D-乳酸的生產(chǎn)方法、聚合物的生產(chǎn)方法和聚合物的制作方法
【專利摘要】通過在含有無機電解質(zhì)和碳源、并且至少滿足選自下述(a)、(b)、(c)和(d)中至少一個條件的無機鹽培養(yǎng)基中對生產(chǎn)D－乳酸的大腸桿菌進行培養(yǎng)，從而生產(chǎn)D－乳酸，所述(a)、(b)、(c)和(d)為：(a)所述無機鹽培養(yǎng)基中除所述碳源以外的有機物的含量在培養(yǎng)開始時為10g/L以下，(b)所述無機鹽培養(yǎng)基中所述無機電解質(zhì)的含量在培養(yǎng)開始時為11g/L以下，(c)所述無機鹽培養(yǎng)基中硫胺素的含量為0.1mg/L以下，(d)所述無機鹽培養(yǎng)基中過渡金屬離子的含量為10mg/L以下。
【專利說明】D -乳酸的生產(chǎn)方法、聚合物的生產(chǎn)方法和聚合物

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及D -乳酸的生產(chǎn)方法、聚合物的生產(chǎn)方法和聚合物。

【背景技術(shù)】
[0002] 乳酸是近年來作為聚合物原料及農(nóng)藥、醫(yī)藥的中間體而受到關(guān)注的有用物質(zhì)。自 然界中存在有乳酸菌、絲狀菌等高效生產(chǎn)乳酸的微生物，在使用這些微生物的乳酸制造方 法中，已知使用德氏乳桿菌（Lactbacillus delbrueckii)等作為高效生產(chǎn)L 一乳酸的微生 物的方法，以及使用芽孢乳桿菌（Sporolactobacillus)屬微生物等作為高效生產(chǎn)D-乳酸 的微生物的方法。
[0003] D -乳酸作為與L 一乳酸形成的立構(gòu)復(fù)合型聚乳酸的原料、醫(yī)藥中間體，在近年來 受到關(guān)注。在上述任一種用途中，對于作為原料的D -乳酸，都要求高的光學(xué)純度。
[0004] D -乳酸在工業(yè)上一般通過利用以大腸桿菌為代表的微生物的發(fā)酵法制造。由于 發(fā)酵工序是進行微生物的培養(yǎng)和以增殖的微生物作為催化劑的物質(zhì)生產(chǎn)的步驟，因此對微 生物的增殖而言，營養(yǎng)源是必需的。作為其營養(yǎng)源，在玉米加工過程中得到的玉米漿（corn steep liquor)含有較多的氨基酸等，營養(yǎng)價值高，并且便宜，因此被用于D-乳酸的發(fā)酵 原料。
[0005] 由于該玉米漿含有L 一乳酸，因此成為導(dǎo)致所得的D -乳酸的光學(xué)純度下降的原 因之一。從該觀點考慮，例如在專利文獻1中，以在有效地制造乳酸的同時還提高產(chǎn)品的光 學(xué)純度為目的，對快速分解原料中含有的L 一乳酸進行了研究。
[0006] 在這樣的組合之外，正在進行在不使用玉米漿這種含有L 一乳酸的原料的情況下 有效地制造 D -乳酸的情況。特別是對使用大腸桿菌的D -乳酸制造方法而言，在專利文 獻2中公開了在以下述的無機鹽作為主成分的培養(yǎng)基中加入糖，并使用該培養(yǎng)基的D -乳 酸的發(fā)酵生產(chǎn)方法。
[0007] 磷酸二氫鉀 3.5g/L 磷酸氫二鉀 5.0g/L 硫酸銨 3.5g/L 硫酸鎂· 7水合物 0.25g/L 氯化鈣· 2水合物 15mg/L 硫胺素 0.5mg/L 氯化鐵（III) 1.6mg/L 氯化鈷（II) . 6水合物 0.2mg/L 氯化銅（II) 0. lmg/L 氯化鋅（II) . 4水合物 0.2mg/L 鉬酸納 0.2mg/L 硼酸 0.05mg,/L
[0008] 另外，用于培養(yǎng)大腸桿菌的以無機鹽為主成分的培養(yǎng)基，還記載于例如專利文獻3 和非專利文獻1中。專利文獻2、3和非專利文獻1記載的培養(yǎng)基除了多種無機鹽以外還含 有硫胺素、以及鈷、鋅、銅等過渡金屬等。由于這些硫胺素、過渡金屬離子作為微生物細胞內(nèi) 酶所產(chǎn)生的生物化學(xué)反應(yīng)的輔助因子而起到了重要的作用，因此可以認(rèn)為是非常重要的成 分。需要說明的是，在專利文獻2、3中還記載了向以無機鹽作為主成分的培養(yǎng)基中適當(dāng)添 加甜菜堿的內(nèi)容。
[0009] 現(xiàn)有技術(shù)文獻
[0010] 專利文獻
[0011] 專利文獻1 :國際公開第2010/032697號小冊子
[0012] 專利文獻2 :日本特開2012 - 10715號公報
[0013] 專利文獻3 :日本特開2009 - 261360號公報
[0014] 非專利文獻
[0015] 非專利文獻 I :BMC Microbiology，Vol. 11，Art. No. 70(2011)


【發(fā)明內(nèi)容】

[0016] 然而，上述文獻中沒有記載關(guān)于由得到的D -乳酸能夠獲得何種D -乳酸聚合物 的見解。
[0017] 另外，由于專利文獻2、3記載的培養(yǎng)基中多種成分是必需的，因此不僅在培養(yǎng)基 的制備方面需要費工夫，而且由于還以某種規(guī)定的量使用多種成分，結(jié)果導(dǎo)致培養(yǎng)基成本 的上升。
[0018] 本發(fā)明在于提供一種更廉價并且高效地生產(chǎn)D -乳酸的方法。
[0019] 本發(fā)明人為了解決上述問題而反復(fù)地進行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過用無機鹽培 養(yǎng)基對生產(chǎn)D -乳酸的大腸桿菌進行培養(yǎng)，聚合后可得到高品質(zhì)的聚合物。另外還發(fā)現(xiàn)，通 過使無機鹽培養(yǎng)基中的成分為最小限度，可以更廉價并且高效地生產(chǎn)D -乳酸。
[0020] BP，本發(fā)明如以下[1]?[17]所述。
[0021] [1] 一種D -乳酸的生產(chǎn)方法，通過在含有無機電解質(zhì)和碳源、并且滿足選自下述 (a)、(b)、（c)和（d)中的至少一個條件的無機鹽培養(yǎng)基中對生產(chǎn)D -乳酸的大腸桿菌進行 培養(yǎng)，從而生產(chǎn)D -乳酸，
[0022] (a)所述無機鹽培養(yǎng)基中，除所述碳源以外的有機物的含量在培養(yǎng)開始時為IOg/ L以下，
[0023] (b)所述無機鹽培養(yǎng)基中所述無機電解質(zhì)的含量在培養(yǎng)開始時為llg/L以下，
[0024] (c)所述無機鹽培養(yǎng)基中硫胺素的含量為0. lmg/L以下，
[0025] (d)所述無機鹽培養(yǎng)基中過渡金屬離子的含量為10mg/L以下。
[0026] [2]如[1]所述的D -乳酸的生產(chǎn)方法，其中，所述無機鹽培養(yǎng)基至少滿足所述 (c)或所述（d)中的任一個條件。
[0027] [3]如[1]或[2]所述的D-乳酸的生產(chǎn)方法，其用于生產(chǎn)作為聚合物原料的D - 乳酸。
[0028] [4]如[1]?[3]中任一項所述的D -乳酸的生產(chǎn)方法，其中，培養(yǎng)開始時的所述 無機鹽培養(yǎng)基進一步滿足下述（e)，
[0029] (e)所述無機鹽培養(yǎng)基中所述過渡金屬離子的含量為0· 85mg/L以下。
[0030] [5]如[1]?[4]中任一項所述的D -乳酸的生產(chǎn)方法，其中，所述碳源為糖。
