一種檢測(cè)人心臟微血管損傷標(biāo)志物miRNA21的引物及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測(cè)人心臟微血管損傷標(biāo)志物miRNA21的引物及其應(yīng)用，具體提供了一種檢測(cè)人心臟微血管損傷標(biāo)志物miRNA21的引物、該引物的用途、包含該引物的試劑盒以及試劑盒的用途，所述引物的序列為：引物I：5’GCGGTAGCTTATCAGACTG3’；引物II：5’CAGTGCGTGTCGTGGAGT3’。本發(fā)明為心臟微血管損傷提供了一種特異性強(qiáng)、靈敏度高、快捷、易于被患者接受的臨床診斷方法。
【專利說明】—種檢測(cè)人心臟微血管損傷標(biāo)志物miRNA21的引物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子診斷【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說，是一種檢測(cè)人心臟微血管損傷標(biāo)志物miRNA21的引物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]前期研究發(fā)現(xiàn)，柯薩奇B3病毒(CVB3)感染能損傷心臟微血管。以往對(duì)于心臟微血管的損傷缺乏靈敏、特異的診斷方法，傳統(tǒng)的病理學(xué)方法存在著操作復(fù)雜、有創(chuàng)性等缺點(diǎn)，病人難以接受，臨床上無法推廣應(yīng)用。因此，尋找一種高靈敏、特異性強(qiáng)、操作方便且病人能夠接受的檢測(cè)方法有著重要的臨床意義。
[0003]近年來的研究表明miRNA可能參與心血管系統(tǒng)的發(fā)育、分化和病理過程，其在心血管疾病中的調(diào)控作用日益受到重視。首先，miRNA的表達(dá)具有組織特異性，作為一類重要的調(diào)節(jié)因子，miRNA通過降解、翻譯抑制或激活目標(biāo)RNA調(diào)節(jié)其目標(biāo)基因的表達(dá)，而循環(huán)血中存在的特異性miRNA則有望作為心血管疾病的特異性標(biāo)志物。
[0004]中國(guó)期刊《中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十五次全國(guó)心血管病學(xué)大會(huì)論文匯編》，2013年刊出的論文《miRNA21通過靶基因H)⑶4在柯薩奇B3病毒(CVB3)誘導(dǎo)的心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用和機(jī)制》，作者探討了 miRNA21通過靶基因程序性死亡蛋白4(H)⑶4)在柯薩奇B3病毒(CVB3)誘導(dǎo)的心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用和機(jī)制，通過在CVB3感染的CMECs模型上，采用miRNA芯片和qRT-PCR篩選并驗(yàn)證表達(dá)顯著差異的miRNA21，發(fā)現(xiàn)CMECs感染CVB3后miRNA21的表達(dá)上調(diào)了 3.65倍，提示miRNA21可作為檢測(cè)CVB3誘導(dǎo)的心臟微血管損傷的標(biāo)志物，為病毒性心肌炎和擴(kuò)張性心肌病`的臨床診斷、療效及預(yù)后判斷提供了新的指標(biāo)。但是目前關(guān)于可特異性檢測(cè)miRNA21且靈敏度高，檢測(cè)方法簡(jiǎn)單快捷，能充分滿足臨床需求的診斷試劑及方法還未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種檢測(cè)人心臟微血管損傷標(biāo)志物miRNA21的引物。
[0006]本發(fā)明的再一的目的是，提供上述引物的用途。
[0007]本發(fā)明的另一的目的是，提供一種診斷人心臟微血管損傷的試劑盒。
[0008]本發(fā)明的第四個(gè)目的是，提供上述試劑盒的用途。
[0009]為實(shí)現(xiàn)上述第一個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:
一種檢測(cè)人心臟微血管損傷標(biāo)志物miRNA21的引物，所述的引物的序列為:
引物 1:5’ GCGGTAGCTTATCAGACTG3’ ；
引物 I1:5’ CAGTGCGTGTCGTGGAGT3’
為實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:
