預(yù)測(cè)肝衰竭預(yù)后的gstp1甲基化定量檢測(cè)法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】預(yù)測(cè)肝衰竭預(yù)后的GSTP1甲基化定量檢測(cè)法及試劑盒。本發(fā)明涉及基因甲基化定量檢測(cè)，具體涉及預(yù)測(cè)肝衰竭預(yù)后的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶P1（GSTP1）基因啟動(dòng)子甲基化定量檢測(cè)法及試劑盒。試劑盒內(nèi)含有提取基因組DNA的試劑、修飾基因組DNA的試劑、5×預(yù)混PCR反應(yīng)體系、標(biāo)準(zhǔn)品、陽(yáng)性和陰性對(duì)照以及針對(duì)目的基因GSTP1啟動(dòng)子的甲基化特異性引物對(duì)和內(nèi)參基因ALU-C4的特異性引物對(duì)與相應(yīng)的Taqman熒光探針。通過(guò)提取外周血基因組DNA和進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)剑≒CR）反應(yīng),計(jì)算得到基因GSTP1甲基化定量值。本發(fā)明的試劑盒可幫助醫(yī)生判定肝衰竭患者病情及預(yù)后，制定有效的治療方案。
【專利說(shuō)明】預(yù)測(cè)肝衰竭預(yù)后的GSTP1甲基化定量檢測(cè)法及試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因啟動(dòng)子甲基化定量檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及預(yù)測(cè)肝衰竭預(yù)后的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶Pl (GSTPl)基因啟動(dòng)子甲基化定量檢測(cè)法及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]肝衰竭是臨床常見(jiàn)的嚴(yán)重肝病癥候群，它是由多種因素導(dǎo)致肝細(xì)胞大量壞死，造成嚴(yán)重肝臟損害，致使肝臟合成、排泄、解毒及生物轉(zhuǎn)化等功能出現(xiàn)失代償或者發(fā)生嚴(yán)重障礙的綜合征。肝衰竭主要表現(xiàn)為黃疸、凝血功能障礙、肝性腦病及腹水等。慢加急性肝衰竭(ACLF)是指在慢性肝病的基礎(chǔ)上，短期內(nèi)肝臟功能急劇惡化，出現(xiàn)肝衰竭。在我國(guó)肝衰竭的主要病因是肝炎病毒(約占85%-95%，主要是乙型肝炎病毒)感染，其次是藥物及肝毒性物質(zhì)(如酒精、化學(xué)制劑等)。而我國(guó)屬乙型肝炎高流行區(qū)，乙型肝炎發(fā)病人群眾多，2006年乙型肝炎流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，我國(guó)一般人群乙肝病毒表面抗原攜帶率為7.18%。據(jù)此推算，我國(guó)現(xiàn)有的慢性HBV感染者約9300萬(wàn)人，其中慢性乙型肝炎患者約2000萬(wàn)例。慢性HBV感染者急性發(fā)病，進(jìn)展為慢加急性肝衰竭，稱為慢加急性重型乙型病毒性肝炎(ACHBLF)。ACHBLF病情兇險(xiǎn)，預(yù)后差，病死率極高，且目前臨床上尚無(wú)評(píng)估病情及預(yù)測(cè)預(yù)后的有效方法與手段。因此，迫切需要開發(fā)用于肝衰竭病情評(píng)估及預(yù)后判斷的方法，有助于臨床醫(yī)生制訂有效的治療措施，以降低肝衰竭的發(fā)病率和死亡率。
[0003]慢加急性肝衰竭發(fā)病非常復(fù)雜，病毒和宿主等因素均參與其發(fā)生及發(fā)展過(guò)程。表觀遺傳學(xué)已被證實(shí) 參與慢性HBV感染的重癥化過(guò)程，并在其中發(fā)揮重要作用。表觀遺傳學(xué)是研究基因表達(dá)及功能改變的一門科學(xué)，它本身并不涉及基因組DNA序列的改變。表觀遺傳學(xué)調(diào)控主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾等方式。其中，DNA甲基化是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)的作用下，將S-腺苷甲硫氨酸中的甲基轉(zhuǎn)移到特定堿基上的過(guò)程。在人類基因組中，DNA甲基化主要出現(xiàn)在特定基因啟動(dòng)子區(qū)的CpG島的胞嘧啶上，從而抑制基因的轉(zhuǎn)錄，使基因表達(dá)沉默。