[0031] [6]如[5]所述的D-乳酸的生產(chǎn)方法，其中，所述糖包含選自葡萄糖、果糖、木糖、 蔗糖、甘油、阿拉伯糖、蜜二糖、海藻糖、麥芽糖、蜜二糖酸（melibionic acid)、乳糖、麥芽三 糖、核糖、半乳糖、半乳糖醛酸、葡糖酸、葡糖胺、葡糖醛酸、甘露醇、甘露糖、糖精酸、山梨糖 醇、巖藻糖、鼠李糖、阿洛糖和N -乙酰葡糖胺中的一種以上化合物。
[0032] [7]如[1]?[6]中任一項所述的D -乳酸的生產(chǎn)方法，其中，所述無機電解質(zhì) 包含選自鉀離子、磷酸根離子、銨離子、硫酸根離子和鎂離子中的一種以上離子作為構(gòu)成成 分。
[0033] [8]如[1]?[7]中任一項所述的D -乳酸的生產(chǎn)方法，其中，所述無機電解質(zhì)包 含鉀離子，
[0034] 在培養(yǎng)開始時的所述無機鹽培養(yǎng)基中，所述鉀離子的濃度為5. 8mmol/L以上且 73mmol/L 以下。
[0035] [9]如[1]?[8]中任一項所述的D -乳酸的生產(chǎn)方法，其中，所述無機鹽培養(yǎng)基 是將所述無機電解質(zhì)溶解或混懸于水中而制備的液體。
[0036] [10]如[1]?[9]中任一項所述的D -乳酸的生產(chǎn)方法，其中，所述無機鹽培養(yǎng)基 進一步包含甜菜堿。
[0037] [11]如[1]?[10]中任一項所述的D -乳酸的生產(chǎn)方法，其中，所述生產(chǎn)D -乳 酸的大腸桿菌為重組大腸桿菌。
[0038] [12]如[1]?[10]中任一項所述的D -乳酸的生產(chǎn)方法，其包括以下工序：在所 述無機鹽培養(yǎng)基中使所述生產(chǎn)D -乳酸的大腸桿菌與所述碳源接觸，得到D -乳酸鹽的工 序；和
[0039] 從含有所述D -乳酸鹽的所述無機鹽培養(yǎng)基中除去所述生產(chǎn)D -乳酸的大腸桿菌 后，將所述D -乳酸鹽脫鹽，得到D -乳酸的工序。
[0040] [13]如[12]所述的D -乳酸的生產(chǎn)方法，其中，在得到所述D -乳酸鹽的所述工 序中，得到D -乳酸的堿土金屬鹽，
[0041] 在得到所述D-乳酸的所述工序中，通過將D-乳酸的堿土金屬鹽脫鹽，使含有堿 土金屬的無機鹽析出。
[0042] [14]如[12]所述的D -乳酸的生產(chǎn)方法，其中，在得到所述D -乳酸鹽的所述工 序中，得到所述D -乳酸的堿金屬鹽，
[0043] 在得到所述D -乳酸的所述工序中，通過電解透析處理將D -乳酸的堿金屬鹽脫 鹽。
[0044] [15]如[12]?[14]中任一項所述的D -乳酸的生產(chǎn)方法，其進一步包括在將所 述D -乳酸鹽脫鹽得到D -乳酸的所述工序后，進行D -乳酸純化的純化工序，
[0045] 在所述純化工序中，一邊水解一邊進行蒸餾。
[0046] [16] -種聚合物的生產(chǎn)方法，使用通過[1]?[15]中任一項所述的D -乳酸的生 產(chǎn)方法得到的D -乳酸進行聚合反應(yīng)。
[0047] [17] -種聚合物，是通過[16]所述的聚合物的生產(chǎn)方法得到的。
[0048] 根據(jù)本發(fā)明，提供一種更廉價并且高效地生產(chǎn)D -乳酸的方法。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0049] 上述目的及其他目的、特征和優(yōu)點通過以下所述的優(yōu)選實施方式以及附帶的以下 附圖而進一步明確。
[0050] [圖1]是表示用于本實施方式的D -乳酸的生產(chǎn)方法的發(fā)酵裝置的一個例子的 圖。
[0051] [圖2]是表示用于本實施方式的D-乳酸的生產(chǎn)方法的電滲析裝置的一個例子的 圖。

【具體實施方式】
[0052] 本實施方式的D-乳酸的生產(chǎn)方法中，通過在含有無機電解質(zhì)和碳源、并且滿足 選自下述（a)、(b)、（c)和（d)中的至少一個條件的無機鹽培養(yǎng)基中對生產(chǎn)D -乳酸的大腸 桿菌進行培養(yǎng)，從而生產(chǎn)D -乳酸。由此，可以更廉價并且高效地生產(chǎn)D -乳酸。
[0053] (a)無機鹽培養(yǎng)基中，除碳源以外的有機物的含量在培養(yǎng)開始時為10g/L以下。
[0054] (b)無機鹽培養(yǎng)基中無機電解質(zhì)的含量在培養(yǎng)開始時為llg/L以下。
[0055] (c)無機鹽培養(yǎng)基中硫胺素的含量為0. lmg/L以下。
[0056] (d)無機鹽培養(yǎng)基中過渡金屬離子的含量為10mg/L以下。
[0057] 在本實施方式的D-乳酸的生產(chǎn)方法中，無機鹽培養(yǎng)基滿足選自上述（a)、（b)、 (c)和（d)中的1個以上的條件，優(yōu)選滿足選自上述（a)、（b)、（c)和（d)中的2個以上的 條件，更優(yōu)選滿足選自上述（a)、（b)、（c)和（d)中的3個以上的條件，進一步優(yōu)選滿足上述 (a)、(b)、（c)和⑷中的全部條件。由此，可以生產(chǎn)作為聚合物原料的D-乳酸。另外，根 據(jù)本實施方式的D -乳酸的生產(chǎn)方法，可以得到適合于聚合物原料用途的D -乳酸。
[0058] 以下，對本實施方式的D -乳酸的生產(chǎn)方法進行詳細說明。
[0059] 在本實施方式中，所謂碳源是生產(chǎn)D -乳酸的大腸桿菌在生產(chǎn)D -乳酸方面能夠 利用的發(fā)酵性的糖，更具體而言，優(yōu)選包含選自葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、甘油、阿拉伯糖、 蜜二糖、海藻糖、麥芽糖、蜜二糖酸、乳糖、麥芽三糖、核糖、半乳糖、半乳糖醛酸、葡糖酸、葡 糖胺、葡糖醛酸、甘露醇、甘露糖、糖精酸、山梨糖醇、巖藻糖、鼠李糖、阿洛糖和N -乙酰葡 糖胺中的一種以上化合物。另外，還可以使用淀粉水解物、草木質(zhì)分解產(chǎn)物、纖維素水解物 等作為碳源。
[0060] 需要說明的是，為了在進行D-乳酸生產(chǎn)時利用上述糖，還可以向大腸桿菌中導(dǎo) 入需要的酶基因或提高利用效率的基因。作為具體的例子，可以舉出如本申請實施例所記 載的那樣，利用導(dǎo)入了蔗糖酶的大腸桿菌從蔗糖進行的D -乳酸生產(chǎn)。
[0061] 在本實施方式的無機鹽培養(yǎng)基中，還包含除碳源以外的有機物。此處，除碳源以 外的有機物是上述發(fā)酵性糖以外的有機物，例如，可以列舉有機氮源。作為關(guān)于除碳源以 夕卜的有機物的更具體的例子，可以列舉油渣類、大豆水解物、酪蛋白分解物、氨基酸類、玉米 漿、酵母及酵母提取物、肉提取物、蛋白胨等肽類、麥芽提取物、乳清、各種發(fā)酵菌體及其水 解物、或它們所含的有機物成分等。另外，維生素類也是除碳源以外的有機物的一個例子。 進而，為了提高無機鹽培養(yǎng)基的PH緩沖作用而添加的作為緩沖劑的有機物，可以列舉作為 碳源以外的有機物的例子，例如，可以列舉M0PS(3 -（N-嗎啉基）丙磺酸）、Tris(三（羥 基甲基）氨基甲烷）、EDTA(乙二胺四乙酸）等。
[0062] 當(dāng)本實施方式中含有無機電解質(zhì)和碳源的無機鹽培養(yǎng)基中含有大量上述除碳源 以外的有機物時，由于可能會產(chǎn)生以下不良情況：用于獲得D -乳酸的純化工序變得復(fù)雜、 對聚合物的色調(diào)產(chǎn)生不良影響等，因此優(yōu)選對無機鹽培養(yǎng)基中含有的除碳源以外的有機物 量進行限制。
