一種肉制品中植物源性轉(zhuǎn)基因成分多重?zé)晒舛縫cr檢測方法和檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種肉制品中植物源性轉(zhuǎn)基因成分多重?zé)晒舛縋CR檢測方法和檢測試劑盒。這種試劑盒及檢測方法以轉(zhuǎn)基因調(diào)控元件CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子以及標(biāo)記基因NPTII為檢測對(duì)象，同時(shí)針對(duì)多個(gè)基因片段進(jìn)行檢測，可以有效應(yīng)對(duì)肉制品等深加工產(chǎn)品中DNA遭受破壞的問題，降低假陰性幾率，而且解決了轉(zhuǎn)基因源不確定性的問題，同時(shí)滿足目前的快速、靈敏、操作簡便、高通量、低成本的檢測要求，實(shí)現(xiàn)對(duì)該類產(chǎn)品植物源性轉(zhuǎn)基因成分有效分析、監(jiān)控。
【專利說明】-種肉制品中植物源性轉(zhuǎn)基因成分多重焚光定量PCR檢測 方法和檢測試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種本發(fā)明涉及一種肉制品中植物源性轉(zhuǎn)基因成分多重?zé)晒舛縋CR 檢測方法和檢測試劑盒，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 目前，我國肉制品產(chǎn)量和消費(fèi)量均居世界首位。在現(xiàn)代肉類產(chǎn)品加工過程中，為 改善肉制品的品質(zhì)、優(yōu)化產(chǎn)品質(zhì)量、確保營養(yǎng)均衡，植物源的成份如植物蛋白、淀粉、膳食纖 維、食用膠、植物油以及各種調(diào)味品等被運(yùn)用到肉制品的加工中。隨著轉(zhuǎn)基因植物的大規(guī)模 商品化，多種轉(zhuǎn)基因作物豆、水稻、玉米、油菜籽等及其加工產(chǎn)品已廣泛應(yīng)用于食品制造業(yè)， 因此，在肉制品年加工過程中植物源成分被添加的同時(shí)，轉(zhuǎn)基因成分間接地、不可避免地會(huì) 滲入到肉制品的領(lǐng)域。因此，敏感、快速、準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)基因食品定性及定量檢測方法的研究日 益受到重視。核酸檢測方法是最常用以及最適用的檢測轉(zhuǎn)基因食品的方法，主要有定性PCR 方法、熒光定量PCR，其中熒光定量PCR是近年來發(fā)展起來的一種分子生物學(xué)檢測技術(shù)，由 于具有高靈敏度、高特異性、可計(jì)量性、自動(dòng)化程度高，被廣泛運(yùn)用在轉(zhuǎn)基因食品、病原微生 物、疾控等檢測領(lǐng)域。但是，其檢測皆是以單一的目標(biāo)為檢測對(duì)象，經(jīng)過復(fù)雜的加工程序， DNA會(huì)受到物理、化學(xué)或酶因子等因素的影響，導(dǎo)致不同程度的破壞。這給目前現(xiàn)行的單 一檢測對(duì)象的方法帶來很大的挑戰(zhàn)和風(fēng)險(xiǎn)，且被引入的轉(zhuǎn)基因成分來源具有很大的不確定 性，采用單一的檢測方法--進(jìn)行，勢必操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)費(fèi)力且成本較大?？傊?，單一目標(biāo)的 檢測方法在肉制品等深加工產(chǎn)品轉(zhuǎn)基因檢測中，具有很大的漏洞和弊端，很難有效地對(duì)這 類產(chǎn)品進(jìn)行監(jiān)測。多重?zé)晒舛縋CR在此基礎(chǔ)上應(yīng)運(yùn)而生，但是目前的技術(shù)還不完善，其運(yùn) 用領(lǐng)域也有很多空白。多重?zé)晒舛縋CR是基于Taqman探針法熒光定量PCR的基礎(chǔ)上，通 過使用多對(duì)引物和相應(yīng)的標(biāo)記有不同的熒光信號(hào)的探針，在同一個(gè)反應(yīng)體系中對(duì)多個(gè)目標(biāo) 序列進(jìn)行同時(shí)檢測，實(shí)現(xiàn)高通量、低成本的檢測需求。因此，針對(duì)轉(zhuǎn)基因技術(shù)常用的通用元 件和標(biāo)記基因，開發(fā)多重?zé)晒釶CR檢測技術(shù)，對(duì)多個(gè)目標(biāo)片段進(jìn)行檢測是當(dāng)務(wù)之急，以彌補(bǔ) 目前的許多運(yùn)用領(lǐng)域的空白。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種新的肉制品中植物源性轉(zhuǎn)基因成分多重?zé)晒舛?PCR檢測方法和檢測試劑盒。
