā)明提供的白靈菇（Pleurotuseryngiivar.tuoliensis）54，已于2013年12月16日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號CCTCCNO：M2013669。該白靈菇的分子標(biāo)記鑒定方法，包括菌絲的培養(yǎng)與收集、基因組DNA的提取、EF1α-PCR擴增、特異酶切片段標(biāo)記的產(chǎn)生和酶切產(chǎn)物的電泳檢測。本發(fā)明的白靈菇54栽培周期短于普通白靈菇，產(chǎn)量較高，具有很好的開發(fā)應(yīng)用前景。其分子標(biāo)記鑒定方法具有真實可靠，一目了然的特點，比經(jīng)典的形態(tài)鑒定誤差小，不受環(huán)境條件的影響，判斷更直觀。
【專利說明】一種白靈菇及其分子標(biāo)記鑒定方法
[0001]【技術(shù)領(lǐng)域】
本發(fā)明屬于白靈菇領(lǐng)域，更具體涉及一種白靈菇及其分子標(biāo)記鑒定方法。
[0002]【背景技術(shù)】
白靈側(cè)耳原拉丁名為/7Zetfroiw1S nebrodensis (Inzengae) Qu6l,后張金霞等研究認(rèn)為我國栽培的白靈燕其拉丁名應(yīng)為/7Zetfrote1S eryngii var.tuoIIensis0白靈燕是白靈側(cè)耳的商品名稱，又名翅鮑菇、白靈芝菇、克什米爾神菇等，其分布與新疆阿魏sinkiangensin K.M.Shen)的分布密切相關(guān),在我國僅分布新疆的阿爾泰、托里、木魚、塔城等地有新疆阿魏生長的荒灘，分布海拔高度在72(Tl000m，基因資源有限，這就限制了其育種的進展。
[0003]目前白靈菇的育種方式主要有白靈菇菌株之間的雜交、原生質(zhì)體融合雜種選育、誘變育種和系統(tǒng)選育，通過這些育種方式獲得適合栽培的白靈菇品種，總的說來我國白靈菇品種還是比較單一，且主要來自同一親本繁殖。
[0004]白靈菇具有食用、藥用價值，獲專家學(xué)者很高的評價，是最具有開發(fā)潛力的十大珍稀食用菌之一。然而白靈菇的栽培還是受到其品種比較單一和其生物學(xué)特性的影響，如栽培周期較長、栽培條件較苛刻等，在一定程度上制約了白靈菇產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。
[0005]鑒于白靈菇具有很大的開發(fā)潛力，若能在白靈菇的育種上進行基因資源創(chuàng)新，將會促進白靈菇新品種的培育，進而促進白靈菇產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。
[0006]
【發(fā)明內(nèi)容】

鑒于上述背景，本發(fā)明提供了一種白靈菇及其分子標(biāo)記鑒定方法。
[0007]本發(fā)明提供的白靈燕(/7Zearoeryngiivar.--ο7Υ<9/?5.Υ5.)54,已于 2013 年 12月16日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號CCTCC NO:Μ2013669。
[0008]本發(fā)明提供的白靈燕菌株eryngii var.tuoliensis 54,簡稱白靈菇54)是以白靈菇和杏鮑菇進行雜交選育的白靈菇54，其含有白靈菇與杏鮑菇的基因，打破了現(xiàn)有白靈菇基因資源較單一的局面。白靈菇54子實體具有白靈菇的菌蓋貽貝狀、子實體掌狀、菌褶延伸等特征，其菌蓋顏色同杏鮑菇的淺灰色與淺黃色，栽培周期70~80d，介于杏鮑菇的60d與白靈菇的100~120d，平均每袋產(chǎn)量約360g，具有很好地開發(fā)應(yīng)用前景。
[0009]白靈菇54 (CCTCC NO:M2013669)的培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基，即培養(yǎng)基是PDA:馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂條20g，水1000mL ;培養(yǎng)條件為常規(guī)的白靈菇培養(yǎng)，無特殊要求。
[0010]本發(fā)明還提供了所述白靈菇的分子標(biāo)記鑒定方法，包括菌絲的培養(yǎng)與收集、基因組DNA的提取、EFl a (Elongation Factor I α延伸因子I a )-PCR擴增、特異酶切片段標(biāo)記的產(chǎn)生和酶切產(chǎn)物的電泳檢測。
[0011]所述特異酶切片段標(biāo)記的產(chǎn)生:在8~12 yL EFla-PCR擴增產(chǎn)物中，加入2yLDde I 酶的酶切 Buffer，1.0 ~1.5 mL Dde I SI, 5 ~7 μ L ddH20, 37°C水浴 3 ~4 h，取酶切產(chǎn)物用于電泳檢測；
