基于自聚集短肽誘導(dǎo)的固定化腈水解酶及制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于自聚集短肽誘導(dǎo)的固定化腈水解酶及制備方法和應(yīng)用，制備方法如下：（1）將連接肽與自聚集短肽拼接，構(gòu)建得到表達載體；（2）將腈水解酶基因與上述表達載體連接，轉(zhuǎn)化入受體菌，獲得工程菌；（3）上述工程菌誘導(dǎo)表達后，對細胞進行破壁處理，離心和/或過濾獲得沉淀，即腈水解酶體內(nèi)酶聚集體；（4）將得到的腈水解酶體內(nèi)酶聚集體在海藻酸鹽中固定化，得到固定化腈水解酶。本發(fā)明固定化所得腈水解酶聚集體，固定化酶顆粒直徑約1mm。該固定化該顆?？梢詢龈杀４?，在37℃情況下保存20天，酶活保留90%，而且固定化的腈水解酶酶活性高，操作流程簡單。
【專利說明】基于自聚集短肽誘導(dǎo)的固定化腈水解酶及制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程、生物催化領(lǐng)域。本發(fā)明涉及一種基于自聚集短肽誘導(dǎo)的腈水解酶聚集表達，再固定化的方法。更具體的，本發(fā)明構(gòu)建了一種以體內(nèi)酶聚集體形式表達的腈水解酶基因工程菌，將該具有腈水解酶活性的聚集體在海藻酸鈉溶液中固定，在水溶液中催化外消旋腈類化合物轉(zhuǎn)化為對應(yīng)的羧酸。
【背景技術(shù)】
[0002]腈水解酶(Nitrilase)在水溶液中可通過一步催化反應(yīng)，將腈轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的羧酸和氨。近年來，許多專家學(xué)者利用腈水解酶催化脂肪腈、芳腈和脂環(huán)腈等生成相應(yīng)有機羧酸生物轉(zhuǎn)化過程，而且已有在工業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用非常成功的例子。
[0003]近些年來生物催化的快速發(fā)展已成為化學(xué)品合成的重要途徑之一。腈水解酶因其具有廣泛的底物適應(yīng)性，反應(yīng)產(chǎn)物羧酸是有機合成中的重要中間體，使得腈水解酶在有機合成中表現(xiàn)出巨大的潛力。但腈水解酶的穩(wěn)定性差是限制其進一步推廣應(yīng)用的瓶頸(Enzymes in Organic Chemistry.Wiley-VCH-Verlag, 2005)。Bernner 研究小組推測，臆水解酶催化活性部分含有Glu-Lys-Cys殘基，而其中的Cys殘基對氧化劑敏感，易發(fā)生自氧化，從而降低腈水解酶的穩(wěn)定性(Curr.0pin.Struct.Biol.，2002，12:775-782)。因此工業(yè)應(yīng)用中多采用固定化方法以提高腈水解酶的穩(wěn)定性。
[0004]歐洲專利(EP2338987)利用將腈水解酶表達于膜上的全細胞催化方法催化產(chǎn)R-扁桃酸，但該專利沒有討論其酶活保留率，而且底物耐受性也較差。陳敬華等人(CN102120994)用海藻酸鹽/PEG400固定化表達腈水解酶的E.coli，該方法也未提及固定化后腈水解酶的酶活保留率及穩(wěn)定性?？傮w來講，全細胞固定化腈水解酶方法，一方面由于存在底物跨膜運輸屏障，導(dǎo)致酶催化效率降低；此外，由于受細胞內(nèi)腈水解酶表達量限制，導(dǎo)致固定化酶的負載量不高；而且由于細胞內(nèi)其他酶的存在，也可能產(chǎn)生底物競爭抑制，產(chǎn)物成分復(fù)雜 化，限制了其在藥品及食品行業(yè)的應(yīng)用。