[0063] 在本實施方式中，無機鹽培養(yǎng)基中除碳源以外的有機物含量，在培養(yǎng)開始時優(yōu)選 為10g/L以下，從聚合物色調(diào)的觀點考慮，更優(yōu)選為2g/L以下，進一步優(yōu)選為0. 6g/L以下。 例如，在培養(yǎng)開始時的無機鹽培養(yǎng)基中，除碳源以外的有機物的含量優(yōu)選為0?l〇g/L的范 圍，更優(yōu)選為〇?2g/L，進一步優(yōu)選為0?0. 6g/L。另外，對于下限值，從聚合物色調(diào)的觀 點考慮，優(yōu)選為〇g/L以上。
[0064] 需要說明的是，在本實施方式的D-乳酸的生產(chǎn)方法中，所謂"培養(yǎng)開始時"是指 即將向培養(yǎng)基中接種生產(chǎn)D -乳酸的大腸桿菌之前。
[0065] 另外，本實施方式的D-乳酸的生產(chǎn)方法中的"無機鹽培養(yǎng)基"，是在使用微生物 的乳酸發(fā)酵中，將包含微生物必需的元素中除碳源以外的元素作為構(gòu)成成分的無機電解質(zhì) 溶解或混懸于水中而制備的液體培養(yǎng)基。
[0066] 另外，在本實施方式的D -乳酸的生產(chǎn)方法中，無機電解質(zhì)優(yōu)選包含選自鉀離子 (K+)、磷酸根離子（PO/-)、銨離子（NH4+)、硫酸根離子（SO4I)和鎂離子（Mg 2+)中的一種以 上離子作為構(gòu)成成分。通過這樣，可以得到高品質(zhì)的聚合物，可以更廉價并且高效地生產(chǎn) D -乳酸。需要說明的是，在培養(yǎng)開始時的無機鹽培養(yǎng)基中，上述無機電解質(zhì)的含量優(yōu)選合 計為llg/L以下，優(yōu)選0?llg/L的范圍。另外，對于下限值，優(yōu)選為Og/L以上。
[0067] 在無機鹽培養(yǎng)基中含有K+作為構(gòu)成成分時，使用的無機電解質(zhì)沒有特別限定，例 如，可以選擇使用選自磷酸氫二鉀（K2HPO4)、磷酸二氫鉀（KH2PO 4)、氫氧化鉀（KOH)、磷酸三 鉀（K3PO4)和硫酸鉀（K2SO4)中的至少一種以上。另外，無機鹽培養(yǎng)基中的K +含量優(yōu)選為 5?50mmol/L，更優(yōu)選為15?25mmol/L。另外，從更高效地生產(chǎn)D -乳酸的觀點考慮，在培 養(yǎng)開始時的無機鹽培養(yǎng)基中，K+含量優(yōu)選為5mmol/L以上，更優(yōu)選為5. 8mmol/L以上，進一 步優(yōu)選為15mmol/L以上。另一方面，從更高效地生產(chǎn)D -乳酸的觀點考慮，在培養(yǎng)開始時 的無機鹽培養(yǎng)基中，K+含量的上限值優(yōu)選為73mmol/L以下，更優(yōu)選為50mmol/L以下，進一 步優(yōu)選為25mmol/L以下。
[0068] 在無機鹽培養(yǎng)基中含有PO43I乍為構(gòu)成成分時，使用的無機電解質(zhì)沒有特別限定， 例如，可以選擇使用選自磷酸（H3PO4)、磷酸二氫銨（NH4H 2PO4)、磷酸氫二銨（(NH4)2HPO4)、磷 酸三銨（(NH4)3PO4)、磷酸一氫鎂（MgHPO4)、磷酸鎂（Mg 3(PO4)2)、磷酸二氫鉀（KH2PO4)、磷酸氫 二鉀（K 2HPO4)、磷酸三鉀（K3PO4)、磷酸銨鎂（MgNH 4PO4)、磷酸二氫鎂（Mg (H2PO4) 2)、磷酸一氫 鎂（MgHPO4)和磷酸鎂（Mg3(PO 4)2)中的至少一種以上。無機鹽培養(yǎng)基中的PO4I含量，優(yōu)選 為2?40mmol/L，更優(yōu)選為10?30mmol/L。另外，從更高效地生產(chǎn)D -乳酸的觀點考慮， 在培養(yǎng)開始時的無機鹽培養(yǎng)基中，PO43^含量優(yōu)選為2mmol/L以上，更優(yōu)選為lOmmol/L以上。 另一方面，從更高效地生產(chǎn)D-乳酸的觀點考慮，在培養(yǎng)開始時的無機鹽培養(yǎng)基中，PO/^含 量的上限值優(yōu)選為40mmol/L以下，更優(yōu)選為30mmol/L以下。
[0069] 在無機鹽培養(yǎng)基中含有NH4+作為構(gòu)成成分時，使用的無機電解質(zhì)沒有特別限 定，例如，可以選擇使用選自磷酸二氫銨（ΝΗ4Η2Ρ04)、磷酸氫二銨（(ΝΗ 4)2ΗΡ04)、磷酸銨 ((NH4) 3PO4)、磷酸銨鎂（MgNH4PCM)、硫酸銨（(NH4) 2SO4)和磷酸氫銨鉀（NH4KHPO4)中的至少 一種以上。無機鹽培養(yǎng)基中的NH 4+含量，優(yōu)選為20?120mmol/L，更優(yōu)選為40?80mmol/ L。另外，從更高效地生產(chǎn)D -乳酸的觀點考慮，在培養(yǎng)開始時的無機鹽培養(yǎng)基中，NH4+含量 優(yōu)選為20mmol/L以上，更優(yōu)選為40mmol/L以上。另一方面，從更高效地生產(chǎn)D -乳酸的觀 點考慮，在培養(yǎng)開始時的無機鹽培養(yǎng)基中，NH4+含量的上限值優(yōu)選為120mmol/L以下，更優(yōu) 選為80mmo1 /T,以下。
[0070] 在無機鹽培養(yǎng)基中含有SO42I乍為構(gòu)成成分時，使用的無機電解質(zhì)沒有特別限定， 例如，可以選擇使用選自硫酸鉀（K 2SO4)、硫酸銨（(NH4)2SO4)和硫酸鎂（MgSO 4)中的至少一 種以上。無機鹽培養(yǎng)基中的SO42-含量，優(yōu)選為10?50mmol/L，更優(yōu)選為20?40mmol/L。 另外，從更高效地生產(chǎn)D-乳酸的觀點考慮，在培養(yǎng)開始時的無機鹽培養(yǎng)基中，SO/+含量優(yōu) 選為lOmmol/L以上，更優(yōu)選為20mmol/L以上。另一方面，從更高效地生產(chǎn)D -乳酸的觀點 考慮，在培養(yǎng)開始時的無機鹽培養(yǎng)基中，SO42^含量的上限值優(yōu)選為50mmol/L以下，更優(yōu)選 為 40mmo1 /T,以下。
[0071] 在無機鹽培養(yǎng)基中含有Mg2+作為構(gòu)成成分時，使用的無機電解質(zhì)沒有特別限定， 例如，可以選擇使用選自磷酸氫鎂（MgHPO 4)、磷酸二氫鎂（Mg(H2PO4)2)、磷酸鎂（Mg 3(PO4)2)、 磷酸銨鎂（MgNH4PO 4)和硫酸鎂（MgSO4)中的至少一種以上。無機鹽培養(yǎng)基中的Mg2+含量，優(yōu) 選為0. 2?2mmol/L，更優(yōu)選為0. 5?I. 4mmol/L。另外，從更高效地生產(chǎn)D -乳酸的觀點考 慮，在培養(yǎng)開始時的無機鹽培養(yǎng)基中，Mg2+含量優(yōu)選為0. 2mmol/L以上，更優(yōu)選為0. 5mmol/ L以上。另一方面，從更高效地生產(chǎn)D -乳酸的觀點考慮，在培養(yǎng)開始時的無機鹽培養(yǎng)基中， Mg2+含量的上限值優(yōu)選為2mmol/L以下，更優(yōu)選為I. 4mmol/L以下。
[0072] 另外，本實施方式中的"無機鹽培養(yǎng)基"還可以含有硫胺素、過渡金屬離子。當(dāng)無 機鹽培養(yǎng)基中含有硫胺素、過渡金屬離子時，從廉價并且高效地生產(chǎn)D -乳酸的觀點考慮， 優(yōu)選至少滿足上述（c)或上述（d)中的任一方，從更簡便地進行純化的觀點考慮，進一步優(yōu) 選滿足上述（C)和上述（d)兩方。
[0073] 在培養(yǎng)開始時的無機鹽培養(yǎng)基中，硫胺素含量優(yōu)選為0. lmg/L以下，更優(yōu)選為 0.02mg/L以下。進而，作為無機鹽培養(yǎng)基，更優(yōu)選使用不含硫胺素的培養(yǎng)基。因此，在培養(yǎng) 開始時的無機鹽培養(yǎng)基中，硫胺素含量優(yōu)選為〇?〇. lmg/L，更優(yōu)選為0?0. 02mg/L。另外， 對于下限值，優(yōu)選為〇mg/L以上。