[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種肉制品中植源性轉(zhuǎn)基因成分的多重?zé)晒舛縋CR檢測 方法，包括DNA提取和PCR檢測兩個(gè)步驟，其特征在于：所述的DNA提取步驟為將肉制品樣 品經(jīng)剪碎或研磨均質(zhì)后，按照組織基因組DNA提取方法進(jìn)行DNA抽提；所述的PCR檢測步驟 為將CaMV 35S啟動(dòng)子、NOS終止子和標(biāo)記基因 NPTII的特異性引物和探針、預(yù)混熒光定量 PCR反應(yīng)體系、DNA模板和CldH2O按一定比例用量加入熒光定量PCR反應(yīng)管，再將熒光定量 PCR反應(yīng)管放入熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后搜集熒光信號(hào)，同時(shí)進(jìn)行平行試驗(yàn)。
[0005] 進(jìn)一步的，所述的CaMV 35S啟動(dòng)子、NOS終止子和標(biāo)記基因 NPTII的特異性引物 和探針的喊基排列順序?yàn)椋?CaMV 35S 反向引物：5' - CGACAGTGGTCCCAAAGA - 3' 正向引物：5' - AAGACGTGGTTGGAACGTCTTC - 3' 探針：5，F(xiàn)AM-TGGACCCCCACCCACGAGGAGCATC-TAMRA3' ； NOS 反向引物：5' - TCT TAAGATTGAA TCCTGTT - 3' 正向引物：5' - ATTGCGGGACTCTAATCATA - 3' 探針：5，HEX-CAGAAATTATATGATAATCATCGCAAGTCC -TAMRA3，； NPT II 反向引物：5' - AGGATCTCGTCGTGACCCAT - 3' 正向引物：5' - GCACGAGGAAGCGGT - 3' 探針：5, R0X-CACCCAGCCGGCCACAGTCGAT-TAMRA3'。
[0006] 進(jìn)一步的，所述的PCR檢測步驟中各組分的加入量如下表所示：

【權(quán)利要求】
1. 一種肉制品中植源性轉(zhuǎn)基因成分的多重?zé)晒舛縋CR檢測方法，包括DNA提取和 PCR檢測兩個(gè)步驟，其特征在于：所述的DNA提取步驟為將肉制品樣品經(jīng)剪碎或研磨均質(zhì) 后，按照組織基因組DNA提取方法進(jìn)行DNA抽提；所述的PCR檢測步驟為將所屬CaMV 35S 啟動(dòng)子、NOS終止子和標(biāo)記基因 NPTII的特異性引物和探針、預(yù)混熒光定量PCR反應(yīng)體系、 DNA模板和CldH2O按一定比例用量加入熒光定量PCR反應(yīng)管，再將熒光定量PCR反應(yīng)管放入 熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后搜集熒光信號(hào)，同時(shí)進(jìn)行平行試驗(yàn)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的肉制品中植源性轉(zhuǎn)基因成分的多重?zé)晒舛縋CR檢測方法， 其特征在于：所述的所屬CaMV 35S啟動(dòng)子、NOS終止子和標(biāo)記基因 NPTII的特異性引物和 探針的喊基排列順序?yàn)椋?CaMV 35S 反向引物：5' - CGACAGTGGTCCCAAAGA - 3' 正向引物：5' - AAGACGTGGTTGGAACGTCTTC - 3' 探針：5，F(xiàn)AM-TGGACCCCCACCCACGAGGAGCATC-TAMRA3' ； NOS 反向引物：5' - TCT TAAGATTGAA TCCTGTT - 3' 正向引物：5' - ATTGCGGGACTCTAATCATA - 3' 探針：5，HEX-CAGAAATTATATGATAATCATCGCAAGTCC -TAMRA3，； NPT II 反向引物：5' - AGGATCTCGTCGTGACCCAT - 3' 正向引物：5' - GCACGAGGAAGCGGT - 3' 探針：5, R0X-CACCCAGCCGGCCACAGTCGAT-TAMRA3'。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的肉制品中植源性轉(zhuǎn)基因成分的多重?zé)晒舛縋CR檢測方法， 其特征在于：所述的PCR檢測步驟中各組分的加入量如下表所示：
)