[0005]鑒于此，有研究者近年開發(fā)出新的酶固定化方法，通過在E.coli胞內(nèi)可溶表達腈水解酶，純化后用沉淀劑處理，再用戊二醛、聚乙烯亞胺等交聯(lián)劑對沉淀的酶進行交聯(lián)形成交聯(lián)聚集體(Cross-Linked Enzyme Aggregations, CLEAs),實現(xiàn)對腈水解酶的固定化(Biotechnol.Bioeng.2004, 86, 273-276)。Mateo 等人使用交聯(lián)劑聚醒葡聚糖(dextranpolyaldehyde,DPA)對腈水解酶進行固定化,優(yōu)化后酶活保留率為50~60% (Biotechnol.Bioeng.2004,86:273_276)。采用聚乙烯亞胺(polyethyleneimine, PEI)為交聯(lián)劑，固定化的腈水解酶最大酶活保留率略有提高，達64% (J.Mol.Catal.B:Enzymatic, 2006，38:154-157)。Baner jee等人系統(tǒng)研究了來源于Pseudomonas putida MTCC5110的腈水解酶在E.coli中表達,通過CLEAs方法,通過對沉淀劑和交聯(lián)劑的優(yōu)化,腈水解酶活力保留達70%,但固定化后酶的溫度穩(wěn)定性較差(Adv.Synth.Catal.2007, 349:2167 - 2176 ；BioresourceTechnol.,2010,101:6856 - 6858)。CLEAs方法固定化腈水解酶，因需對沉淀劑和交聯(lián)劑進行摸索，且交聯(lián)過程會在一定程度上“鎖定”酶的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致交聯(lián)后酶活損失較大。并且由于CLEAs方法獲得的固定化酶顆粒較小(直徑20-60 μ m)，不利于酶的回收再利用。
[0006]如前所述，開發(fā)高負載量、高酶活保留率、重復(fù)利用次數(shù)多的腈水解酶固定化方案，將有助于推動腈水解酶在生物催化有機合成羧酸類藥物中間體的應(yīng)用開發(fā)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有腈水解酶固定化方法的缺點，提供一種基于自聚集短肽誘導(dǎo)聚集的腈水解酶固定化方法。更具體的，本發(fā)明構(gòu)建了一種以體內(nèi)酶聚集體形式表達腈水解酶的重組菌，通過細胞破碎離心獲得活性腈水解酶聚集體顆粒，進一步采用海藻酸鈉包埋獲得高酶負載量、高酶活回收率、利于多次重復(fù)利用的固定化方法。
[0008]本發(fā)明的另一個目的在于提供上述方法制得的固定化腈水解酶。
[0009]本發(fā)明的再一個目的在于利用上述固定化腈水解酶催化外消旋扁桃腈水解生成R-扁桃腈的應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn):
[0011]一種基于自聚集短肽誘導(dǎo)的固定化腈水解酶的制備方法，包括如下步驟:
[0012](I)將連接肽與自聚集短肽拼接，連接順序為連接肽-自聚集短肽，構(gòu)建得到表達載體；
[0013](2)將腈水解酶基因(Nit)與上述表達載體連接，轉(zhuǎn)化入受體菌，獲得能表達腈水解酶-短肽融合蛋白的工`程菌；
[0014](3)上述工程菌誘導(dǎo)表達后，對細胞進行破壁處理，離心和/或過濾獲得沉淀，即腈水解酶體內(nèi)酶聚集體；
[0015](4)將得到的腈水解酶體內(nèi)酶聚集體，在海藻酸鹽中固定化，得到乳白色固定化腈水解酶。
[0016]所述表達載體為可在E.coli中過量表達的誘導(dǎo)型載體，該載體特征為其含有下拉標簽。所述的載體含有下拉標簽序列不重要，只要其具有誘導(dǎo)目的蛋白在E.coli體內(nèi)自聚集為活性聚集體即可，所述自聚集短肽序列包括但不局限于口蹄疫病毒衣殼蛋白VPl(foot-and-mouth disease virus capsid protein VP1)、人 β -淀粉樣蛋白 A β 42 (F19D)(Human β -amyloid peptide Αβ42)、麥芽糖結(jié)合蛋白突變體(Maltose-bindingprotein mutant, MalE31 )、纖維素結(jié)合域(Cellulose-binding domain, CBDclos)、類彈性蛋白多肽(Elastin-like polypeptide, ELP)、ELK16、L6KD> 18A,優(yōu)選 18A,其序列為EffLKAFYEKVLEKLKELF (SEQ2)。