[0004]谷胱甘肽抗氧化酶系統(tǒng)是人體內(nèi)重要的酶系抗氧化系統(tǒng)。該系統(tǒng)主要包括谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽還原酶(GR)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)及谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)0其中，GST是參與人體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化的II相代謝酶。GST主要存在于肝細(xì)胞內(nèi)，可使有害的親電物質(zhì)與GSH結(jié)合，將其排出體外。除此之外，GST也可促進(jìn)GSH與毒性代謝產(chǎn)物結(jié)合，清除自由基，從而發(fā)揮保護(hù)機(jī)體核酸和蛋白質(zhì)的功能。GST超家族主要有8個(gè)亞家族一
a、y、j1、0、T、O、O和K。其中谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶Pl (簡(jiǎn)稱GSTPl)是GST-π亞家族的重要成員之一，也是目前GST家族中研究較多的成員。GSTPl基因是一個(gè)編碼調(diào)控GSTPl蛋白酶的解毒基因，它定位于染色體的llql3，全長(zhǎng)3kb，包括7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子。GSTPl具有極強(qiáng)的抗氧化能力，可保護(hù)肝細(xì)胞免受氧化劑的攻擊。GSTPl基因失活時(shí)，GSTPl蛋白酶的生物學(xué)功能減低甚至喪失。研究表明，GSTPl基因啟動(dòng)子甲基化程度與其表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。我們既往研究發(fā)現(xiàn)，肝衰竭患者體內(nèi)存在不同程度的氧化損傷。氧化損傷在肝衰竭的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有重要作用。GSTPl基因啟動(dòng)子高甲基化導(dǎo)致的GSTPl表達(dá)減少可加重氧化損傷引起的肝損害。GSTPl基因啟動(dòng)子的甲基化與ACLF之間存在密切關(guān)系。因此，ACLF患者GSTPl甲基化狀態(tài)的改變可反映病情與預(yù)后。
[0005]檢測(cè)DNA甲基化的方法眾多，實(shí)時(shí)定量甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)方法是現(xiàn)階段研究基因甲基化水平的有力手段。該方法是基于Taqman熒光探針的甲基化定量檢測(cè)方法，結(jié)合重亞硫酸鹽處理待測(cè)DNA片段，設(shè)計(jì)一個(gè)能與待測(cè)位點(diǎn)區(qū)互補(bǔ)的Taqman探針，通過(guò)熒光探針追蹤PCR產(chǎn)物，實(shí)時(shí)反映甲基化特異性PCR過(guò)程，分析甲基化特異性PCR產(chǎn)物，從而得到待測(cè)樣本的甲基化程度。實(shí)時(shí)定量甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)方法可克服甲基化定性檢測(cè)方法的缺點(diǎn)，消除非特異性擴(kuò)增，更好的避免DNA污染對(duì)結(jié)果的影響，確保檢測(cè)結(jié)果的特異度。該檢測(cè)方法能夠檢測(cè)到人體外周血中極微量的DNA，靈敏度高，特異性強(qiáng)，被廣泛應(yīng)用于檢測(cè)DNA含量少、損失率高的標(biāo)本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種預(yù)測(cè)肝衰竭預(yù)后的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶Pl (GSTPl)基因啟動(dòng)子甲基化定量檢測(cè)的方法及試劑盒，為臨床醫(yī)生評(píng)估肝衰竭患者病情與預(yù)后，指導(dǎo)治療提供參考依據(jù)。
