改善的氨基脂質(zhì)和遞送核酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供用于向細(xì)胞遞送治療劑的優(yōu)良組合物和方法。具體地，這些包括新型脂質(zhì)和核酸-脂質(zhì)顆粒，其提供有效的核酸包封和在體內(nèi)包封的核酸向細(xì)胞的有效遞送。本發(fā)明的組合物是高度有效的，由此允許以相對(duì)低的劑量有效地敲低特定的靶蛋白。另外，與本領(lǐng)域先前已知的組合物和方法相比，本發(fā)明的組合物和方法毒性較小，并且提供較高的治療指數(shù)。
【專利說明】改善的氨基脂質(zhì)和遞送核酸的方法
[0001] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2009年10月9日、標(biāo)題為"改善的氨基脂質(zhì)和遞送核酸的方 法"的中國(guó)專利申請(qǐng)No. 200980149266. X的分案申請(qǐng)。
[0002] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考
[0003] 本申請(qǐng)依據(jù)35U.S.C. § 119(e)要求下列美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)的利益：于2008年10 月9日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/104, 219 ;2008年10月9日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申 請(qǐng)?zhí)?1/104, 212 ;和2009年6月26日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/220, 666,其中這(三 個(gè)）臨時(shí)申請(qǐng)通過引用完全結(jié)合于此。
[0004] 關(guān)于序列表的聲明
[0005] 與本申請(qǐng)相關(guān)的序列表以文本形式替代紙件副本提供，并且因此通過引用結(jié)合在 說明書中。包含序列表的文本文件的名稱為480208_461PC_SEQUENCE_LISTING. txt。文本 文件為9KB，于2009年10月9日生成，并且通過EFS-Web電子形式提交。
[0006] 背景

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0007] 本發(fā)明涉及使用脂質(zhì)顆粒進(jìn)行治療劑遞送的領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明提供陽離子脂 質(zhì)和包含這些脂質(zhì)的脂質(zhì)顆粒（其對(duì)于核酸的體內(nèi)遞送是有利的），以及適于體內(nèi)治療應(yīng) 用的核酸-脂質(zhì)顆粒組合物。另外，本發(fā)明提供制備這些組合物的方法，以及使用這些組合 物將核酸引入細(xì)胞中，例如，用于治療各種疾病病癥的方法。
[0008] 相關(guān)技術(shù)的描述
[0009] 例如，治療性核酸包括小干擾RNA(siRNA)，微小RNA(miRNA)，反義寡核苷酸，核 酶，質(zhì)粒，和免疫刺激性核酸。這些核酸通過各種機(jī)制作用。在siRNA或miRNA的情形中， 這些核酸可以通過稱為RNA干擾（RNAi)的過程下調(diào)特定蛋白的胞內(nèi)水平。在將siRNA或 miRNA引入到細(xì)胞質(zhì)中后，這些雙鏈的RNA構(gòu)建體可以結(jié)合稱為RISC的蛋白。所述siRNA 或miRNA的有義鏈由RISC復(fù)合物置換，提供在RISC內(nèi)的模板，所述模板可以識(shí)別并結(jié)合具 有與所結(jié)合的siRNA或miRNA的序列互補(bǔ)的序列的mRNA。已經(jīng)結(jié)合互補(bǔ)mRNA后，RISC復(fù) 合物將mRNA裂解，并且釋放出所裂解的鏈。RNAi可以通過靶向相應(yīng)的編碼蛋白合成的mRNA 的特異性破壞而提供特定蛋白的下調(diào)。