[0017]所述的腈水解酶基因，并不嚴格要求恰好為腈水解酶編碼基因的開放閱讀框，只要該序列插入表達載體可正常轉(zhuǎn)錄翻譯出腈水解酶編碼氨基酸序列即可。優(yōu)選腈水解酶編碼基因的開放閱讀框。所述腈水解酶基因可選自于糞產(chǎn)堿桿菌Alcaligenes faecalisJM3,敏捷食酸菌Acidovorax facilis ATCC55746,不動桿菌Acinetobacter AK226,農(nóng)桿菌Agrobacterium sp.DSM6336,產(chǎn)喊桿菌Alcaligenes sp.ECU0401,擬南芥菜Aradobidopsisthaliana,幾產(chǎn)喊菌 Alcaligenes faecalis DSM6335,突光假單胞菌 Pseudomonasfluorescens DSM7155。
[0018]步驟(2)所述的受體菌，只要步驟(1)所述的表達載體可在其體內(nèi)表達即可，包括但不局限于 E.coli DH5a ,E.coli JM109, E.coli JM110, E.coli T0P10, E.coliBL21, E.coli BL21 (DE3)，Ε.coli BL21 (DE3)/pLysS, Ε.coli BL21Rosetta, Ε.coliBL21Rosetta(DE3)，優(yōu)選 E.coli BL21 (DE3)。
[0019]步驟(2)所述的轉(zhuǎn)化方法為熱激法，CaCl2方法、電轉(zhuǎn)化方法等現(xiàn)有方法。
[0020]步驟(3)所述對細胞進行破壁處理方法，包括但不局限于超聲破碎法、溶菌酶破壁法、高壓破碎法等，及其上述方法的組合，優(yōu)選為超聲破碎法。
[0021]步驟(4)所述固定化的方法如下:將腈水解酶體內(nèi)酶聚集體與海藻酸鈉溶液按體積比1:5-5:1充分混合，海藻酸鈉溶液濃度為2-5%，采用氮氣剝離的方法，滴至濃度為
0.1-lmol/L的CaCl2溶液中固定45~180min即可。
[0022]所述腈水解酶體內(nèi)酶聚集體與海藻酸鈉溶液的體積比為1:1，海藻酸鈉溶液濃度為3% ；CaCl2的濃度為0.5mol/L,固定時間為90min。
[0023]固定化腈水解酶顆粒直徑為0.3~3mm。
[0024]所述固定化腈水解酶顆粒直徑為1mm。
[0025]以扁桃腈為底物，用固定化的腈水解酶聚集體在水相體系催化反應(yīng)制備R-扁桃酸。反應(yīng)體系如下:pH為4~10的緩沖液，初始濃度25~lOOmmol/L的扁桃腈，反應(yīng)溫度為10°C~65°C。所述反應(yīng)體系扁桃腈終濃度范圍為10~200mmol/L，優(yōu)選為100mmol/L。
[0026]所述的緩沖液不重要，只要其可以控制緩沖液pH為目標pH即可，所述的緩沖液包括但不限于磷酸鹽緩沖液、乙酸-乙酸鈉緩沖液、Tris-HCl緩沖液、甘氨酸-NaOH緩沖液。優(yōu)選Tris-HCl緩沖液。
[0027]所述的緩沖液優(yōu)選ρΗ7.5。
[0028]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果:
[0029]１)固定化操作簡單。該方法通過自聚集短肽誘導(dǎo)腈水解酶在大腸桿菌體內(nèi)聚集為活性顆粒，通過常規(guī)的細胞破碎離心即可獲得純度大于95%的活性腈水解酶。由于本發(fā)明活性聚集體具有強的機械操作穩(wěn)定性，足以承受超聲，高壓或其他強烈的物理破碎細胞過程，因此可通過簡單的細胞破碎、離心操作即可獲得純度較高的蛋白樣品，從而省去了傳統(tǒng)CLEAs酶固定化過程中需外加沉淀劑的繁瑣操作，同時避免了沉淀劑對酶催化活力的影響。
[0030]2)酶固定化顆粒的酶活保留率高，穩(wěn)定性好，便于保存，可多次重復(fù)利用，底物耐受性較好，立體選擇性好(e.e≥99.5%)。
[0031]3)本發(fā)明E.coli體內(nèi)形成的納米尺度(50_500nm)聚集體具有多孔性，有利于底物和產(chǎn)物的高效傳遞。此外，該活性聚集體的水溶性較差，有利于長期儲存；因此，該固定化方法有利于推進腈水解酶的工業(yè)應(yīng)用，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]圖1為pET-alB載體圖譜。