[0074] 另外，過渡金屬離子沒有特別限定，例如，可以使用選自鐵離子、鈷離子、銅離子、 鋅離子和鑰酸根離子中的至少一種以上離子。并且，在培養(yǎng)開始時的無機鹽培養(yǎng)基中，過渡 金屬離子的含量優(yōu)選為l〇mg/L以下，更優(yōu)選為0. 85mg/L以下。進而，作為無機鹽培養(yǎng)基， 優(yōu)選使用實質(zhì)上不含過渡金屬離子的培養(yǎng)基。因此，無機鹽培養(yǎng)基中過渡金屬離子的含量 優(yōu)選為〇?l〇mg/L，更優(yōu)選為0?0· 85mg/L。
[0075] 另外，在本實施方式的D-乳酸的生產(chǎn)方法中，培養(yǎng)開始時的無機鹽培養(yǎng)基優(yōu)選 進一步滿足下述（e)。通過這樣，可以得到更高品質(zhì)的聚合物，可以更廉價并且高效地生產(chǎn) D -乳酸。
[0076] (e)無機鹽培養(yǎng)基中過渡金屬離子的含量為0. 85mg/L以下。
[0077] 另外，本實施方式中的"無機鹽培養(yǎng)基"優(yōu)選為將無機電解質(zhì)溶解或混懸于水中 而制備的液體。通過向?qū)⒃摕o機電解質(zhì)溶解或混懸于水中而制備的液體中加入碳源，可以 以碳源作為原料通過發(fā)酵生產(chǎn)D -乳酸。另外，作為碳源使用的發(fā)酵性的糖，沒有特別限 定，例如，可以列舉選自葡萄糖、果糖、木糖、鹿糖、甘油、阿拉伯糖、蜜二糖、海藻糖、麥芽糖、 蜜二糖酸、乳糖、麥芽三糖、核糖、半乳糖、半乳糖醛酸、葡糖酸、葡糖胺、葡糖醛酸、甘露醇、 甘露糖、糖精酸、山梨糖醇、巖藻糖、鼠李糖、阿洛糖和N -乙酰葡糖胺中的一種以上的化合 物。另外，還可以使用淀粉水解物、草木質(zhì)分解產(chǎn)物、纖維素水解物等作為發(fā)酵性的糖（碳 源）?？紤]到高濃度的糖阻礙微生物的生長，培養(yǎng)開始時無機鹽培養(yǎng)基中的糖含量以葡萄糖 換算，相對于無機鹽培養(yǎng)基的總質(zhì)量優(yōu)選為200g/L以下，更優(yōu)選為150g/L以下。培養(yǎng)開始 時無機鹽培養(yǎng)基中的糖含量的下限優(yōu)選為20g/L以上，更優(yōu)選為50g/L以上?；谝陨嫌^ 點，在培養(yǎng)開始時無機鹽培養(yǎng)基中的糖含量優(yōu)選為20?200g/L，更優(yōu)選為50?150g/L。
[0078] 在本實施方式的"無機鹽培養(yǎng)基"中，可以進一步含有甜菜堿。此處，本實施方式中 的甜菜堿是CAS登記號107 - 43 - 7的化合物，也是作為三甲基甘氨酸、甘氨酸甜菜堿的名 稱已知的化合物。通過使用進一步含有該甜菜堿作為構(gòu)成成分的無機鹽培養(yǎng)基，生產(chǎn)D - 乳酸的大腸桿菌可以進行良好的D -乳酸的發(fā)酵生產(chǎn)，因此優(yōu)選。像這樣，在無機鹽培養(yǎng)基 含有甜菜堿時，其含量在無機鹽培養(yǎng)基中優(yōu)選為〇. 01?5mmol/L，更優(yōu)選為0. 3?2mmol/ L。另外，從更高效地生產(chǎn)D -乳酸的觀點考慮，在培養(yǎng)開始時的無機鹽培養(yǎng)基中，甜菜堿含 量優(yōu)選為〇. Olmmol/L以上，更優(yōu)選為0. 3mmol/L以上。另一方面，從更高效地生產(chǎn)D -乳酸 的觀點考慮，在培養(yǎng)開始時的無機鹽培養(yǎng)基中，甜菜堿含量的上限值優(yōu)選為5mmol/L以下， 更優(yōu)選為2mmol/L以下。
[0079] 另外，在本實施方式的"無機鹽培養(yǎng)基"中，還可以含有消泡劑。作為消泡劑，可以 適當(dāng)?shù)厥褂靡阎娜魏蜗輨?。例如，可以列舉ADEKAN0L LG126(商品名，ADEKA公司制） 等。相對于無機鹽培養(yǎng)基的總質(zhì)量，消泡劑的含量優(yōu)選為〇. 01?lg/L，更優(yōu)選為0. 05? 〇. 5g/L。另外，從更高效地生產(chǎn)D -乳酸的觀點考慮，在培養(yǎng)開始時的無機鹽培養(yǎng)基中，消 泡劑的含量優(yōu)選為〇. 〇lg/L以上，更優(yōu)選為0. 05g/L以上。另一方面，從更高效地生產(chǎn)D - 乳酸的觀點考慮，在培養(yǎng)開始時的無機鹽培養(yǎng)基中，消泡劑含量的上限值優(yōu)選為lg/L以 下，更優(yōu)選為〇.5g/L以下。
[0080] 在本實施方式中，在發(fā)酵生產(chǎn)D -乳酸時，在無機鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌體只要是 具有由碳源、優(yōu)選糖發(fā)酵生產(chǎn)D -乳酸的能力的生產(chǎn)D -乳酸的大腸桿菌，就沒有特別限 制，但作為生產(chǎn)D-乳酸的大腸桿菌，優(yōu)選使用下述重組大腸桿菌，所述重組大腸桿菌中， 通過基因重組使與對象大腸桿菌的乳酸生產(chǎn)活性相關(guān)的酶活性增加，或失活、活性降低，或 通過它們的組合，提高了 D -乳酸生產(chǎn)活性和/或D -乳酸光學(xué)純度。
[0081] 關(guān)于本實施方式中"通過基因重組"的用語，只要是相對于原本基因的堿基序 列插入其他的DNA，或者通過基因的某些部分的取代、缺失或它們的組合而使堿基序列上 產(chǎn)生變化，則全部包含在內(nèi)，例如，可以是由產(chǎn)生突變的結(jié)果得到的。作為提高了 D-乳 酸生產(chǎn)活性和/或D -乳酸光學(xué)純度的重組大腸桿菌，例如，可以列舉W02005/033324、 W02010/032697、W02010/032698記載的重組大腸桿菌等。
[0082] 具體而言，生產(chǎn)D-乳酸的大腸桿菌優(yōu)選為包含選自下述（i)?（V)中的一種以 上基因重組的重組大腸桿菌，更優(yōu)選包含（i)?（iii)的全部的基因重組的重組大腸桿菌。 這樣進行基因重組得到的重組大腸桿菌，在通氣條件下生產(chǎn)D -乳酸時，與IdhA的表達未 增強的情況相比，D -乳酸的蓄積量提高，雜質(zhì)丙酮酸的濃度減少，同時能夠提高D -乳酸 的光學(xué)純度。
[0083] (i)使大腸桿菌本來具有的FAD依賴性D -乳酸脫氫酶（Did)活性失活或降低的 基因重組
[0084] (ii)使大腸桿菌本來具有的丙酮酸甲酸裂解酶（Pfl)活性失活或降低的基因重 組
[0085] (iii)增強來自大腸桿菌的NADH依賴性D-乳酸脫氫酶（LdhA)活性的基因重組
[0086] (iv)使大腸桿菌本來具有的蘋果酸脫氫酶（Mdh)活性失活或降低的基因重組
[0087] (V)使大腸桿菌本來具有的天冬氨酸氨裂合酶（AspA)活性失活或降低的基因重 組
[0088] (i)的Dld是指在作為輔酶的氧化型黃素腺嘌呤二核苷酸的存在下，催化由D-乳 酸生成丙酮酸的反應(yīng)的酶的總稱。
[0089] (ii)的Pfl是指基于國際生物化學(xué)聯(lián)合（I. U. B.)酶委員會報告被分類為酶編號 2. 3. 1. 54、并且也被稱為甲酸乙?；D(zhuǎn)移酶的酶。該酶是指可逆地催化由丙酮酸生成甲酸 的反應(yīng)的酶的總稱。