[0010] RNAi的治療性應(yīng)用非常廣泛，因?yàn)镾iRNA和miRNA構(gòu)建體可以用針對(duì)靶蛋白的任 何核苷酸序列合成。迄今為止，siRNA構(gòu)建體已經(jīng)在體外和體內(nèi)模型中都表現(xiàn)出特異性下 調(diào)革巴蛋白的能力。另外，目如正在臨床研究中對(duì)siRNA構(gòu)建體進(jìn)行評(píng)估。
[0011] 然而，siRNA或miRNA構(gòu)建體目前面對(duì)兩個(gè)問題，第一，其對(duì)血漿中核酸酶消化的 敏感性，第二，當(dāng)其以游離siRNA或miRNA進(jìn)行系統(tǒng)施用時(shí)，其進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)區(qū)室的能力有限， 在所述細(xì)胞內(nèi)區(qū)室中其可以結(jié)合RISC。這些雙鏈構(gòu)建體可以通過在分子內(nèi)結(jié)合化學(xué)修飾的 核苷酸接頭而被穩(wěn)定，所述化學(xué)修飾的核苷酸接頭例如硫代磷酸酯基團(tuán)。然而，這些化學(xué)修 飾僅提供對(duì)核酸酶消化的有限的保護(hù)，并且可能降低構(gòu)建體的活性?？梢酝ㄟ^使用載體系 統(tǒng)如聚合物、陽離子脂質(zhì)體或通過對(duì)構(gòu)建體進(jìn)行化學(xué)修飾如通過共價(jià)附著膽固醇分子而促 進(jìn)siRNA或miRNA的細(xì)胞內(nèi)遞送[參考文獻(xiàn)]。然而，需要有改善的遞送系統(tǒng)來提高siRNA 和miRNA分子的功效并且減少或消除對(duì)化學(xué)修飾的需要。
[0012] 反義寡核苷酸和核酶也可以抑制mRNA翻譯成蛋白質(zhì)。在反義構(gòu)建體的情形中，這 些單鏈脫氧核酸具有與靶蛋白mRNA的序列互補(bǔ)的序列，并且可以通過沃森-克里克堿基配 對(duì)與mRNA結(jié)合。這種結(jié)合防止靶mRNA的翻譯和/或引發(fā)mRNA轉(zhuǎn)錄物的RNA酶Η降解。 因此，反義寡核苷酸具有極大的作用特異性（即，下調(diào)特定疾病相關(guān)的蛋白）的潛力。迄今為 止，這些化合物已經(jīng)在一些體外和體內(nèi)模型中顯示是有希望的，所述模型包括炎性疾病、癌 癥、和 HIV 的模型（在 Agrawal, Trends in Biotech.(生物科技趨勢(shì))14:376-387 (1996)中 綜述)。反義也可以通過與染色體DNA特異性雜交而影響細(xì)胞活性。目前正在進(jìn)行某些反 義藥物的高級(jí)人類臨床評(píng)估。這些藥物的靶標(biāo)包括bcl2和載脂蛋白B基因和mRNA產(chǎn)物。
[0013] 免疫刺激性核酸包括脫氧核糖核酸和核糖核酸。在脫氧核糖核酸的情形中，已經(jīng) 表明某些序列或基序在哺乳動(dòng)物中引發(fā)免疫刺激。這些序列或基序包括CpG基序，富含嘧 啶的序列和回文序列。據(jù)信脫氧核糖核酸中的CpG基序由內(nèi)體受體、toll樣受體9 (TLR-9) 特異性識(shí)別，然后其引發(fā)先天性和獲得性免疫刺激途徑。還已經(jīng)報(bào)道了一些免疫刺激性核 糖核酸序列。據(jù)信這些RNA序列通過與toll-樣受體6和7 (TLR-6和TLR-7)結(jié)合而引發(fā) 免疫激活。另外，還報(bào)道了雙鏈RNA是免疫刺激性的，并且據(jù)信通過與TLR-3結(jié)合而激活。
[0014] 使用治療性核酸的一個(gè)公知的問題涉及磷酸二酯核苷酸間鍵合的穩(wěn)定性和該接 頭對(duì)核酸酶的敏感性。血清中外切核酸酶和內(nèi)切核酸酶的存在導(dǎo)致具有磷酸二酯接頭的核 酸的快速消化，并且因此，在存在血清或在細(xì)胞內(nèi)的條件下，治療性核酸可能具有非常短的 半衰期。（Zelphati，0·，等，Antisense.Res.Dev.(反義研究發(fā)展）3:323_338(1993);和 Thierry，A.R·，等，在Gene Regulation:Biology of Antisense RNA and DNA(基因調(diào)控： 反義 RNA 和 DNA 的生物學(xué)）（編輯 Erickson, RP 和 Izant，JG; Raven Press, NY (1992)的第 147-161頁）。由于這些和其它已知的問題，目前正處于開發(fā)中的治療性核酸不利用在天然 核酸中發(fā)現(xiàn)的基本磷酸二酯化學(xué)。