[0033]圖2為腈水解酶純度的SDS-PAGE檢驗。其中I為Nit-18A，即融合有18A標簽的腈水解酶，2為純化后的Nit，即通過鎳柱親和純化獲得的未融合18A標簽的腈水解酶。
[0034]圖3為腈水解酶固定化前后酶活穩(wěn)定性研究。其中Nit表示普通重組表達的腈水解酶，即通過鎳柱親和純化獲得的未融合18A標簽的腈水解酶，Nit-1SA表示融合有18A標簽的腈水解酶；Nit-1SEA表示Nit-1SA經(jīng)海藻酸鈣法固定化的樣品。普通表達的腈水解酶(Nit)在時間點為O時的酶活定義為100%。[0035]圖4Nit_iSEA重復(fù)利用酶活保留情況。第一次反應(yīng)酶活定義為100%。
[0036]圖5不同扁桃腈濃度條件下Nit-1SEA的催化情況。
【具體實施方式】
[0037]下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0038]所采用的腈水解酶基因來源于糞產(chǎn)堿桿菌Alcaligenes faecalis JM3,其基因在NCBI數(shù)據(jù)庫ID為D13419.1(見SEQ1)。下述實施例中有未注明具體條件的實驗方法，則是按照常規(guī)的分子克隆手冊所述的條件進行操作。
[0039]實施例1
[0040]1、含有編碼短肽的表達載體的構(gòu)建
[0041]根據(jù)PT-1inker及18A的氨基酸序列，在基因合成公司合成相應(yīng)的DNA序列PT-linker+18A，在PT-linker+18A DNA序列的上游引入Hind III酶切位點，下游引入XhoI酶位點。以質(zhì)粒pET-30a(+)為基本質(zhì)粒，用Hind II1、XhoI雙酶切，連接入相應(yīng)酶切的PT-1inker+18A序列，轉(zhuǎn)化至E.coli DH5 α感受態(tài)細胞，通過菌落PCR、酶切及測序分析鑒定陽性轉(zhuǎn)化子，得到質(zhì)粒pET-alB，如圖1所示。
[0042]2、大腸桿菌胞內(nèi)表達腈水解酶活性聚集體工程菌的構(gòu)建
[0043]以糞產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes faecalis JM3)的基因組為模板,在引物1、引物2的作用下PCR擴增長約Ikb的腈水解酶基因片段。
[0044]引物1:5' ~TTAGCCCCATATGCAGACAAGAAAAATCGTCCG~3/。下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶Nde I識別位點。
[0045]引物2:5' ~TCTGTAAGCTTGGACGGTTCTTGCACCAGTAG~3/ 下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶Hind III識別位點。
[0046]純化的PCR產(chǎn)物、pET-30a和pET-alB載體分別用Nde I和Hind III雙酶切，純化后連接轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細胞，通過菌落PCR、酶切及測序分析鑒定陽性轉(zhuǎn)化子 E.coli BL21(DE3)/pET-Nit 和 E.coli BL21 (DE3)/pET_Nit_18A。
[0047]3、腈水解酶聚集體的獲得
[0048]步驟2 所得的工程菌 E.coli BL21(DE3)/pET-Nit 和 E.coliBL21 (DE3) /pET-Nit-18A分別接種在含有50 μ g/mL卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD6tltl達到0.4-0.6，加入終濃度為0.lmmol/L IPTG，在22°C、180rpm條件下誘導(dǎo)22小時。離心收獲菌體，采用溶菌酶和/或超聲波破碎，高速離心。對E.coli BL21(DE3)/pET-Nit保留上清，采用鎳柱親和層析純化常規(guī)可溶表達的腈水解酶(標記為Nit)。對E.coli BL21(DE3)/pET-Nit-18A 去除上清，沉淀用用含有 0.8%(v/v) Triton X-1OO 的 Tris-HCl (ρΗ7.5)緩沖液洗滌I次，再用ΡΗ7.5的Tris-HCl緩沖液洗滌兩次，所得樣品即為純度大于95%的腈水解酶聚集體NU-18A。見圖2。