[0090] (iii)的LdhA是指由丙酮酸和NADH生成D -乳酸和NAD的來自于大腸桿菌的酶。 [0091] (iv)的Mdh是指基于國際生物化學(xué)聯(lián)合（I. U. B.)酶委員會報告被分類為酶編號 I. I. 1. 37,在作為輔酶的氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的存在下可逆地催化由蘋果酸生成 草酰乙酸的反應(yīng)的酶的總稱。
[0092] (V)的AspA是指基于國際生物化學(xué)聯(lián)合（I. U. B.)酶委員會報告被分類為酶編號 4. 3. 1. 1、并且也被稱為天冬氨酸酶的酶。該酶是指可逆地催化由L 一天冬氨酸生成富馬酸 的反應(yīng)的酶的總稱。
[0093] 關(guān)于上述（iii)的基因重組，可以列舉以下方法：將編碼LdhA的基因在與控制 和糖酵解體系、核酸生物合成體系或氨基酸生物合成體系相關(guān)的蛋白質(zhì)表達的基因的啟動 子連接的狀態(tài)下并入到表達質(zhì)粒中，再將該表達質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌的方法；通過使用控制 與糖酵解體系、核酸生物合成體系或氨基酸生物合成體系相關(guān)的蛋白質(zhì)表達的基因的啟動 子，由大腸桿菌基因組中存在的編碼來自于大腸桿菌的LdhA的基因表達LdhA的方法，并優(yōu) 選通過使用控制與糖酵解體系、核酸生物合成體系或氨基酸生物合成體系相關(guān)的蛋白質(zhì)表 達的基因的啟動子，由大腸桿菌基因組中存在的編碼LdhA的基因表達LdhA的方法。
[0094] 此處，控制與糖酵解體系、核酸生物合成體系或氨基酸生物合成體系相關(guān)的蛋白 質(zhì)表達的基因的啟動子，是指恒定性地在細菌內(nèi)、優(yōu)選在大腸桿菌內(nèi)發(fā)揮作用的強啟動子、 并且即使在葡萄糖存在下其表達也不易受抑制的啟動子。具體而言，作為控制與糖酵解體 系、核酸生物合成體系或氨基酸生物合成體系相關(guān)的蛋白質(zhì)表達的基因的啟動子，可以列 舉甘油醛一 3 -磷酸脫氫酶的啟動子、絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶（glyA)啟動子等。
[0095] 另外，生產(chǎn)D -乳酸的大腸桿菌中，選自由蔗糖非PTS基因群和FruK構(gòu)成的組中 的至少一個可以被增強，優(yōu)選蔗糖非PTS基因群和FruK雙方均被增強，更優(yōu)選蔗糖非PTS 基因群中的僅cscA和FruK -同被增強。
[0096] 蔗糖水解酶（蔗糖酶，CscA)是指基于國際生物化學(xué)聯(lián)合（I. U. B.)酶委員會報告 被分類為酶編號3. 2. 1. 26,催化由蔗糖生成D -葡萄糖和D -果糖的反應(yīng)的酶的總稱。對 于CscA的增強，例如可以通過將具有編碼來自于大腸桿菌的CscA的基因的堿基序列的DNA 導(dǎo)入大腸桿菌而實現(xiàn)。
[0097] 果糖一1 -磷酸激酶（FruK)是指基于國際生物化學(xué)聯(lián)合（I. U. B.)酶委員會報告 被分類為酶編號2. 7. 1. 56、并且也被稱為磷酸果糖激酶1的酶。對于FruK的增強，例如可 以通過將具有編碼來自于大腸桿菌的FruK的基因的堿基序列的DNA導(dǎo)入大腸桿菌而實現(xiàn)。
[0098] 本實施方式的D -乳酸的生產(chǎn)方法，包括使用生產(chǎn)D -乳酸的大腸桿菌，從碳源、 優(yōu)選從糖生產(chǎn)D -乳酸。即，包括使生產(chǎn)D -乳酸的大腸桿菌與碳源接觸的工序，和回收通 過接觸得到的D -乳酸的工序。
[0099] 具體而言，本實施方式的D-乳酸的生產(chǎn)方法包括：在無機鹽培養(yǎng)基中使生產(chǎn)D - 乳酸的大腸桿菌與碳源接觸，得到D -乳酸鹽的工序；和從含有D -乳酸鹽的無機鹽培養(yǎng)基 中除去生產(chǎn)D -乳酸的大腸桿菌后，將D -乳酸鹽脫鹽，得到D -乳酸的工序。
[0100] 另外，對于本實施方式的D -乳酸的生產(chǎn)方法，可以在得到上述D -乳酸鹽的工 序中，得到D -乳酸的堿土金屬鹽，然后在得到D -乳酸的工序中，通過將D -乳酸的堿土 金屬鹽脫鹽，使含有堿土金屬的無機鹽析出，也可以在得到D-乳酸鹽的工序中，得到D - 乳酸的堿金屬鹽，然后在得到D -乳酸的工序中，通過電滲析處理將D -乳酸的堿金屬鹽脫 鹽。
[0101] 另外，本實施方式的D-乳酸的生產(chǎn)方法，進一步包括在將D-乳酸鹽脫鹽得到 D -乳酸的工序后，進行D -乳酸純化的純化工序，在純化工序中，優(yōu)選一邊水解一邊進行 蒸餾。通過這樣，可以進一步提高蒸餾工序的D-乳酸回收率，可以更廉價并且高效地生產(chǎn) D -乳酸。
[0102] 生產(chǎn)D -乳酸的大腸桿菌與碳源的接觸，通過在上述無機鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)生產(chǎn) D -乳酸的大腸桿菌而進行，由此可以得到含有D -乳酸的發(fā)酵液。
[0103] 作為生產(chǎn)D-乳酸的大腸桿菌的培養(yǎng)條件，雖然隨著使用的大腸桿菌、培養(yǎng)裝置 而變化，但培養(yǎng)溫度優(yōu)選為20°C以上、40°C以下，更優(yōu)選為25°C以上、35°C以下。
[0104] 另外，培養(yǎng)槽的壓力在培養(yǎng)時優(yōu)選為常壓（0. IMPa)以上、0. 5MPa以下，更優(yōu)選為 常壓（0. IMPa)以上、0. 2MPa以下。
[0105] 另外，從提高大腸桿菌的發(fā)酵生產(chǎn)力的觀點考慮，培養(yǎng)的pH優(yōu)選可以為4.0以上、 9.0以下，更優(yōu)選為pH6.0以上、8.0以下，進一步優(yōu)選為pH7.0以上、7. 8以下。需要說明的 是，對于PH的調(diào)整，優(yōu)選一邊生產(chǎn)D-乳酸、一邊向培養(yǎng)槽中添加無機堿而進行。由此，可 以用無機堿中和生產(chǎn)出的D -乳酸，形成乳酸鹽。
[0106] 作為無機堿，例如，可以使用選自氫氧化鋰、氫氧化鈉、氫氧化鉀和氫氧化銣等堿 金屬鹽、氫氧化鎂、氫氧化鈣和氫氧化鋇等堿土金屬鹽，以及氨中的至少一種。另外，通過選 擇無機堿的種類而對應(yīng)于生產(chǎn)的D -乳酸的乳酸鹽的抗衡離子，可以為鋰離子、鈉離子、鉀 離子、銣離子、鎂離子、鈣離子、鋇離子、銨離子等任意的陽離子。
[0107] 培養(yǎng)時間沒有特別限定，只要是菌體充分增殖、并且生成D-乳酸所需要的時間 即可。
[0108] 一般情況下，培養(yǎng)時通常使用能夠控制溫度、pH、通氣條件、攪拌速度、壓力的培養(yǎng) 槽，但在本實施方式的培養(yǎng)時并不限定于使用培養(yǎng)槽。需要說明的是，在使用培養(yǎng)槽培養(yǎng) 時，需要將大腸桿菌接種到培養(yǎng)槽內(nèi)的培養(yǎng)基中，但接種的量沒有特別限定，對于使用的大 腸桿菌，也可以使其在瓊脂培養(yǎng)基中形成菌落，并通過鉬環(huán)等將該菌落直接接種到培養(yǎng)槽 中。