所述酶切產(chǎn)物的電泳檢測:經(jīng)電泳檢測，在一個泳道上只有同時出現(xiàn)分子量為315~325bp、220 ~230 bp 和 115 ~125bp 的 DNA 標(biāo)記條帶，是白靈燕 iPleurotus eryngii var.tuoliensis) 54標(biāo)記。其中電泳條件為:取酶切產(chǎn)物15 μ L，與3 μ L上樣緩沖液混勻，點樣于1.2%的瓊脂糖凝膠上，于0.5 X TBE緩沖液中，5V/cm電壓下電泳；所述上樣緩沖液:
0.1%溴酚藍，40%蔗糖。
[0012]所述EFla-PCR擴增的反應(yīng)體系:I μ I 含量50~100 ng 的DNA，2.5 μ I 10XPCRbuffer, 2 μ I 濃度為 2.5 m mol/L 的 dNTP，I μ I 濃度為 10 μ mol/L 的 EF1160R,EF1160R 序列為 5’- CCGATCTTGTAGACGTCCTG -3’，I μ I 濃度為 10 μ mol/L 的 EF595F，EF595F 序列為 5’- CGTGACTTCATCAAGAACATG -3’，0.3 μ I 酶活為 5 U/ul 的 Taq DNAPolymerase, 17.2 μ I ddH20o
[0013]EFl a -PCR 擴增反應(yīng)程序:94°C預(yù)變性 5 min ;94°C變性 I min，55°C退火 I min，72°C延伸 I min, 35 個循環(huán)；72°C延伸 10 min。
[0014]本發(fā)明具有以下優(yōu)點:
1、白靈菇54含有白靈菇與杏鮑菇的基因，其子實體形態(tài)繼承了白靈菇與杏鮑菇的形態(tài)特征，栽培周期短于普通白靈菇，產(chǎn)量較高，具有很好的開發(fā)應(yīng)用前景。
[0015]2、白靈菇54的分子標(biāo)記鑒定方法具有真實可靠，一目了然的特點，比經(jīng)典的形態(tài)鑒定誤差小，不受環(huán)境條件 的影響，判斷更直觀。
[0016]3、專一性強:本發(fā)明充分利用酶的專一性和高效性，且本發(fā)明使用的酶對白靈菇54具有特異性，產(chǎn)生特異 識別性的標(biāo)記片段，非白靈菇與杏鮑菇的雜種得不到這種效果。
[0017]4、白靈菇54的分子標(biāo)記鑒定方法操作簡單，檢測時間短，經(jīng)典的形態(tài)鑒定需要檢測的指標(biāo)多，時間長且需要綜合起來分析。在一般的分子實驗室即可以完成檢測，無需要特殊的儀器設(shè)備。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為白靈菇54子實體形態(tài)。
[0019]圖2為Dde I酶的酶切電泳圖；其中，I~8為泳道編號，2~4和5~7泳道顯示的分子量為320bp，223 bp和118 bp的DNA標(biāo)記條帶，是白靈菇54的標(biāo)志；1泳道顯示的分子量為223 bp和118 bp是杏鮑燕的標(biāo)志；8泳道顯不的分子量為320 bp和118 bp是白靈菇的標(biāo)志；M表示分量為DL 2000的DNA MARK。
【具體實施方式】
[0020]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的闡述。
[0021]實施例1:白靈菇54的篩選
選取性狀優(yōu)良的6個白靈菇和8個杏鮑菇菌株，在PDA固體培養(yǎng)基活化后制作原種，按白靈菇和杏鮑菇常規(guī)栽培方法對白靈菇菌株和杏鮑菇菌株進行出菇試驗，彈射其擔(dān)孢子，進行孢子萌發(fā)獲得白靈菇與杏鮑菇的單孢菌株。選取24個白靈菇單孢菌株與32個杏鮑菇單孢菌株進行行單-單雜交，共配對768組，獲得116個白靈菇與杏鮑菇的雜交子，對116個雜交子出菇試驗，篩選出子實體形狀同白靈菇的雜交子54，命名為白靈菇54。白靈菇54經(jīng)多次出菇，其菇體呈貽貝狀或掌狀，同白靈菇的基本形態(tài)一致；菌蓋表面較光滑或有小突點、偶見射狀裂痕、淺黃色或淺灰色，遺傳有杏鮑菇的特性；菌柄偏生、白色，菌褶延伸至菌柄，這一特性又同白靈燕。因此將其鑒定為白靈燕O0ZetfroiW1S eryngii var.tuoliensis")54，已于2013年12月16日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址:武漢武漢大學(xué)，保藏編號CCTCC NO:M2013669。 所述白靈菇菌株和杏鮑菇菌株均從市場上購得。
[0022]實施例2:白靈菇54 (CCTCC NO:M2013669)的出菇試驗，包括以下步驟:
一、白靈燕54菌種制作
將白靈菇54菌株在PDA培養(yǎng)上活化2次，轉(zhuǎn)接于白靈菇原種常規(guī)培養(yǎng)基，25°C恒溫培養(yǎng)至長滿原種瓶。
[0023]二、白靈菇54墻式覆土栽培管理
栽培白靈菇54時的選料、各種原料配方、裝袋、消毒滅菌和發(fā)菌管理及后熟期管理基本上同常規(guī)。出菇管理參照張志軒的白靈菇墻式覆土栽培技術(shù)(張志軒.白靈菇墻式覆土栽培技術(shù)[J].北方園藝2010，11:189~190.)