[0007]為實(shí)現(xiàn)此目的，本發(fā)明提供了預(yù)測(cè)肝衰竭預(yù)后的GSTPl甲基化定量檢測(cè)法及試劑
盒
預(yù)測(cè)肝衰竭預(yù)后的GSTPl基因甲基化定量檢測(cè)試劑盒，其中包括提取待測(cè)樣本基因組DNA的試劑、重亞硫酸鹽修飾基因組DNA的試劑、5 X預(yù)混PCR反應(yīng)體系、標(biāo)準(zhǔn)品、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照以及針對(duì)目的基因GSTPl啟動(dòng)子的甲基化特異性引物對(duì)和內(nèi)參基因ALU-C4的特異性引物對(duì)與相應(yīng)的Taqman熒光探針，具體序列如下:
GSTPl-上游引物:5’ TTCGGGGTGTAGCGGTCGTC 3’ ；
GSTPl-下游引物:5’ GCCCCAATACTAAATCACGACG 3’ ；
GSTPl-探針:5’ Fam AAATCCCGCGAACTCCCGCC 3’ BHQl ；
ALU-C4-上游引物:5’ GGTTAGGTATAGTGGTTTATATTTGTAATTTTAGTA 3’ ；
ALU-C4-下游引物:5’ ATTAACTAAACTAATCTTAAACTCCTAACCTCA 3’ ；
ALU-C4-探針:5’ Fam CCTACCTTAACCTCCC 3’ BHQI。
[0008]所說(shuō)的5X預(yù)混PCR反應(yīng) 體系，包含熱啟動(dòng)Taq聚合酶、三磷酸脫氧核糖核苷、氯化鎂、反應(yīng)緩沖液、PCR反應(yīng)的增強(qiáng)劑、優(yōu)化劑以及穩(wěn)定劑。標(biāo)準(zhǔn)品為含目的基因片段的質(zhì)粒。陽(yáng)性對(duì)照為重亞硫酸鹽修飾的100%甲基化的人基因組DNA。陰性對(duì)照為雙蒸餾水。
[0009]為定量檢測(cè)GSTPl基因啟動(dòng)子甲基化程度，本發(fā)明提供的GSTPl基因啟動(dòng)子甲基化定量檢測(cè)的方法如下:
A、采集待測(cè)樣本清晨空腹外周血；
B、提取待測(cè)樣本外周血基因組DNA；
C、重亞硫酸鹽修飾基因組DNA；
D、基于Taqman熒光探針的實(shí)時(shí)定量甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)方法定量檢測(cè)GSTPl基因啟動(dòng)子甲基化程度:利用目的基因GSTPl啟動(dòng)子的甲基化特異性引物對(duì)和內(nèi)參基因ALU-C4的特異性引物對(duì)與相應(yīng)的Taqman熒光探針，對(duì)重亞硫酸鹽處理過(guò)的基因組DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)?PCR)反應(yīng)；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增結(jié)果制備標(biāo)準(zhǔn)曲線；根據(jù)目的基因GSTPl和內(nèi)參基因ALU-C4的閾值循環(huán)值，得到待測(cè)樣本中GSTPl基因啟動(dòng)子甲基化
程度的定量值。
[0010]其待測(cè)樣本GSTPl基因啟動(dòng)子甲基化程度的計(jì)算方法為:甲基化率=100%X2exp-[A Cp (樣品GSTPl Cp值-樣品ALU-C4 Cp值)-Λ Cp (陽(yáng)性對(duì)照GSTPl Cp值-陽(yáng)性對(duì)照 ALU-C4 Cp 值)]。