[0049]4、 腈水解酶聚集體的固定化
[0050]將獲得的NU-18A與3%(ν/ν)海藻酸鈉溶液，按體積比1:1充分混合，采用氮氣剝離方法，滴至2mol/L CaCl2溶液中固定。在固定90min后，去除CaCl2溶液，換成Tris-HCl(pH7.5)緩沖液洗滌兩次，制備獲得固定化的Nit-1SEA。操作過程中，控制Nit-1SEA顆粒直徑約為1mm。將Nit-1SEA于10% (v/v)蔗糖中冷凍干燥，保存于-80°C備用。使用時取適量在pH7.5的Tris-HCl中浸泡至顆粒溶脹，再用pH7.5的Tris-HCl緩沖液洗滌I次進行后續(xù)反應(yīng)。
[0051]研究表明，腈水解酶聚集體經(jīng)海藻酸鈣包埋固定化后，酶活保留率為85-90%。
[0052]5、腈水解酶酶活的測定
[0053]以扁桃腈為底物，用游離的腈水解酶(Nit)和固定化的腈水解酶聚集體(Nit-1SEA)在水相體系催化反應(yīng)制備R-扁桃酸。 [0054]反應(yīng)體系如下(ImL):50mmol/L磷酸緩沖液(pH7.5), 30mmol/L扁桃腈，2(^8酶，37 1:、200卬111條件下反應(yīng)201^11，加入10(^1^111101/1 HCl 終止反應(yīng)。15000g離心2min，取上清檢測底物轉(zhuǎn)化率。R-扁桃酸含量測定采用HPLC法及外標定量法(J.Biotechnol.,2011, 152:24-29)。酶活單位(U)定義為:在 37°C ρΗ7.5 條件下，Imin 內(nèi)催化扁桃腈生成I μ mol扁桃酸所需要的酶量。扁桃酸的手性純度測定采用HPLC法(Appl.Microbiol.Biot., 2012, 95:91-99)。
[0055]研究表明，本發(fā)明構(gòu)建獲得的可溶表達腈水解酶(Nit)比酶活為19.8U/mg，ee≥99.5% ;游離的腈水解酶聚集體(Nit_18A)比酶活為15.4U/mg, ee≥99.5%。
[0056]6、腈水解酶聚集體固定化前后溫度穩(wěn)定性研究
[0057]Nit-18A，Nit-1SEA, Nit 分別于 4°C、37°C條件下放置 1、2、3、5、8、10、15、20 天后，
測定酶活保留率。結(jié)果如圖3所示，可溶表達的腈水解酶(Nit)在4°C條件下保存5天，酶活損失接近50%。游離的腈水解酶聚集體(Nit-1SA)在37°C條件下保存20天，酶活保留達85%。而海藻酸鈣固定化的腈水解酶聚集體(Nit-1SEA)在37°C條件下保存20天，酶活保留率接近95%。由此可見，在腈水解酶(Nit) C端添加18A短肽(NU-18A)以及Nit_18A經(jīng)海藻酸鈣固定化，有助于提高腈水解酶的溫度穩(wěn)定性。
[0058]7、Nit-1SEA重復(fù)利用效果評估
[0059]取適量固定化的腈水解酶聚集體Nit-1SEA，依照步驟5進行多次扁桃腈水解生成R-扁桃酸的催化反應(yīng)，評估其重復(fù)利用酶活保留率。結(jié)果表明，海藻酸鈣包埋固定化的腈水解酶聚集體，重復(fù)利用20次沒有明顯酶活損失，酶活保留率超過90%。如圖4所示。
[0060]8、Nit-1SEA底物濃度耐受能力評估
[0061]在IOml體系中，取20mg步驟4所制得的Nit-1SEA分別于含有25mmol/L、50mmol/L、75mmol/L、lOOmmol/L 扁桃腈的 50mmol/L 磷酸緩沖液(pH7.5)中，于 40°C、200rpm 的條件反應(yīng) 20min、40min、60min、90min、120min> 150min> 180min>240min,分別取樣進行檢測，酶活測定如步驟5中所述，見圖5。在lOOmmol/L的高濃度扁桃腈底物情況下，催化水解4h，轉(zhuǎn)化率>75%。表明Nit-1SEA短肽誘導(dǎo)及包埋固定化后，底物耐受性明顯提高，而且在高濃度的底物下依然保持很好的底物轉(zhuǎn)化率。