白靈菇54從接種至采收70~80d，形態(tài)特征見圖1，菇體貽貝狀或掌狀，菌蓋表面較光滑或有小突點、偶見射狀裂痕、淺黃色或淺灰色，菌柄偏生、白色，菌褶延伸至菌柄，單袋平均產(chǎn)量約360g。白靈菇54的栽培周期較一般的白靈菇栽培周期100~120d短，出菇較整齊，具有很好地開發(fā)應(yīng)用前景。
[0024]實施例3:白靈菇54 (CCTCC NO:M2013669)的分子標(biāo)記鑒定方法，包括以下步驟:
一、菌絲培養(yǎng) 和收集
1、將白靈菇54、杏鮑菇和白靈菇菌株轉(zhuǎn)接含100mlPDA液體培養(yǎng)基的250 ml廣口三角瓶中，其中杏鮑菇和白靈菇購于市場，作參照用；
2、放置在25°C搖床上，轉(zhuǎn)速90~130r/min培養(yǎng)7~10 d ；
3、用紗布過濾培養(yǎng)好的菌絲，蒸餾水沖洗，濾紙吸干；
4、稱取0.5~1.3g菌絲，用濾紙包好，保存于_20°C備用。
[0025]二、CTAB法提取基因組DNA
1、取保存?zhèn)溆玫碾s交菌株的菌絲0.5~1.3g放入研缽，加入液氮迅速研磨成粉末，轉(zhuǎn)入7ml的離心管；
2、加2.5 mL 65°C預(yù)熱的抽提液，同時加入50 μ I巰基乙醇，上下震蕩，使蛋白質(zhì)變性沉淀；
3、65°C水浴lh，每隔IOmin振蕩I次；
4、加入2.5 ml的氯仿異戊醇混勻，除去蛋白質(zhì)；
5、8000r/min, 4°C離心 IOmin,取上清到 7ml 管；
6、加1/5體積65°C預(yù)熱的CTAB/NaCl混勻，加入2.5 ml的氯仿異戊醇混勻；
7、10000r/min，4°C離心IOmin,取上清；
8、加入2.5 ml 65°C預(yù)熱的CTAB沉淀液，顛倒混勻，65°C水浴Ih ;
9、12000r/min,4°C離心IOmin后，去除上清液；
10、用0.5ml TE溶液或無菌水溶解沉淀IOmin ；
11、加入0.25ml飽和酚和0.25m L氯仿異戊醇，混勻；
12,12000 r/min，4°C離心lOmin，取上清，加入2倍體積在4°C預(yù)冷的無水乙醇，混勻；
13、放置-20°C冰箱Ih或過夜；
14、12000r/min, 4°C離心 10 min,棄上清；15、自然風(fēng)干沉淀，用30 μ I TE溶液或無菌去離子水溶解沉淀，-20°c保存?zhèn)溆谩?br> [0026]三、EFla-PCR擴增
EFl a-PCR 擴增反應(yīng)體系:I μ I 含量 50~100 ng 的 DNA，2.5 μ I 10XPCR buffer, 2μ I 濃度為 2.5 m mol/L 的 dNTP，I μ I 濃度為 10 μ mol/L 的 EF1160R, EF1160R 序列為5’- CCGATCTTGTAGACGTCCTG -3’，I μ I 濃度為 10 μ mol/L 的 EF595F，EF595F 序列為 5’-CGTGACTTCATCAAGAACATG -3，，0.3 μ I 酶活為 5 U/ul 的 Taq DNA Polymerase, 17.2 μ IddH20。
[0027]EFl a -PCR 擴增反應(yīng)程序:94°C預(yù)變性 5 min ;94°C變性 I min，55°C退火 I min,72°C延伸 I min, 35 個循環(huán)；72°C延伸 10 min。
[0028]四、特異酶切片段標(biāo)記的產(chǎn)生
12 μ I EFl a -PCR 擴增產(chǎn)物，2 μ l Dde I酶的酶切 Buffer, 1.5 μ I I 酶，7 μ IddH20，37°C^KS4h。
[0029]五、酶切產(chǎn)物的電泳檢測
MDde I酶的酶切產(chǎn)物15 μ 1，與3 μ I上樣緩沖液混勻，點樣于1.2%的瓊脂糖凝膠上，同時使用DL 2000的DNA MARK作為片段大小的參照，于0.5 X TBE緩沖液中，5V/cm電壓下電泳60—90 min，電泳結(jié)束后，用EB染色，然后在凝膠成像儀上照相。電泳圖如圖2所示，2~4和5~7泳道顯示的分子量為320bp，223 bp和118 bp的DNA標(biāo)記條帶，是白靈恭54的標(biāo)志；1泳道顯示的分子量為223 bp和118 bp是杏鮑燕的標(biāo)志；8泳道顯示的分子量為320 bp和118 bp是白靈菇的標(biāo)志；M表示分量為DL 2000的DNA MARK。