[0011]本發(fā)明通過(guò)甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)慢加急性肝衰竭患者外周血基因組GSTPl啟動(dòng)子甲基化程度，發(fā)現(xiàn)GSTPl基因啟動(dòng)子甲基化程度與慢加急性肝衰竭的發(fā)展間關(guān)系密切，即GSTPl基因啟動(dòng)子高甲基化可加劇慢加急性肝衰竭患者氧化應(yīng)激對(duì)肝臟的損傷。因此，本發(fā)明應(yīng)用基于Taqman熒光探針的實(shí)時(shí)定量甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)方法對(duì)不同預(yù)后的慢加急性肝衰竭患者的外周血基因組DNA進(jìn)行了檢測(cè)，首次發(fā)現(xiàn)GSTPl基因啟動(dòng)子在慢加急性肝衰竭死亡組患者中的甲基化率(PMR)明顯高于好轉(zhuǎn)組，提示GSTPl基因啟動(dòng)子甲基化程度與慢加急性肝衰竭患者的預(yù)后之間關(guān)系密切。綜合慢加急性肝衰竭患者血清總膽紅素(TBIL)、凝血酶原活動(dòng)度(PTA)及終末期肝臟病模型(MELD)評(píng)分，發(fā)現(xiàn)GSTPl 基因啟動(dòng)子 PMR 與 TBIL 水平(R2=0.380，/M).001)及 MELD (R2=0.242，TM).034)積分間存在明顯正相關(guān)，而與PTA無(wú)明顯相關(guān)(R2=-0.048，P=0.676)，提示GSTPl基因啟動(dòng)子甲基化程度與慢加急性肝衰竭患者病情發(fā)展間關(guān)系密切。因此，GSTPl基因啟動(dòng)子甲基化的定量檢測(cè)可反映慢加急性肝衰竭患者的病情與預(yù)后，指導(dǎo)治療。
[0012]本發(fā)明的創(chuàng)新點(diǎn)在于應(yīng)用基于Taqman熒光探針的實(shí)時(shí)熒光定量甲基化特異性PCR技術(shù)檢測(cè)GSTPl基因啟動(dòng)子甲基化程度，比甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(MSP-PCR)法能夠排除待測(cè)樣本中的非特異性擴(kuò)增，更好地避免DNA污染對(duì)結(jié)果的影響，提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性與特異度。
[0013]基于Taqman熒光探針的實(shí)時(shí)熒光定量甲基化特異性PCR是利用熒光標(biāo)記的Taqman熒光探針追蹤甲基化或`非甲基化的PCR產(chǎn)物，實(shí)時(shí)反映甲基化特異性PCR過(guò)程，分析甲基化特異性PCR產(chǎn)物，從而得到待測(cè)樣本的甲基化程度。由于實(shí)時(shí)定量甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)方法可克服甲基化定性檢測(cè)方法的缺點(diǎn)，能消除非特異性擴(kuò)增，更好的避免DNA污染對(duì)結(jié)果的影響，所以能確保檢測(cè)結(jié)果的特異度。由于該檢測(cè)方法能夠檢測(cè)到人體外周血中極微量的DNA，所以提高了其檢測(cè)的靈敏度。由于該檢測(cè)方法靈敏度高、特異性強(qiáng)，因而被廣泛應(yīng)用于檢測(cè)DNA含量少、損失率高的標(biāo)本。標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)流程、規(guī)范的操作及各操作節(jié)點(diǎn)的質(zhì)控，使該檢測(cè)方法得到的檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定可靠。本發(fā)明采用試劑盒組裝，檢測(cè)快速、結(jié)果準(zhǔn)確、直觀。此外，本發(fā)明待測(cè)樣本取自慢加急性肝衰竭患者的外周血，具有操作簡(jiǎn)便、病人創(chuàng)傷小而易于接受等顯著優(yōu)點(diǎn)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014]為更好地說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，以下將結(jié)合具體附圖來(lái)詳細(xì)解說(shuō)，其中:
圖1為GSTPl標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)序圖。
[0015]圖中:A:腺嘌呤；C:胞嘧啶；G:鳥嘌呤；T:胸腺嘧啶。