[0015] 通過減少血清或細(xì)胞內(nèi)降解的化學(xué)修飾部分克服了這一問題。已經(jīng)檢測(cè)了在下列 中的修飾：核苷酸間磷酸二酯橋接（bridge)(例如，使用硫代磷酸酯，甲基磷酸酯或氨基 磷酸酯鍵），核苷酸堿基（例如，5-丙炔基-嘧啶），或糖（例如，2'-修飾的糖）（Uhlmann E.,等，Antisense:Chemical Modifications (反義：化學(xué)修飾）· Encyclopedia of Cancer (癌癥百科全書），卷X·,第64-81頁Academic Press Inc.(學(xué)院出版公司）（1997))。其 他人已經(jīng)嘗試用2'-5'糖連接(參見，例如，美國(guó)專利號(hào)5, 532, 130)提高穩(wěn)定性。已經(jīng)嘗 試了其它的改變。然而，這些技術(shù)方案無一被證明是完全令人滿意的，并且在體內(nèi)游離的治 療性核酸仍然僅具有有限的功效。
[0016] 另外，如上述關(guān)于SiRNA和miRNA所述，存在與治療性核酸有限的穿過細(xì)胞膜的能 力相關(guān)的問題（參見，Vlassov,等，Biochim. Biophys. Acta (生物化學(xué)和生物物理學(xué)學(xué)報(bào)） 1197:95-1082 (1994))和與系統(tǒng)性毒性相關(guān)的問題，如補(bǔ)體介導(dǎo)的過敏反應(yīng)，改變的凝結(jié)特 性，和血細(xì)胞減少（cytopenia) (Galbraith,等，Antisense Nucl. Acid Drug Des.(反義核 酸藥物和疾病）4:201-206(1994))。
[0017] 為了嘗試提高功效，研究者還利用基于脂質(zhì)的載體系統(tǒng)來遞送化學(xué)修飾的或未 修飾的治療性核酸。在 Zelphati，0 和 Szoka，RC·，J.Contr.Rel.41:99-119(1996)中， 作者提到陰離子(常規(guī)的）脂質(zhì)體、pH敏感的脂質(zhì)體、免疫脂質(zhì)體、促溶脂質(zhì)體、和陽離子 脂質(zhì)/反義團(tuán)聚體的使用。相似的siRNA已經(jīng)在陽離子脂質(zhì)體中進(jìn)行系統(tǒng)施用，并且已 報(bào)道這些核酸-脂質(zhì)顆粒在包括非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的哺乳動(dòng)物中提供靶蛋白的改善的下調(diào) (Zimmermann 等，Nature (自然）441:111-114(2006))。
[0018] 盡管取得這一進(jìn)步，在本領(lǐng)域中存在對(duì)改善適于常規(guī)治療應(yīng)用的核酸-脂質(zhì)顆粒 和組合物的需求。優(yōu)選地，這些組合物將以高效率包封核酸，具有高的藥物：脂質(zhì)比率，保護(hù) 所包封的核酸免于在血清中降解和清除，適于系統(tǒng)遞送，并且提供所包封的核酸的細(xì)胞內(nèi) 遞送。另外，這些核酸-脂質(zhì)顆粒應(yīng)該是良好耐受性的，并且提供充分的治療指數(shù)，以致以 有效劑量的核酸進(jìn)行的患者治療不與對(duì)所述患者的顯著的毒性和/或危險(xiǎn)相關(guān)。本發(fā)明提 供這樣的組合物、制備所述組合物的方法、和使用所述組合物將核酸引入到細(xì)胞中（包括用 于治療疾病）的方法。
[0019] 簡(jiǎn)述
[0020] 本發(fā)明提供新型的氨基脂質(zhì)，以及包含所述氨基脂質(zhì)的脂質(zhì)顆粒。這些脂質(zhì)顆粒 可以進(jìn)一步包含活性劑，并且可以按照本發(fā)明的相關(guān)方法用于將所述活性劑遞送至細(xì)胞 中。