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的肉制品中植源性轉(zhuǎn)基因成分的多重?zé)晒舛縋CR檢測方法， 其特征在于：所述的DNA模板為標(biāo)準(zhǔn)品或提取的DNA ;所述DNA模板為標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)作為陽性對(duì) 照管；所述DNA模板為提取的DNA時(shí)作為測試管。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的肉制品中植源性轉(zhuǎn)基因成分的多重?zé)晒舛縋CR檢測方法， 其特征在于：所述標(biāo)準(zhǔn)品序列應(yīng)包含以下序列： CaMV 35S ：AAGACGTGGTTGGAACGTCTTCTTTTTCCACGATGCTCCT CGTGGGTGGG GGTCCATCTTTGGGACCACTGTCG ； NOS:TCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATTAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCA TGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGA TTAGAGTCCC GCAATTA ； NPT II ：GCACGAGGAAGCGGTCAGCCCATTCGCCGCCAAGCTCTTCAGCAATATCA CGGGTAGCCAACGCTA TGTCCTGATAGCGGTCCGCCACACCCAGCCGGCCACAGTCGATGAATCCAGAAAAGCGGCCATTTTCCACCATGATA TTCGGCAAGCAGGCATCGCCATGGGTC ACGACGAGAT CCT〇
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的肉制品中植物源性轉(zhuǎn)基因成分多重?zé)晒舛縋CR檢測方法， 其特征在于：所述的熒光定量PCR儀設(shè)置的反應(yīng)參數(shù)為95°C變性lmin30s，以95°C 5s， 58°C 30s，72°C 30 s擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，設(shè)置58°C結(jié)束后開始收集熒光信號(hào)。
7. -種權(quán)利要求1所述的肉制品中植物源性轉(zhuǎn)基因成分多重?zé)晒舛縋CR檢測方法 中使用的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒包括轉(zhuǎn)基因調(diào)控元件、預(yù)混熒光定量PCR反應(yīng)體 系、標(biāo)準(zhǔn)品和CldH2O ;所述的轉(zhuǎn)基因調(diào)控元件包括所屬CaMV 35S啟動(dòng)子、NOS終止子和標(biāo)記 基因 NPTII的特異性引物和探針；所述的標(biāo)準(zhǔn)品包括CaMV 35S啟動(dòng)子、NOS終止子和標(biāo)記 基因 NPTII的目標(biāo)擴(kuò)增片段。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的肉制品中植物源性轉(zhuǎn)基因成分多重?zé)晒舛縋CR檢測方法 中使用的試劑盒，其特征在于：所述的所屬CaMV 35S啟動(dòng)子、NOS終止子和標(biāo)記基因 NPTII 的特異性引物和探針為肉制品中植物源性轉(zhuǎn)基因成分多重?zé)晒舛縋CR檢測方法中的所 屬CaMV 35S啟動(dòng)子、NOS終止子和標(biāo)記基因 NPTII的特異性引物和探針。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的肉制品中植物源性轉(zhuǎn)基因成分多重?zé)晒舛縋CR檢測方法中 使用的試劑盒，其特征在于：所述的CaMV 35S啟動(dòng)子、NOS終止子和標(biāo)記基因 NPTII的目標(biāo) 擴(kuò)增片段為肉制品中植物源性轉(zhuǎn)基因成分多重?zé)晒舛縋CR檢測方法中的CaMV 35S啟動(dòng) 子、NOS終止子和標(biāo)記基因 NPTII的目標(biāo)擴(kuò)增片段。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104388539SQ201410033119
【公開日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2014年1月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月24日
【發(fā)明者】邵彪, 黃偉東, 季葛振, 羅鑫 申請(qǐng)人:南通市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所