[0016]圖2為實(shí)時(shí)熒光定量甲基化特異性PCR檢測(cè)GSTPl的擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0017]圖中Amplification Curves:擴(kuò)增曲線；Crossing Point:閾值循環(huán)值；Cycles:循環(huán)數(shù)！Efficiency:擴(kuò)增效率；Error:誤差！Fluorescence:突光；LogConcentration:對(duì)數(shù)濃度；Standard Curve:標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0018]圖3為實(shí)時(shí)熒光定量甲基化特異性PCR檢測(cè)ALU-C4的擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0019]圖中 Amplification Curves:擴(kuò)增曲線；Crossing Point:閾值循環(huán)值；Cycles:循環(huán)數(shù)！Efficiency:擴(kuò)增效率；Error:誤差！Fluorescence:突光；LogConcentration:對(duì)數(shù)濃度；Standard Curve:標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0020]圖4為實(shí)時(shí)熒光定量甲基化特異性PCR檢測(cè)慢加急性肝衰竭患者基因組DNAGSTPl的擴(kuò)增曲線。
[0021]圖中Amplification Curves:擴(kuò)增曲線；Cycles:循環(huán)數(shù)；Fluorescence:突光。
[0022]圖5為實(shí)時(shí)熒光定量甲基化特異性PCR檢測(cè)慢加急性肝衰竭患者基因組DNAALU-C4的擴(kuò)增曲線。
[0023]圖中Amplification Curves:擴(kuò)增曲線；Cycles:循環(huán)數(shù)；Fluorescence:突光。
[0024]圖6為不同預(yù)后慢加急性肝衰竭患者GSTPl基因啟動(dòng)子甲基化率的比較。
[0025]圖7為慢加急性肝衰竭患者GSTPl基因啟動(dòng)子甲基化率與血清TBIL和MELD積分的相關(guān)性
圖中:MELD Score:終末期肝臟病模型評(píng)分；PMR:甲基化率；TBIL:總膽紅素。
[0026]圖8為利用GSTPl基 因啟動(dòng)子甲基化率來(lái)判斷慢加急性肝衰竭患者預(yù)后的受試者工作特征曲線。
[0027]圖中:AUR0C:受試者工作特征曲線(ROC)下面積！Sensitivity:敏感性；Specificity:特異性。
[0028]【具體實(shí)施方式】
以下結(jié)合附圖與實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的具體內(nèi)容作進(jìn)一步闡明:
預(yù)測(cè)肝衰竭預(yù)后的GSTPl基因甲基化定量檢測(cè)試劑盒內(nèi)主要試劑包括:提取待測(cè)樣本基因組DNA的試劑、重亞硫酸鹽修飾基因組DNA的試劑、5X預(yù)混PCR反應(yīng)體系、標(biāo)準(zhǔn)品、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照以及針對(duì)目的基因GSTPl啟動(dòng)子的甲基化特異性引物對(duì)和內(nèi)參基因ALU-C4的特異性引物對(duì)與相應(yīng)的Taqman熒光探針，具體序列如下:
GSTPl-上游引物:5’ TTCGGGGTGTAGCGGTCGTC 3’ ；
GSTPl-下游引物:5’ GCCCCAATACTAAATCACGACG 3’ ；
GSTPl-探針:5’ Fam AAATCCCGCGAACTCCCGCC 3’ BHQl ；
ALU-C4-上游引物:5’ GGTTAGGTATAGTGGTTTATATTTGTAATTTTAGTA 3’ ；
ALU-C4-下游引物:5’ATTAACTAAACTAATCTTAAACTCCTAACCTCA 3’ ；
ALU-C4-探針:5’ Fam CCTACCTTAACCTCCC 3’ BHQI。
[0029]其中，提取外周血基因組DNA的試劑可以采用核酸純化試劑盒(QIAamp DNABlood MiniKit，如貨號(hào):51104)，也可以采用類似功能的其他試劑盒；