[0109] 另外，也可以配制在燒瓶或其他培養(yǎng)槽等容器中進行了預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)液，將其以 必要量接種到培養(yǎng)槽內(nèi)的培養(yǎng)基中。這時培養(yǎng)液的必要量沒有特別限制，只要是將大腸桿 菌以至少1個細胞接種到培養(yǎng)槽內(nèi)的培養(yǎng)基中的量即可。具體而言，培養(yǎng)液的量優(yōu)選為相 當(dāng)于培養(yǎng)槽內(nèi)培養(yǎng)基液量的〇.〇1 %?40%的量，更優(yōu)選為相當(dāng)于0. 1 %?10%的量。另 夕卜，從更高效地生產(chǎn)D-乳酸的觀點考慮，培養(yǎng)液的必要量優(yōu)選為相當(dāng)于0. 01 %以上的量， 更優(yōu)選為相當(dāng)于〇. 1 %以上的量。另一方面，從更高效地生產(chǎn)D -乳酸的觀點考慮，培養(yǎng)液 必要量的上限值優(yōu)選為相當(dāng)于40%以下的量，更優(yōu)選為相當(dāng)于10%以下的量。
[0110] 另外，從乳酸生產(chǎn)效率的觀點考慮，發(fā)酵工序中的通氣量只要為Ovm以上即可， 優(yōu)選為〇· OOlvvm以上，更優(yōu)選為0· Olvvm以上。另一方面，從乳酸生產(chǎn)效率的觀點考慮，發(fā) 酵工序中的通氣量只要為5vvm以下即可，優(yōu)選為2vvm以下，更優(yōu)選為Ivvm以下。
[0111] 需要說明的是，本實施方式中的通氣量，有時使用vvm的表述。本說明書中所謂的 "vvm"，表示在1分鐘內(nèi)進行液體容量多少倍的通氣，例如，相對于IOL的發(fā)酵液進行5vvm 的通氣，是指每分鐘進行50L的通氣。
[0112] 在向液體中通氣時，由于根據(jù)內(nèi)壓、攪拌葉位置、攪拌葉形狀、攪拌速度的組合，氧 氣在液體中的溶入速度發(fā)生變化，因此可以以D -乳酸的生產(chǎn)率以及除D -乳酸之外的有 機酸量等為指標(biāo)，設(shè)定各種條件。需要說明的是，設(shè)定的通氣條件不需要從發(fā)酵初期到結(jié)束 一直維持，即使在發(fā)酵工序的一部分中維持該條件，也能夠得到優(yōu)選的結(jié)果。通過如上所述 進行通氣，可以實現(xiàn)D -乳酸生產(chǎn)率的提高、D -乳酸以外的有機酸量的削減。
[0113] 另外，從乳酸生產(chǎn)率的觀點考慮，氧攝取速度（OUR)優(yōu)選為0. Ommol/L/hr以上，更 優(yōu)選為1.0mm〇l/L/hr以上。另一方面，從乳酸生產(chǎn)率的觀點考慮，氧攝取速度（OUR)的上 限值優(yōu)選為100. 〇mm〇l/L/hr以下，更優(yōu)選為50. Ommol/L/hr以下，進一步優(yōu)選為10. Ommol/ L/hr以下，更進一步優(yōu)選為5. 0mmol/L/hr以下。
[0114] 需要說明的是，關(guān)于0UR，只要在D-乳酸的生產(chǎn)期進行測定即可。此處，D-乳酸 的生產(chǎn)期是指發(fā)酵開始后，經(jīng)過大腸桿菌培養(yǎng)的適應(yīng)期，大腸桿菌開始增殖并且生產(chǎn)D - 乳酸的時期。另外，在將大腸桿菌的培養(yǎng)和乳酸生產(chǎn)分開實施時，是指乳酸生產(chǎn)工序。
[0115] 在本實施方式中，所謂氧攝取速度（OUR)，是指每單位容積發(fā)酵液中的氧移動速 度，即也可以說是大腸桿菌的氧攝取速度。OUR使用通過排氣分析法由下式1求出的值。
[0116] (式 1)
[0117] OUR = 7. 22 X IO6ALX (QiPiyi/Ti - QoPoyo/To)
[0118] VL :發(fā)酵槽中的液量（L)
[0119] Qi和Qo :空氣入口和出口處的空氣流量（L/min)
[0120] Pi和Po :空氣入口和出口處的空氣壓（MPa)
[0121] Ti和To :空氣入口和出口處的絕對溫度（K)
[0122] yi和yo :空氣入口和出口處的氧的摩爾分率
[0123] 需要說明的是，在基于上述式1求出OUR時，當(dāng)空氣流量、空氣壓、絕對溫度的值在 空氣入口和出口處的差異為可以忽略的程度時，也可以適用在1個位置的測定值。另外，本 實施方式中所述的壓力和空氣壓是指絕對壓力。
[0124] OUR隨著通氣量、攪拌旋轉(zhuǎn)速度、溫度、壓力、pH等而變化。因此，為了將OUR調(diào)整 至上述范圍內(nèi)，只要適當(dāng)調(diào)整通氣流量、攪拌旋轉(zhuǎn)速度等即可。
[0125] 另外，上述OUR也可以換算為其他指標(biāo)。作為該其他指標(biāo)，可以列舉液膜容量系 數(shù)（Ia)。液膜容量系數(shù)（K#)是通氣量·攪拌旋轉(zhuǎn)速度的函數(shù)，已知為以下關(guān)系（式2， Richards, J. W. 1961, Prog. Ind. Micro. 3,143 - 172)
[0126] (式 2)
[0127] kLa a (PgA)0 4Vs0 5N0.5
[0128] Pg:通氣攪拌槽的消耗動力
[0129] V :充滿槽中的液量
[0130] Vs:表觀的空氣線速度（通氣量/槽截面積）
[0131] N :攪拌旋轉(zhuǎn)速度
[0132] 圖1表示在生產(chǎn)D-乳酸的大腸桿菌的培養(yǎng)中使用的發(fā)酵裝置的一個例子。在發(fā) 酵裝置10中設(shè)置有發(fā)酵槽12。在該發(fā)酵槽12中，通過質(zhì)量流量計14由空氣入口供給空氣 (箭頭A)，另一方面，通過冷凝器16將槽內(nèi)的空氣由排氣口排出（箭頭B)。在冷凝器16和 排氣口之間連接有槽內(nèi)壓力計18和排氣分析計20,分別能夠測定槽內(nèi)的壓力和出口的氧 摩爾分壓。在發(fā)酵槽12中，分別配置有溫度傳感器22、D0傳感器24和pH傳感器26,能夠 測定發(fā)酵槽12內(nèi)的反應(yīng)液中的溫度、DO(溶解氧）和pH。另外，在發(fā)酵槽12中配置有作為 攪拌機的盤式渦輪攪拌槳28,盤式渦輪攪拌槳28通過電動機44進行攪拌·控制。
[0133] 另外，發(fā)酵槽12的周圍是雙層的，可以通過溫水進行加熱或冷卻。在發(fā)酵槽12的 外側(cè)設(shè)置有填充了 pH調(diào)節(jié)劑的pH調(diào)節(jié)部34。pH調(diào)節(jié)部34通過泵36從而能夠向發(fā)酵槽 12中供給pH調(diào)節(jié)劑。作為pH調(diào)節(jié)劑，可以使用前述的無機堿。
[0134] 在發(fā)酵槽12中具備控制整體的控制器38,該控制器38與溫度傳感器22、D0傳感 器24和pH傳感器26連接，能夠輸入來自各個傳感器的信息。另外，控制器38根據(jù)來自各 種傳感器的信息，調(diào)節(jié)封套32的溫度，控制發(fā)酵槽內(nèi)的溶液溫度，同時通過泵36的動作進 7TT pH控制。
[0135] 蓄積在發(fā)酵槽12中的D -乳酸，可以通過從無機鹽培養(yǎng)基中分離?純化而回收。 具體而言，是從無機鹽培養(yǎng)基中除去菌體等固體物質(zhì)、脫鹽、濃縮、純化等工序，但其方法、 順序沒有特別限制，但優(yōu)選從發(fā)酵后的無機鹽培養(yǎng)基中除去生產(chǎn)D -乳酸的大腸桿菌后， 對D -乳酸鹽進行脫鹽，得到D -乳酸。
[0136] 例如，對于菌體等固體物質(zhì)的除去，可以列舉離心分離、過濾等方法。
[0137] 在純化工序中，由D -乳酸鹽轉(zhuǎn)變?yōu)镈 -乳酸的方法，可以列舉離子交換柱、電滲 析等。也可以通過添加無機酸而脫鹽為D-乳酸。例如，在D-乳酸鹽的抗衡離子為堿土金 屬離子時，通過對D-乳酸鹽進行脫鹽，可以析出含有堿土金屬的無機鹽。例如，當(dāng)D-乳 酸鹽的抗衡離子為鈣離子時，通過添加硫酸，使硫酸鈣析出到溶液中而脫鹽，可以得到D - 乳酸。
