一種產(chǎn)Kdo2-lipidA的基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種產(chǎn)Kdo2-lipidA的基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，屬于遺傳工程領(lǐng)域。所述基因工程菌為WJW00，所述基因工程菌為無(wú)抗性E.coliW3110△rfaD，其中rfaD發(fā)生缺失突變失活。本發(fā)明構(gòu)建的菌株Kdo2-lipidA結(jié)構(gòu)正確，生長(zhǎng)狀況良好，沒(méi)有引入任何外源抗性基因序列，更有利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說(shuō)明】—種產(chǎn)Kdo2-1 ipidA的基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種產(chǎn)KdO2-1ipidA的基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，是一種無(wú)抗性的Kdo2-1ipidA大腸桿菌生產(chǎn)菌。
技術(shù)背景
[0002]Kdo2-1ipidA是體現(xiàn)革蘭氏陰性菌毒力的疏水性成分，其可以被宿主免疫細(xì)胞表面的TLR4/MD2所識(shí)別，是感染宿主的毒力因子。隨著人們對(duì)其致病機(jī)制的深入研究，脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)、Kdo2_lipidA和類脂 A廣泛用于動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)。Kdo2-1ipidA攜帶類脂A毒力因子，可以達(dá)到刺激細(xì)胞相同的反應(yīng)，但是通過(guò)基因工程構(gòu)建的類脂A結(jié)構(gòu)菌株只能在低溫下生長(zhǎng)，且生長(zhǎng)狀況非常差。通過(guò)化學(xué)降解方法提取類脂A的過(guò)程繁瑣，成本又高。而LPS具有較多缺點(diǎn)，如分子較大，在反應(yīng)體系中分散不均一，并且細(xì)胞刺激反應(yīng)前后LPS不易于被檢測(cè)等。而Kdo2-1ipidA分子較小，分散均一，也易被ESI/MS等方法檢測(cè)。同時(shí)，I μ gKdo2-lipidA相當(dāng)于10 μ gLPS所引起的反應(yīng),而且同樣實(shí)驗(yàn)反應(yīng)的花費(fèi)也僅為L(zhǎng)PS的一半。因此，通過(guò)基因工程構(gòu)建一株可以產(chǎn)Kdo2-1ipidA的大腸桿菌可以解決上述問(wèn)題。目前，Kdo2-1ipidA的生產(chǎn)菌主要是WBB06菌株。現(xiàn)有菌株的缺點(diǎn)在于:第一、WBB06生長(zhǎng)狀態(tài)較野生型差很多，最終菌體量少；第二、WBB06菌帶有氨芐青霉素和四環(huán)素抗性標(biāo)記；第三、WBB06的基因組序列并不清晰，即遺傳背景不清楚。本發(fā)明是構(gòu)建了一株不帶任何抗性標(biāo)記，遺傳背景很清晰，且生長(zhǎng)狀況較好的生產(chǎn)Kdo2-1ipidA的大腸桿菌基因工程菌。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種無(wú)任何抗性標(biāo)記，生長(zhǎng)狀況良好的產(chǎn)Kdo2-1ipidA的新型基因工程菌，以適應(yīng)大規(guī)模生產(chǎn)。
[0004]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供的基因工程菌為E.coliW3110 Λ rfaD,即WJW00，其中rfaD發(fā)生缺失突變失活。
[0005]本發(fā)明還提供了一種構(gòu)建上述基因工程菌的方法，將人工構(gòu)建的rfaD敲除片段電轉(zhuǎn)化入含PKD46質(zhì)粒的E.coliff3110,獲得突變株E.coliff3110 ΔrfaD-Fkan,再化轉(zhuǎn)入PCP20質(zhì)粒，通過(guò)位點(diǎn)特異性重組敲除卡那霉素抗性基因；去除PCP20質(zhì)粒后獲得無(wú)抗性產(chǎn)Kdo2-1ipidA的基因工程菌。
[0006]所述位點(diǎn)特異性重組為FLP酶介導(dǎo)的FRT位點(diǎn)特異性重組，最終42°C培養(yǎng)去除PCP20質(zhì)粒，獲得無(wú)抗性 產(chǎn)Kdo2-1ipidA的基因工程菌。
[0007]所述rfaD基因敲除片段的核苷酸序列如SEQIDN0.1所示。
[0008]SEQINN0.1:
[0009]tccgttacac cttcagcaac ggttttgaac ggtttgtcgt aacccgccgc gcgcagattt 60
[0010]gtcagatctg cctgagtgaa cgcctgatag cggcctttca gtttatccgg gaacggaatg 120
[0011]tattcgatct ggcctttctt gtgataagcc agcgtagcat cagctaccgc ctggaaggat 180
【權(quán)利要求】
1.一種產(chǎn)Kdo2-1ipidA的基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌為無(wú)抗性E.coliW3110 ArfaD，其中rfaD發(fā)生缺失突變失活。
2.權(quán)利要求1所述的基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟: 將人工構(gòu)建的rfaD敲除片段電轉(zhuǎn)化入含pKD46質(zhì)粒的E.coliff3110,獲得突變株E.Co I iW3110 ArfaD-Fkan，再化轉(zhuǎn)入pCP20質(zhì)粒，通過(guò)位點(diǎn)特異性重組敲除卡那霉素抗性基因；去除PCP20質(zhì)粒后獲得無(wú)抗性產(chǎn)Kdo2-1ipidA的基因工程菌。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于位點(diǎn)特異性重組為FLP酶介導(dǎo)的FRT位點(diǎn)特異性重組，最終42oC培養(yǎng)去除pCP20質(zhì)粒，獲得無(wú)抗性產(chǎn)Kdo2-1ipidA的基因工程菌。
4.權(quán)利要求2或多所述的方法，其特征在于所述rfaD基因敲除片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.1 所示。
5.權(quán)利要求1所述基因工程菌在發(fā)酵生產(chǎn)Kdo2-1ipidA的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于以權(quán)利要求1構(gòu)建的基因工程菌為生產(chǎn)菌株，采用常規(guī)發(fā)酵后，對(duì)Kdo2-1ipidA進(jìn)行提取，提取方法為:收集發(fā)酵后的菌體，0.1MNaCl溶液洗漆菌體一次后用Bligh-Dyer —相體系76mL懸浮菌體,磁力攪拌lh,2000rpm離心30min分相，取上相，棄沉淀，加入20mL氯仿和20mLl.0MNaCl溶液配成Bligh-Dyer 二相體系，2000rpm離心30min,取下相 移入旋蒸瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)；最后加入氯仿/甲醇溶液(2:1, v/v)將Kdo2-1ipidA洗出；所述Bligh-Dyer—相體系成分為氯仿/甲醇/1.0MNaCl溶液體積比為 1:2:0.8。
【文檔編號(hào)】C12N1/21GK103820377SQ201410052649
【公開(kāi)日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2014年2月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月17日
【發(fā)明者】王小元, 王建莉, 馬文漸, 王洲, 李燁 申請(qǐng)人:江南大學(xué)