重亞硫酸鹽修飾基因組DNA的試劑可以采用甲基化DNA轉(zhuǎn)化試劑盒(EZ DNAMethylation-Gold Kit,如貨號(hào):D5005),也可以采用類似功能的其他試劑盒；
5 X預(yù)混PCR反應(yīng)體系包含熱啟動(dòng)Taq聚合酶、三磷酸脫氧核糖核苷、氯化鎂、反應(yīng)緩沖液、PCR反應(yīng)的增強(qiáng)劑、優(yōu)化劑以及穩(wěn)定劑。
[0030]標(biāo)準(zhǔn)品為包含目的基因片段的質(zhì)粒，即對(duì)目的基因片段進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化后連接入T載體，轉(zhuǎn)化至工程菌內(nèi)，進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序。從測(cè)序驗(yàn)證正確的重組菌中提取純化質(zhì)粒，作為GSTPl標(biāo)準(zhǔn)品。標(biāo)準(zhǔn)品可評(píng)估PCR反應(yīng)效率、靈敏度及可重復(fù)性，從而為PCR反應(yīng)提供質(zhì)量控制。
[0031]陽(yáng)性對(duì)照為100%甲基化的人基因組DNA，即從健康人白細(xì)胞中提取DNA后利用CpG甲基化轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行體外甲基化，通過(guò)重亞硫酸鹽修飾獲得。陰性對(duì)照為雙蒸水。
[0032]為定量檢測(cè)GSTPl基因啟動(dòng)子甲基化程度，本發(fā)明提供的GSTPl基因啟動(dòng)子甲基化定量檢測(cè)的方法是:采集待測(cè)樣本清晨空腹外周血；提取待測(cè)樣本外周血基因組DNA ;重亞硫酸鹽修飾基因組DNA ;基于Taqman熒光探針的實(shí)時(shí)定量甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)方法定量檢測(cè)GSTPl基因啟動(dòng)子甲基化程度:利用目的基因GSTPl啟動(dòng)子的甲基化特異性引物對(duì)和內(nèi)參基因ALU-C4的特異性引物對(duì)與相應(yīng)的Taqman熒光探針，對(duì)重亞硫酸鹽處理過(guò)的基因組DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)?PCR)反應(yīng)；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增結(jié)果制備標(biāo)準(zhǔn)曲線；根據(jù)目的基因GSTPl和內(nèi)參基因ALU-C4的閾值循環(huán)值，得到待測(cè)樣本中GSTPl基因啟動(dòng)子甲基化程度的定量值。
[0033]應(yīng)用基于Taqman熒光探針的實(shí)時(shí)熒光定量甲基化特異性PCR檢測(cè)慢加急性肝衰竭患者GSTPl基因啟動(dòng)子甲基化程度的方法為其操作步驟為:
1、抽取慢加急性肝衰竭(ACLF)患者外周靜脈血。
[0034]2、提取外周血基因組DNA
提取外周血基因組DNA的方法有硅膠膜離心柱吸附法、溶液型試劑盒法及酚氯仿手工提法等多種方法。本發(fā)明采用的方法為硅膠膜離心柱吸附法(參照QIAamp DNA BloodMiniKit說(shuō)明書),具體步驟如下:
(1)將20μ1蛋白酶加入離心管中；
(2)將200μ1全血加入(I)中的離心管中；
(3)向(2)中離心管中加入200μ1裂解緩沖液，渦旋混勻15-30秒；
(4)將(3)中離心管放入56°C水浴鍋中孵育10分鐘，瞬時(shí)離心以移除附著于管蓋內(nèi)的液體；
(5)將200μ196-100%乙醇加至微量離心管中，渦旋混勻15-30秒，瞬時(shí)離心以移除附
著于管蓋內(nèi)的液體；
(6)將上述液體加入離心柱中(置于收集管中)，離心力6000Xg,時(shí)間I分鐘離心，置入
另一新收集管中；
(7)將500μ1漂洗緩沖液I加入離心柱中，再次離心(離心力與時(shí)間同上)，置入另一新
收集管中；
(8)將500μ1漂洗緩沖液2加入離心柱中，離心(20000X g，3分鐘)；
(9)離心柱置入一個(gè)新微量離心管中，隨后向其中加入200μ1洗脫緩沖液，室溫孵育I分鐘，離心(離心力同步驟5)，得到DNA提取液；