[0138] 另外，當(dāng)D -乳酸鹽的抗衡離子為堿金屬離子、優(yōu)選鈉離子或鉀離子時，優(yōu)選通過 電滲析處理使D-乳酸鹽脫鹽。在電滲析處理中，可以使用水解電滲析裝置。該裝置是交替 排列雙極膜和陽離子交換膜，形成酸室和堿室的電滲析裝置。作為其代表，可以列舉"二室 式水解電滲析裝置"。在本實施方式中，將使用"水解電滲析裝置"的電滲析操作定義為"水 解電滲析工序"。并且，作為更具體的處理，代表性地可以舉出"二室式水解電滲析工序"。
[0139] 在水解電滲析工序中，對于得到的含有D -乳酸鹽的發(fā)酵液，使用水解電滲析裝 置進行水解電滲析工序，分別回收D -乳酸和堿。也就是說，在使用雙極膜和陽離子交換膜 的水解電滲析裝置中，供給D -乳酸鹽溶液，進行水解電滲析工序，分別由酸室得到D -乳 酸，由堿室得到堿。
[0140] 作為雙極膜，可以使用以往已知的雙極膜，即具有將陽離子交換膜和陰離子交換 膜貼合在一起的結(jié)構(gòu)的已知的雙極膜。另外，作為水解電滲析裝置的陽離子交換膜，可以使 用已知的陽離子交換膜。
[0141] 圖2表示在本實施方式中使用的水解電滲析裝置的代表性方式的簡圖。即，在圖 2中，水解電滲析裝置在陽極3和陰極4之間交替排列作為膜的雙極膜B和陽離子交換膜C 這兩種膜，形成酸室8和堿室7兩個室。在陽離子交換膜C和陽極3的空隙（陽極室5)以 及陽離子交換膜C和陰極4的空隙（陰極室6)之間充滿了電極液。此處，在雙極膜B的陰 離子交換體側(cè)與陽離子交換膜C之間的室形成堿室7,在雙極膜B的陽離子交換體側(cè)與陽離 子交換膜C之間的室形成酸室8。
[0142] 上述水解電滲析裝置的結(jié)構(gòu)采用已知結(jié)構(gòu)。
[0143] 在本實施方式的D -乳酸的生產(chǎn)方法中，使用上述水解電滲析裝置的水解電滲析 工序優(yōu)選采用下述方法：設(shè)置向酸室8、堿室7的各個室供給液體的外部槽（未圖示），一邊 在各個室和外部槽之間進行液體循環(huán)，一邊進行電滲析的方法。
[0144] 如上所述，在向酸室8中供給D -乳酸鹽溶液進行電滲析時，酸室8中的D -乳酸 鹽在通電的同時轉(zhuǎn)變?yōu)镈-乳酸。S卩，被導(dǎo)入到酸室8中的D-乳酸鹽的陽離子，透過陽離 子交換膜C向堿室7移動，這時，與由雙極膜B生成的OH離子結(jié)合形成堿。另外，在酸室8 中由雙極膜B生成的質(zhì)子與D -乳酸陰離子結(jié)合形成非解離性的D -乳酸，就那樣地留在 酸室8中。
[0145] 在本實施方式中，水解電滲析工序時各種液體的溫度通常為5°C以上70°C以下， 優(yōu)選為20°C以上50°C以下。
[0146] 如上所述，通過水解電滲析工序，可以分解D-乳酸鹽，將D-乳酸和堿分離，回收 D-乳酸。需要說明的是，分離的堿可以作為在D-乳酸等有機酸發(fā)酵中的中和劑進行再利 用。
[0147] 通過上述水解電滲析工序，可以得到純度高的D -乳酸。
[0148] 在濃縮和純化工序中，例如，對于蛋白質(zhì)、副產(chǎn)物有機酸等雜質(zhì)的除去，可以列舉 活性炭處理、NF膜處理，對于離子性物質(zhì)的除去，可以列舉離子交換柱、陰離子/陽離子交 換膜電滲析，對于利用蒸發(fā)的濃縮、純化以及乳酸的回收，可以列舉在脫鹽后直接蒸餾的方 法、水蒸氣蒸餾的方法、形成丙交酯等進行蒸餾的方法、加入醇和催化劑進行酯化后蒸餾的 方法、在有機溶劑中進行提取的方法、用色譜柱進行分離的方法、用離子交換柱進行分離的 方法、通過陰離子/陽離子交換膜電滲析進行濃縮和回收的方法、通過晶析進行結(jié)晶化的 方法。另外，這些方法還可以以任意的順序進行適當(dāng)?shù)亟M合。
[0149] 例如，優(yōu)選對脫鹽后得到的D -乳酸溶液進行活性炭處理。由此，可以除去著色成 分，得到適合于聚合物化的用途的D -乳酸?；钚蕴刻幚砜梢匀缦聦嵭?，例如，添加相對于 D -乳酸溶液的重量而言為0. 2重量％以上、2重量％以下的活性炭，根據(jù)需要進行攪拌后， 通過過濾除去活性炭。在以水的400nm的光透射率為100%時，活性炭處理后的D-乳酸溶 液的400nm的光透射率可以為80%以上、99%以下。
[0150] 另外，例如，在對脫鹽后得到的D -乳酸溶液間歇或連續(xù)地進行蒸餾時，優(yōu)選一邊 加水進行水解一邊蒸餾。由此，可以抑制釜內(nèi)液體的聚合，提高蒸餾收率。聚合度η優(yōu)選為 1以上、4以下，更優(yōu)選為1以上、2以下，進一步優(yōu)選為1以上、1.5以下。這時的蒸餾收率 可以為70重量％以上、99. 5重量％以下。此處所述的蒸餾收率是蒸餾工序中乳酸成分的回 收率，所謂乳酸成分是指乳酸和乳酸低聚物。
[0151] 另外，例如，在蒸發(fā)濃縮工序中進行聚合時，在蒸餾前事先進行水解、降低乳酸的 聚合度η，對于蒸餾收率的提高也是有效的。
[0152] 此處，本實施方式的聚合物的生產(chǎn)方法是使用通過本實施方式的D -乳酸的生產(chǎn) 方法得到的D -乳酸進行聚合反應(yīng)。以下，進行詳細說明。
[0153] 通過以在本實施方式的D-乳酸的生產(chǎn)方法中得到的D-乳酸作為原料進行聚合 物聚合，可以得到著色少，高分子量的聚合物（聚乳酸、乳酸共聚物）。此處所述的聚乳酸， 包括D -乳酸和L 一乳酸的立構(gòu)復(fù)合型聚合物和D -乳酸的均聚物。作為D -乳酸和L 一 乳酸的立構(gòu)復(fù)合型聚合物的原料之一的L 一乳酸，可以合適地使用已知的材料。L 一乳酸的 制法沒有特別限定，例如，可以列舉發(fā)酵法、有機合成法等。這些聚乳酸、乳酸共聚物可以用 于通過各種成型加工方法進行加工的各種用途，所述成型加工方法例如為注射成型、膜成 型、片材成型、擠出成型、吹塑成型、發(fā)泡成型等。作為用途，例如，可以列舉利用生物分解性 塑料的特性、耐熱性等的包裝容器、緩沖材料、各種電子?電氣設(shè)備、辦公設(shè)備、車輛部件、機 械部件、其他農(nóng)業(yè)材料、漁業(yè)材料、搬運容器、游戲用具和雜貨等。
[0154] 在本實施方式的聚乳酸的生產(chǎn)方法中，聚合的方法沒有特別限定，可以采用已知 的方法。例如，可以列舉以下聚合方法：經(jīng)由乳酸丙交酯的開環(huán)聚合；將乳酸、乳酸酯直接 聚合的縮聚；將乳酸、乳酸酯直接聚合得到的低聚物通過多異氰酸酯等經(jīng)由酰胺鍵、氨基甲 酸酯鍵等進行擴鏈的聚合方法等。另外，作為聚合的形式，可以列舉固相聚合、熔融聚合等。
[0155] 在本實施方式的乳酸共聚物的生產(chǎn)方法中，排列順序、聚合方法沒有特別限定，可 以采用已知的方法。例如，在排列順序中，可以列舉無規(guī)共聚、交替共聚、嵌段共聚、接枝共 聚等，另外，在聚合方法中，可以列舉自由基共聚、離子共聚、共縮合等。
[0156] 這種通過本實施方式的方法得到的D -乳酸可以用于聚乳酸的制造。得到的聚乳 酸的重均分子量（Mw)優(yōu)選為5萬以上、40萬以下，更優(yōu)選為8萬以上、30萬以下。
[0157] 此處，聚合物的分子量分布通常用Mw/Mn表示，在聚乳酸等的縮聚反應(yīng)中，一般來 說，在臨近反應(yīng)結(jié)束時，分子量分布接近2 (參見R村誠三著高分子化學(xué)序論第2版p. 210)。 已知分子量分布會大大影響聚合物的流動性、機械性質(zhì)，如果分子量分布變寬，即，Mw/Mn的 值變大，則非牛頓特性變大，流動性提高，因此在成型加工的工序中樹脂容易成型。由通過 本實施方式的方法得到的D-乳酸制造的聚乳酸、乳酸共聚物，其分子量分布比一般的縮 聚系聚合物更寬，其范圍優(yōu)選可以為3以上、20以下，更優(yōu)選為5以上、15以下，進一步優(yōu)選 為8以上、12以下，具有容易成型的特性。進而，通過本實施方式的方法得到的D -乳酸，即 使不經(jīng)過大量的活性炭處理、復(fù)雜的純化工序，也可以制造分子量分布寬的聚乳酸、乳酸共 聚物。例如，在活性炭處理中，用0. 2重量％以上、2重量％以下的少量活性炭進行處理，也 可以制造分子量分布寬的聚乳酸、乳酸共聚物。