[0021] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括具有下述結(jié)構(gòu)（I)的氨基脂質(zhì)：
[0022]

【權(quán)利要求】
1. 具有下述結(jié)構(gòu)的氨基脂質(zhì)：
或其鹽。
2. 包含權(quán)利要求1的氨基脂質(zhì)的脂質(zhì)顆粒。
3. 權(quán)利要求2的脂質(zhì)顆粒，其中所述顆粒還包含中性脂質(zhì)和能夠減少顆粒聚集的脂 質(zhì)。
4. 權(quán)利要求2或3的脂質(zhì)顆粒，其中所述脂質(zhì)顆粒以約20-60%權(quán)利要求1的氨基脂 質(zhì)：5-25%中性脂質(zhì)：25-55%膽固醇：0. 5-15%PEG-脂質(zhì)的摩爾比率包含： (i) 權(quán)利要求1的氨基脂質(zhì)； (ii) 中性脂質(zhì)，其選自DSPC，POPC，DOPE，和SM; (iii) 膽固醇；和 (iv) PEG-脂質(zhì)。
5. 權(quán)利要求2或3的脂質(zhì)顆粒，其還包含治療劑；其中任選地和優(yōu)選地，所述治療劑是 核酸；并且其中任選地和進(jìn)一步優(yōu)選地，所述核酸是質(zhì)?；蛎庖叽碳ば怨押塑账?。
6. 權(quán)利要求5的脂質(zhì)顆粒，其中所述核酸選自由下列各項(xiàng)組成的組：siRNA,微小RNA, 反義寡核苷酸和核酶；任選地，其中所述核酸是siRNA。
7. -種藥物組合物，其包含權(quán)利要求2-6中任一項(xiàng)的脂質(zhì)顆粒和藥用賦形劑、載體或 稀釋劑。
8. -種調(diào)控細(xì)胞的多肽表達(dá)的體外方法，所述方法包括向細(xì)胞提供權(quán)利要求2-6中任 一項(xiàng)的脂質(zhì)顆粒，其中任選地和優(yōu)選地，所述治療劑選自：siRNA，微小RNA，反義寡核苷酸 和能夠表達(dá)siRNA、微小RNA或反義寡核苷酸的質(zhì)粒，并且其中所述siRNA，微小RNA或反 義RNA包括這樣的多核苷酸，所述多核苷酸特異性結(jié)合編碼所述多肽的多核苷酸，或其互 補(bǔ)體，以使所述多肽的表達(dá)減少；其中任選地和進(jìn)一步優(yōu)選地，所述治療劑是質(zhì)粒，所述質(zhì) 粒編碼所述多肽或其功能變體或片段，以使所述多肽或其功能變體或片段的表達(dá)增加。
9. 權(quán)利要求7的藥物組合物在制備用于治療受試者中以多肽的過量表達(dá)為特征的疾 病或病癥的藥物中的用途，其中所述治療劑選自：siRNA，微小RNA，反義寡核苷酸和能夠表 達(dá)siRNA、微小RNA或反義寡核苷酸的質(zhì)粒，并且其中所述siRNA，微小RNA或反義RNA包 括這樣的多核苷酸，所述多核苷酸特異性結(jié)合編碼所述多肽的多核苷酸，或其互補(bǔ)體。
10. 權(quán)利要求7的藥物組合物在制備用于治療受試者中以多肽的低表達(dá)為特征的疾病 或病癥的藥物中的用途，其中所述治療劑是編碼所述多肽或其功能變體或片段的質(zhì)粒。
11. 權(quán)利要求7的藥物組合物在制備用于在受試者中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的藥物中的用途， 其中所述治療劑是免疫刺激性寡核苷酸。
12. 權(quán)利要求11的用途，其中所述藥物組合物與疫苗或抗原組合提供給患者。
13. -種疫苗，其包含權(quán)利要求5的脂質(zhì)顆粒和與疾病或病原體相關(guān)的抗原。
14. 權(quán)利要求13的疫苗，其中所述抗原是腫瘤抗原。
15.權(quán)利要求13的疫苗，其中所述抗原是病毒抗原、細(xì)菌抗原或寄生蟲抗原。
【文檔編號(hào)】C12N15/85GK104119242SQ201410051512
【公開日】2014年10月29日 申請(qǐng)日期:2009年10月9日 優(yōu)先權(quán)日:2008年10月9日
【發(fā)明者】邁克爾·J·霍普, 肖恩·C·森普爾, 陳建新, 托馬斯·D·馬登, 皮埃特·R·卡利斯, 馬爾科·A·丘福利尼, 芭芭拉·穆伊 申請(qǐng)人:泰米拉制藥公司, 英屬哥倫比亞大學(xué)