(10)利用紫外分管光度計(jì)測(cè)定提取的DNA的吸光度，確定其含量與純度，將DNA提取液置于-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0035]2.重亞硫酸鹽修飾基因組DNA
參照EZ DNA Methylation-Gold Kit說(shuō)明書，對(duì)基因組DNA進(jìn)行重亞硫酸鹽甲基化修飾。甲基化修飾是將基因組DNA序列中非甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶。修飾后的DNA用作實(shí)時(shí)熒光定量PCR的擴(kuò)增模板。具體步驟如下:(1)制備轉(zhuǎn)化劑:瞬時(shí)離心裝有轉(zhuǎn)化劑粉末的管，使粉末全部位于管底。向管中加入900μ1雙蒸水、300μ1稀釋緩沖液和50μ1溶解緩沖液加，渦旋振動(dòng)10分鐘以混勻，瞬時(shí)離心以移除附著于管蓋的混合液；
(2)取130μ1轉(zhuǎn)化劑加至PCR管中，再向其中加入20ulDNA樣本；
(3)將PCR管置于PCR儀中反應(yīng)，條件為:98°C，10分鐘；64°C，2.5小時(shí)，4°C保存；
(4)將600μ1結(jié)合緩沖液加入離心柱，并將其置于收集管中；
(5)將來(lái)自第3步的反應(yīng)樣本加入(4)的離心柱中，蓋蓋，顛倒混勻30-60秒；
(6)最高轉(zhuǎn)速O1000OXg)離心30-45秒，倒空收集管中液體；
(7)向離心柱中加入ΙΟΟμΙ洗滌緩沖液，最高速離心30-45秒，倒空收集管中液體；
(8)向離心柱中加入200μ?脫磺化緩沖液，室溫靜置15-20分鐘，最高速離心30-45秒，倒空收集管中液體；
(9)將200μ1洗滌緩沖液加入離心柱中，最高速離心30-45秒。重復(fù)洗滌一次，倒掉管中液體；
(10)向離心柱中加入10μ1洗脫緩沖液，將其置于微量離心管中，最高速離心30-45秒，得到修飾好的DNA ； (11)利用紫外分光光度計(jì)測(cè)DNA含量與純度，置于_20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> [0036]3.基于Taqman熒光探針的實(shí)時(shí)熒光定量甲基化特異性PCR
(1)引物與探針設(shè)計(jì):
GSTPl引物對(duì)及探針:
GSTPl-上游引物:5’ TTCGGGGTGTAGCGGTCGTC 3’ ；
GSTPl-下游引物:5’ GCCCCAATACTAAATCACGACG 3’ ；
GSTPl-探針:5’ Fam AAATCCCGCGAACTCCCGCC 3’ BHQl ；
ALU-C4引物對(duì)及探針:
ALU-C4-上游引物:5’ GGTTAGGTATAGTGGTTTATATTTGTAATTTTAGTA 3’
ALU-C4-下游引物:5’ ATTAACTAAACTAATCTTAAACTCCTAACCTCA 3’
ALU-C4-探針:5’ Fam CCTACCTTAACCTCCC 3’ BHQl
(2)實(shí)時(shí)熒光定量甲基化特異性PCR檢測(cè)GSTPl基因啟動(dòng)子甲基化程度:
按表1所示配制實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)?PCR)反應(yīng)體系。
[0037]表1實(shí)時(shí)熒光定量甲基化特異性PCR反應(yīng)體系
【權(quán)利要求】
1.預(yù)測(cè)肝衰竭預(yù)后的GSTPl甲基化定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于:該試劑盒含有提取待測(cè)樣本基因組DNA的試劑、重亞硫酸鹽修飾基因組DNA的試劑、5X預(yù)混PCR反應(yīng)體系、標(biāo)準(zhǔn)品、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照以及針對(duì)目的基因GSTPl啟動(dòng)子的甲基化特異性引物對(duì)和內(nèi)參基因ALU-C4的特異性引物對(duì)與相應(yīng)的Taqman熒光探針，具體序列如下: GSTPl-上游引物:5’ TTCGGGGTGTAGCGGTCGTC 3’ ； GSTPl-下游引物:5’ GCCCCAATACTAAATCACGACG 3’ ； GSTPl-探針:5，F(xiàn)am AAATCCCGCGAACTCCCGCC 3’ BHQl ； ALU-C4-上游引物:5’ GGTTAGGTATAGTGGTTTATATTTGTAATTTTAGTA 3’ ； ALU-C4-下游引物:5’ ATTAACTAAACTAATCTTAAACTCCTAACCTCA 3’ ； ALU-C4-探針:5’ Fam CCTACCTTAACCTCCC 3’ BHQI。