[0030]六、試劑與儀器
CTAB 抽提液:100 mmol/L Tris-HCl, 2.0% CTAB,20 mmol/L EDTA, 1.4 mol/L NaCl,pH 8.0;
CTAB 沉淀液:50 mmol/L Tris-HCl, 1.0% CTAB，10 mmol/L EDTA, pH 8.0;
CTAB/NaCl:0.7 mol/L NaCl, 10% CTAB ；
氯仿異戊醇:體積比氯仿比異戊醇為24比I ;
TE 緩沖液:10 mmol/L Tris HCl，I mmol/L EDTA ；
0.5XTBE:44.5 mmol/L Tris, 50 mmol/L HB03、1 mmol/L EDTA;
上樣緩沖液:0.1%溴酚藍，40%蔗糖；
EB:10 mg/mL溴化乙錠；
Dde I 酶購自 Fermentas ；
PCR擴增試劑及酶均購自大連寶生物公司。
【權(quán)利要求】
1.一種白靈燕，其特征在于:所述白靈燕為白靈燕(.Pleurotus eryngii var.tuoliensis)bA,已于2013年12月16日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號CCTCCNO:M2013669o
2.一種如權(quán)利要求1所述的白靈菇的分子標(biāo)記鑒定方法，包括菌絲的培養(yǎng)與收集、基因組DNA的提取、EFl a -PCR擴增、特異酶切片段標(biāo)記的產(chǎn)生和酶切產(chǎn)物的電泳檢測，其特征在于: 所述特異酶切片段標(biāo)記的產(chǎn)生:在8~12 UL EFla-PCR擴增產(chǎn)物中，加入2μ LDde I 酶的酶切 Buffer，1.0 ~1.5 μ L I 酶，5 ~7 μ L ddH20, 37°C水浴 3 ~4 h，取酶切產(chǎn)物用于電泳檢測； 所述酶切產(chǎn)物的電泳檢測:經(jīng)電泳檢測，在一個泳道上只有同時出現(xiàn)分子量為315~325bp、220 ~230 bp 和 115 ~125bp 的 DNA 標(biāo)記條帶，是白靈燕{Pleurotus eryngii var.tuo liens is、54 標(biāo)記。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的白靈菇的分子標(biāo)記鑒定方法，其特征在于:所述EFla-PCR擴增的反應(yīng)體系:1 μ I 含量 5(Tl00 ng 的 DNA，2.5 μ I 10XPCR buffer, 2 μ I 濃度為 2.5mmol/L 的 dNTP，I μ I 濃度為 10 μ mol/L 的 EF1160R, EF1160R 序列為 5’ -CCGATCTTGTAGACGTCCTG -3’，I μ I 濃度為 10 μ mol/L 的 EF595F，EF595F 序列為 5’ -CGTGACTTCATCAAGAACATG -3，，0.3 μ I 酶活為 5 U/ul 的 Taq DNA Polymerase, 7.2 μ IddH20 ； EFl a-PCR擴增反應(yīng)程序:94°C預(yù)變性5 min;94°C變性I min，55°C退火I min，72°C延伸I min, 35個循環(huán)；72° C延伸10 min。
【文檔編號】C12R1/645GK103805522SQ201410063450
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年2月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月25日
【發(fā)明者】劉新銳, 謝寶貴, 鄧優(yōu)錦, 江玉姬, 朱堅 申請人:福建農(nóng)林大學(xué)