如上所述的引物在制備檢測(cè)或診斷人心臟微血管損傷藥物中的應(yīng)用。[0010]其中，所述的人心臟微血管損傷可以是柯薩奇B3病毒感染所致的心臟微血管損傷，如病毒性心肌炎、擴(kuò)張性心肌病等。
[0011]為實(shí)現(xiàn)上述第三個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:
一種診斷人心臟微血管損傷的試劑盒，所述的試劑盒包括如上所述的引物。
[0012]優(yōu)選地，所述的試劑盒還包括以下引物:
引物 II1:5’ GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT3’ ；
引物 IV:5’ CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT3’。
[0013]優(yōu)選地，所述的試劑盒還包括dNTPs、Taq DNA聚合酶和PCR反應(yīng)液。
[0014]為實(shí)現(xiàn)上述第四個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:
如上任一所述的試劑盒在制備檢測(cè)或診斷人心臟微血管損傷藥物中的應(yīng)用。
[0015]其中，所述的人心臟微血管損傷可以是柯薩奇B3病毒感染所致的人心臟微血管損傷。
[0016]本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于:本發(fā)明的引物能用于檢測(cè)或診斷人心臟微血管損傷，尤其是柯薩奇B3病毒感染所致的人心臟微血管損傷，相比于其它引物特異性、靈敏度都顯著較高，從而為該疾病的臨床診斷提 供了一種特異性強(qiáng)、靈敏度高、快捷的檢測(cè)方法，且易于被患者接受，適于制備成試劑盒在臨床上普遍推廣。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]附圖1是病毒性心肌炎組與對(duì)照組外周血中miRNA21表達(dá)差異比較。
[0018]附圖2是miRNA21擴(kuò)增曲線。
[0019]附圖3是內(nèi)參U6擴(kuò)增曲線。
[0020]附圖4是miRNA21溶解曲線。
[0021]附圖5是內(nèi)參U6溶解曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0022]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明提供的【具體實(shí)施方式】作詳細(xì)說明。
[0023]實(shí)施例1 qRT-PCR檢測(cè)人外周血中miRNA21表達(dá) 一、標(biāo)本采集
臨床收集確診為病毒性心肌炎、CVB3中和抗體陽(yáng)性的心肌炎患者50例以及正常對(duì)照20例，均簽署知情同意書。靜脈采血1ml，EDTA抗凝，盡快送到實(shí)驗(yàn)室。
[0024]二、樣品的RNA抽提
TRI REAGENT BD試劑購(gòu)于MRCGENE，氯仿、異丙醇、100%乙醇購(gòu)于上?；瘜W(xué)試劑有限公司，75%乙醇以DEPC處理的水配制，冰醋酸購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，無RNA酶水和無 RNA 酶糖原購(gòu)于 Invitrogen life technologies。
[0025]1、勻漿
在1.5ml的離心管中分別加入250 μ I外周血液樣品、750 μ I的TRI REAGENT BD試劑和20 μ I冰醋酸，手動(dòng)劇烈振蕩管體至混勻。
[0026]2、兩相分離
勻漿后樣品于室溫孵育5分鐘，以便核酸蛋白復(fù)合體完全解離。每750 μ I的TRIREAGENT BD試劑勻漿的樣品中加入0.2ml的氯仿，蓋緊管蓋。手動(dòng)劇烈振蕩管體15秒后，室溫孵育2-3分鐘。4° C下12，OOOXg離心15分鐘。離心后混合液體分為下層的紅色酚氯仿相、中間層和上層無色水相。RNA全部被分配于上側(cè)無色水相中。上層無色水相的體積大約是勻漿時(shí)加入的TRI REAGENT BD試劑體積的60%。
[0027]3、RNA 沉淀
將上層無色水相轉(zhuǎn)移到新離心管中，并加入500 μ I異丙醇，混勻以沉淀其中的RNA?；靹蚝笫覝胤跤?0分鐘，于4° C、12，000 Xg離心10分鐘。此時(shí)離心前不可見的RNA沉淀在管底部/側(cè)壁上形成肉眼可見的沉淀塊。
[0028]4、RNA 清洗
移去上清液，750 μ I的TRI REAGENT BD試劑勻漿的樣品中加入至少Iml的75%乙醇，清洗RNA沉淀。振蕩后，4° C、7，500 Xg離心5分鐘。
[0029]5、重新溶解RNA沉淀