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)測(cè)肝衰竭預(yù)后的GSTPl甲基化定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于:5X預(yù)混PCR反應(yīng)體系，包含熱啟動(dòng)Taq聚合酶、三磷酸脫氧核糖核苷、氯化鎂、反應(yīng)緩沖液、PCR反應(yīng)的增強(qiáng)劑、優(yōu)化劑以及穩(wěn)定劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)測(cè)肝衰竭預(yù)后的GSTPl甲基化定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于:標(biāo)準(zhǔn)品為含目的基因片段的質(zhì)粒。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)測(cè)肝衰竭預(yù)后的GSTPl甲基化定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于:陽(yáng)性對(duì)照為重亞硫 酸鹽修飾的100%甲基化的人基因組DNA。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)測(cè)肝衰竭預(yù)后的GSTPl甲基化定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于:陰性對(duì)照為雙蒸餾水。
6.預(yù)測(cè)肝衰竭預(yù)后的GSTPl甲基化定量檢測(cè)法，其特征在于:采集待測(cè)樣 本清晨空腹外周血；提取待測(cè)樣本外周血基因組DNA ;重亞硫酸鹽修飾基因組DNA ;定量檢測(cè)GSTPl基因啟動(dòng)子甲基化程度:利用目的基因GSTPl啟動(dòng)子的甲基化特異性引物對(duì)和內(nèi)參基因ALU-C4的特異性引物對(duì)與相應(yīng)的Taqman熒光探針，對(duì)重亞硫酸鹽處理過(guò)的基因組DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)?PCR)反應(yīng)；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增結(jié)果制備標(biāo)準(zhǔn)曲線；根據(jù)目的基因GSTPl和內(nèi)參基因ALU-C4的閾值循環(huán)值，得到待測(cè)樣本中GSTPl基因啟動(dòng)子甲基化程度的定量值。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的預(yù)測(cè)肝衰竭預(yù)后的GSTPl甲基化定量檢測(cè)法，其特征在于:待測(cè)樣本GSTPl基因啟動(dòng)子甲基化程度的計(jì)算方法為:甲基化率=100%X2 exp-[ACp(樣品GSTPl Cp值-樣品ALU-C4 Cp值)-Δ Cp(陽(yáng)性對(duì)照GSTPl Cp值-陽(yáng)性對(duì)照ALU-C4 Cp值)]。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103805699SQ201410034797
【公開日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2014年1月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月25日
【發(fā)明者】王凱, 趙靜, 王麗媛, 孫豐凱, 高帥, 范玉琛, 范曉鵬 申請(qǐng)人:山東大學(xué)齊魯醫(yī)院