【權(quán)利要求】
1.一種基于自聚集短肽誘導(dǎo)的固定化腈水解酶的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)將連接肽與自聚集短肽拼接，連接順序為連接肽-自聚集短肽，構(gòu)建得到表達載體； (2)將腈水解酶基因與上述表達載體連接，轉(zhuǎn)化入受體菌，獲得能表達腈水解酶-短肽融合蛋白的工程菌； (3)上述工程菌誘導(dǎo)表達后，對細胞進行破壁處理，離心和/或過濾獲得沉淀，即腈水解酶體內(nèi)酶聚集體； (4)將得到的腈水解酶體內(nèi)酶聚集體，在海藻酸鹽中固定化，得到乳白色固定化腈水解酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述自聚集短肽序列為口蹄疫病毒衣殼蛋白VP1、人β -淀粉樣蛋白Αβ 42(F19D)、麥芽糖結(jié)合蛋白突變體、纖維素結(jié)合域、類彈性蛋白多肽、ELK16、L6KD或18A。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述腈水解酶基因來源于糞產(chǎn)堿桿菌 Alcaligenes faecalis JM3,敏捷食酸菌 Acidovorax facilis ATCC55746,不動桿菌 Acinetobacter AK226,農(nóng)桿菌 Agrobacterium sp.DSM6336,產(chǎn)喊桿菌 Alcaligenessp.ECU0401,擬南芥菜 Aradobidopsis thaliana,幾產(chǎn)喊菌 Alcaligenes faecalisDSM6335,突光假單胞菌 Pseudomonas f luorescensDSM7155。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述受體菌包括E.coli DH5 α , Ε.coli JM109, E.coli JM110, E.coli T0P10, E.coli BL21, E.coli BL21 (DE3)，Ε.coliBL21(DE3)/pLysS, E.coli BL21Rosetta, E.coli BL21Rosetta(DE3)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述固定化的方法如下: 將腈水解酶體內(nèi)酶聚集體與海藻酸鈉溶液按體積比1:5-5:1充分混合，海藻酸鈉溶液濃度為2-5%，采用氮氣剝離的方法，滴至濃度為0.1-lmol/L的CaCl2溶液中固定45~180min 即可。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述腈水解酶體內(nèi)酶聚集體與海藻酸鈉溶液的體積比為1:1，海藻酸鈉溶液濃度為3%;CaCl2的濃度為0.5mol/L，固定時間為90mino
7.權(quán)利要求1~6任一項方法制備的固定化腈水解酶，其特征在于，固定化腈水解酶顆粒直徑為0.3~3mm。
8.權(quán)利要求7所述固定化腈水解酶，其特征在于，所述固定化腈水解酶顆粒直徑為Imnin
9.權(quán)利要求7或8所述固定化腈水解酶的應(yīng)用，其特征在于，以扁桃腈為底物，用固定化的腈水解酶聚集體在水相體系催化反應(yīng)制備R-扁桃酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，反應(yīng)體系如下:pH為4~10的緩沖液，初始濃度25~lOOmmol/L的 扁桃腈，反應(yīng)溫度為10°C~65°C。
【文檔編號】C12N11/10GK103757042SQ201410019182
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月15日
【發(fā)明者】李爽, 楊曉鋒, 林章凜, 王菊芳, 王小寧 申請人:華南理工大學(xué), 清華大學(xué)