去除乙醇溶液，空氣中干燥RNA沉淀15分鐘。注意RNA沉淀不要完全干燥，否則將大大降低RNA的可溶性，部分溶解的RNA樣品A26tl丨280比值將小于1.6。溶解RNA時(shí)，先加入無RNA酶水用槍反復(fù)吹打幾次，然后55-60° C孵育10分鐘。獲得的RNA溶液保存于-70° C。
[0030]三、RNA質(zhì)量檢測(cè)
TE 緩沖液:10mM Tris-HCl，ImM EDTA, pH8 (Tris_HCl、EDTA 購(gòu)于華美生物工程公司)；0.2M M0PS，pH7.0 (MOPS購(gòu)于華美生物工程公司);0.02M乙酸鈉(乙酸鈉購(gòu)于上海化學(xué)試劑有限公司)；0.01M EDTA (EDTA購(gòu)于華美生物工程公司)；甲醛購(gòu)于上海化學(xué)試劑有限公司；甲醛上樣染液購(gòu)于Ambion5Go`ld View染料購(gòu)于上海賽百勝基因技術(shù)有限公司；瓊脂糖購(gòu)于生工生物工程有限公司。
[0031]1、紫外吸收測(cè)定法
使用NanoDrop? ND-1000測(cè)定RNA濃度和純度，測(cè)量前先用溶解RNA用的DEPC水調(diào)零，操作方法如下:
Cl)滴加?μ? DEPC水或者RNA樣品至測(cè)量基座的表面；
(2)液滴會(huì)自動(dòng)在上下基座之間形成液柱并自動(dòng)完成測(cè)定，RNA濃度及質(zhì)量的各種參數(shù)將在電腦中自動(dòng)生成文件；
(3)—次測(cè)定完成后，用柔軟的擦鏡紙擦去上下基座表面上的樣本液，便可進(jìn)行下一個(gè)樣品的測(cè)量；
(4)測(cè)定結(jié)果 ①濃度測(cè)定
260nm處讀值為I表示40ng RNA/μΙ。樣品RNA濃度計(jì)算公式為:A260 X 40ng/^l。具體計(jì)算如下:RNA溶于20μ1 DEPC水中，取?μ?用于測(cè)定，測(cè)得Α260=65.003，RNA濃度=65.003X40ngM = 2600.12ngM ;取?μ?用來測(cè)量以后，剩余樣品RNA為19μ1，剩余RNA總量為:19μ1Χ2600.12ng/^l =49.4μδο
[0032]②純度檢測(cè)
RNA溶液的Α260/Α280的比值是一種RNA純度檢測(cè)方法，比值范圍1.8到2.1。
[0033]2、變性瓊脂糖凝膠電泳 (I)制膠按照下表配制10 XMOPS電泳緩沖液:
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)人心臟微血管損傷標(biāo)志物miRNA21的引物，其特征在于，所述的引物的序列為:
引物 1:5’ GCGGTAGCTTATCAGACTG3’ ；
引物 I1:5’ CAGTGCGTGTCGTGGAGT3’。
2.權(quán)利要求1所述的引物在制備檢測(cè)或診斷人心臟微血管損傷藥物中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的人心臟微血管損傷是柯薩奇B3病毒感染所致的人心臟微血管損傷。
4.一種診斷人心臟微血管損傷的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包括權(quán)利要求1所述的引物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還包括以下引物:
引物 II1:5’ GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT3’ ；
引物 IV:5’ CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT3’。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒,其特征在于,所述的試劑盒還包括dNTPs、TaqDNA聚合酶和PCR反應(yīng)液。
7.權(quán)利要求4-6任一所述的試劑盒在制備檢測(cè)或診斷人心臟微血管損傷藥物中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的人心臟微血管損傷是柯薩奇B3病毒感染所致的人心臟微血管損 傷。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103757118SQ201410027943
【公開日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2014年1月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月22日
【發(fā)明者】陳瑞珍, 虞勇 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院