一種以柔嫩艾美爾球蟲病毒rna為載體的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種以柔嫩艾美爾球蟲病毒RNA為載體的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)。該轉(zhuǎn)染系統(tǒng)含有多克隆酶切位點,使用方便,可將多種外源基因轉(zhuǎn)入柔嫩艾美爾球蟲體內(nèi),進行柔嫩艾美爾球蟲的基因表達調(diào)控、生化代謝以及蟲苗研制等研究。
【專利說明】—種以柔嫩艾美爾球蟲病毒RNA為載體的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)
[0001]【技術(shù)領(lǐng)域】:
本發(fā)明提供了一種以柔嫩艾美爾球蟲病毒RNA為載體的轉(zhuǎn)染系統(tǒng),同時還公開柔嫩艾美爾球蟲病毒的核酸序列,屬于基因工程領(lǐng)域。
[0002]【背景技術(shù)】:
球蟲病(Coccidiosis)是由艾美爾屬球蟲引起,且危害十分嚴重的寄生蟲病。作為一種細胞內(nèi)寄生的真核生物,艾美爾球蟲導(dǎo)致全球養(yǎng)禽業(yè)的巨大損失,雖經(jīng)多年研究,但迄今尚無理想的防治辦法,究其原因就是對球蟲細胞和分子生物學(xué)缺乏詳盡的了解。雙鏈RNA(dsRNA)病毒首先在真菌中于1948年發(fā)現(xiàn),此后又在許多原蟲中發(fā)現(xiàn)了 dsRNA病毒。已報道在柔嫩艾美爾球蟲、斯氏艾美爾球蟲、尼氏艾美爾球蟲、布氏艾美爾球蟲、巨型艾美爾球蟲、毒害艾美爾球蟲以及堆型艾美爾球蟲等體內(nèi)電鏡觀察到病毒樣粒子,但目前關(guān)于柔嫩艾美爾球蟲病毒的核酸序列以及基于病毒的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)尚未見報導(dǎo)。
[0003]
【發(fā)明內(nèi)容】
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本發(fā)明提供了一種以柔嫩艾美爾球蟲病毒RNA為載體的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)。該轉(zhuǎn)染系統(tǒng)含有多克隆酶切位點,使用方便,可將多種外源基因轉(zhuǎn)入柔嫩艾美爾球蟲體內(nèi),進行柔嫩艾美爾球蟲的基因表達調(diào)控、生化代謝以及蟲苗研制等研究。
[0004]本發(fā)明提供的柔嫩艾美爾球蟲病毒的核酸序列,如SEQ ID:1所示。
[0005]本發(fā)明公開的利用柔嫩艾美爾球蟲病毒RNA作轉(zhuǎn)染載體,在柔嫩艾美爾球蟲體內(nèi)進行外源基因的表達,其特 征在于:
將含外源基因和多克隆酶切位點的基因替換柔嫩艾美爾球蟲病毒dsRNA的部分編碼區(qū),并在5’外編碼區(qū)前端加入17啟動子,后用RNA聚合酶進行體外轉(zhuǎn)錄,后將其轉(zhuǎn)錄體電穿孔至球蟲卵囊體內(nèi)進行外源基因的表達。
[0006]本發(fā)明的積極效果在于:
提供了柔嫩艾美爾球蟲病毒基因組dsRNA全長cDNA序列6006bp。利用柔嫩艾美爾球蟲為真核生物,外源基因在柔嫩艾美爾球蟲體內(nèi)表達出的蛋白具有活性,所以該轉(zhuǎn)染系統(tǒng)含有多克隆位點,為通用型轉(zhuǎn)染載體,多種外源基因可在柔嫩艾美爾球蟲體內(nèi)表達,為研究球蟲類原蟲的分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)以及蟲苗研制等提供了轉(zhuǎn)染系統(tǒng)。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0007]附圖1為以柔嫩艾美爾球蟲病毒RNA為載體的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)示意圖;
附圖2為基于病毒的綠色熒光蛋白在球蟲體內(nèi)表達效果。
[0008]具體實施方法:
實施例1
以柔嫩艾美爾球蟲病毒RNA為載體的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)
如附圖1所示,根據(jù)柔嫩艾美爾球蟲病毒(EtRVl)基因組dsRNA的序列特征,將綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)基因替換 dsRNA 部分編碼區(qū),構(gòu)建EtRVl與GFP的嵌合體。柔嫩艾美爾球蟲病毒的核酸序列,如SEQ ID NO:1所示。對EtRVldsRNA運用PCR反應(yīng)將17啟動子引入到dsRNA cDNA的5'端前,運用PCR方法擴增出EtRVl的Y端377bp (包括Y端UTRs)、3,端141bp,EGFP編碼區(qū)717bp三個片段,構(gòu)建EtRVl與EGFP的嵌合體,并分別克隆入載體PMD-18T,得重組質(zhì)粒pMD-18T_5’ UTR-EGFP-3’ UTR,經(jīng)EcoRI與HindII I酶切線性化后,用凝膠回收試劑盒回收、定量。取約2iig線性化質(zhì)粒作為模板,應(yīng)用 T7 RiboMAXTM Express Large Scale RNA Production System 進行體外轉(zhuǎn)錄。將線性化質(zhì)粒pMD-18T-5’ UTR-EGFP-3’ UTR體外轉(zhuǎn)錄體RNA (200 u g)加入柔嫩艾美爾球蟲未孢子化卵囊Cytomix溶液中,溶液終體積為IOOii I,使用Bio-Rad Imm電轉(zhuǎn)杯,以電壓500V、脈沖時間0.3ms間隔IOOms連續(xù)進行三次電擊反應(yīng)。之后冰浴20min,離心沉淀后,加500ul滅菌水,轉(zhuǎn)移至24孔細胞培養(yǎng)板中,于28.5°C溫箱中作用12h。在藍熒光激發(fā)條件下,球蟲卵囊發(fā)出綠色熒光(見附圖2 ;A、紫外光可見光下觀察。B、可見光下觀察)。說明可以利用柔嫩艾美爾 球蟲病毒作為一種轉(zhuǎn)染載體,攜帶外源基因在其體內(nèi)表達。
【權(quán)利要求】
1.一種柔嫩艾美爾球蟲病毒的核酸序列,如SEQ ID NO:1所示。
2.以柔嫩艾美爾球蟲病毒RNA為載體的轉(zhuǎn)染系統(tǒng),其特征在于:將含外源基因和多克隆酶切位點的基因替換柔嫩艾美爾球蟲病毒dsRNA的部分編碼區(qū),并在5’外編碼區(qū)前端加入17啟動子,后用RNA聚合酶進行體外轉(zhuǎn)錄,后將其轉(zhuǎn)錄體電穿孔至球蟲卵囊體內(nèi)進行外源基因的表達 。
【文檔編號】C12N15/40GK103773781SQ201410012489
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年1月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月13日
【發(fā)明者】李建華, 張西臣, 武斌, 宮鵬濤, 信彩巖, 張國才, 張楠, 楊舉, 李 赫, 楊正濤 申請人:吉林大學(xué)