[0158] 另外，由通過本實施方式的方法得到的D -乳酸制造的聚乳酸、乳酸共聚物的著 色度（YI值），YI值優(yōu)選可以為10以下，更優(yōu)選為5以下。
[0159] 需要說明的是，此處所述的?值，是以理想中的白色（完全漫反射面）作為0,表 示與該白色的差距，并且從白色向黃色方向的色差用正數(shù)表示，向藍色方向的色差用負數(shù) 表示。因此，如果負數(shù)的值增大，則藍色增加，如果正數(shù)的值增大，則黃色增加，兩者均為色 調(diào)變差的原因。
[0160] 在作為顏色三原色的紅、綠、藍中，如果X為主要感覺到紅色的值，Y為感覺到綠色 的值，Z為感覺到藍色的值，則?值使用色差計（例如，島津制作所紫外一可見分光光度計 UV - 2400PC)測定三個刺激值X、Υ、Ζ，由式3算出。
[0161] YI 值=100Χ (I. 28Χ - I. 06Ζ)/Υ (式 3)
[0162] 根據(jù)本實施方式的方法，可以提供一種更廉價并且高效地生產(chǎn)D -乳酸單體的方 法，所述D -乳酸單體能夠聚合成與色調(diào)、分子量等D -乳酸聚合物所要求的品質(zhì)相符的 D -乳酸聚合物。另外，可以提供一種在工業(yè)上的大量生產(chǎn)中，進一步削減了常常會出問題 的廢棄物、廢鹽的D -乳酸單體制造方法。
[0163] 以上，對本發(fā)明的實施方式進行了說明，但這些都是本發(fā)明的例示，也可以采用上 述以外的各種構(gòu)成。
[0164] 實施例
[0165] 以下，通過實施例詳細說明本發(fā)明。但本發(fā)明并不受這些實施例的任何限定。只要 沒有特別說明，則得到的D -乳酸的光學(xué)純度均為100% ee。光學(xué)純度使用HPLC通過常規(guī) 方法測定（柱：SUMICHIRAL OA - 5000 (住化分析中心公司制）、洗脫液：含有異丙醇10g/L 和無水硫酸銅（11)319. 2mg/L的水溶液，檢測波長：254nm)。
[0166] (制造例1)
[0167] 與W02005/033324的實施例23記載的方法同樣地制作大腸桿菌株、 MG1655 Δ pf 1 Δ did Δ mdh Δ asp 株 /GAPldhA 基因組插入株。
[0168] 具體而言，通過以下方法，制作大腸桿菌株、MG1655 Δ pf 1 Δ did Amdh Δ asp株/ GAPldhA基因組插入株。
[0169] 〈制造1 :大腸桿菌did基因附近區(qū)域的克隆〉
[0170] 大腸桿菌的基因組DNA的全部堿基序列是已知的（GenBank登錄號U00096)，編碼 大腸桿菌的FAD依賴性D-乳酸脫氫酶的基因（以下，有時簡稱為did)的堿基序列也已被 報道（Genbank 登錄號 M10038)。
[0171] 通過 Current Protocols in Molecular Biology (JohnWiley&Sons)記載的方 法制備大腸桿菌MG1655株的基因組DNA，使用得到的基因組DNA以及基于來自MG1655 株的基因組DNA的did基因附近區(qū)域的基因信息制作的CAACACCAAGCTTTCGCG (序列 號 I)、TTCCACTCCTTGTGGTGGC(序列號 2)、AACTGCAGAAATTACGGATGGCAGAG(序列號 3)和 TGTTCTAGAAAGTTCTTTGAC(序列號4)進行PCR。對于得到的片段，分別用限制酶HindIII和 PstI、PstI和XbaI進行消化，由此分別得到約IHObp的片段。將該片段與使用Hindlll、 XbaI 消化溫度敏感性質(zhì)粒 pTH18csl (Hashimoto - Gotoh，Τ· , et. al.，Gene，Vol. 241 (1), ppl85 - 191(2000))得到的片段混合，使用連接酶連接后，轉(zhuǎn)化到DH5a感受態(tài)細胞（東洋 紡績株式會社DNA - 903)中，于30°C在含有10 μ g/ml氯霉素的LB瓊脂板上進行培養(yǎng)，得 到生長的轉(zhuǎn)化體。將所得的菌落于30°C在含有10 μ g/ml氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)一 夜，從得到的菌體中回收質(zhì)粒。通過測序確認(rèn)對質(zhì)粒的插入序列，確認(rèn)了目標(biāo)did基因附近 區(qū)域的序列被插入。將該質(zhì)粒命名為ρΤΗΛ did。
[0172] 〈制造2 :大腸桿菌MG1655株did基因缺失株的制作〉
[0173] 將上述制造1中得到的質(zhì)粒pTHAdld轉(zhuǎn)化到MG1655株中，得到于30°C在含有 10 μ g/ml氯霉素的LB瓊脂板上生長的轉(zhuǎn)化體。將得到的轉(zhuǎn)化體接種到含有10 μ g/ml氯霉 素的LB液體培養(yǎng)基中，在30°C下培養(yǎng)一夜。接著將這些培養(yǎng)菌體涂布在含有10 μ g/ml氯 霉素的LB瓊脂板上，得到在42°C下生長的菌落。
[0174] 再重復(fù)一次得到在42°C下生長的單菌落的操作。
[0175] 接著，將上述克隆接種到LB液體培養(yǎng)基（3ml/試管）中，在30°C下振蕩培養(yǎng)3? 4小時。將其適當(dāng)稀釋（KT 2?ΙΟ+6左右）以得到單菌落，并涂布在LB瓊脂板上，在42°C 下培養(yǎng)一夜，得到菌落。從出現(xiàn)的菌落中隨機挑選100個菌落，使其分別在LB瓊脂板和含 有10 μ g/ml氯霉素的LB瓊脂板上生長，選出只在LB瓊脂板上生長的氯霉素敏感性克隆 體。進而，通過PCR，從這些目標(biāo)克隆體的染色體DNA選擇did基因區(qū)域缺失的株，將滿足以 上條件的克隆體作為did缺失株，將得到的株命名為MG1655 Λ did株。
[0176] 需要說明的是，大腸桿菌MG1655株可以從作為細胞·微生物?基因庫的美國模式 菌種收集中心（American Type Culture Collection)獲得。
[0177] 〈制造3 :大腸桿菌pf I基因附近區(qū)域的克隆〉
[0178] 大腸桿菌的基因組DNA的全部堿基序列是已知的（GenBank登錄號U00096)，編 碼大腸桿菌的丙酮酸甲酸裂解酶（以下，有時稱為Pfl)的基因的堿基序列也已被報道 (Genbank登錄號AE000192)。為了對編碼pfl的基因的堿基序列附近區(qū)域進行克隆，合成 了 4種序列號5、6、7和8所不的寡核苷酸引物。序列號6、7的引物在5'末端側(cè)具有SphI 識別位點。
[0179] 通過 Current Protocols in Molecular Biology (JohnWiley&Sons)記載的方法 制備大腸桿菌MG1655株的基因組DNA，并利用得到的基因組DNA、以及具有序列號5的堿 基序列的引物、具有序列號6的喊基序列的引物、具有序列號7的喊基序列的引物和具有 序列號8的堿基序列的引物的組合，在通常的條件下進行PCR，由此擴增出約LSkbp (以下 有時稱為PflB - L片段）及約1.3kbp(以下有時稱為pflB - R片段）的DNA片段。利 用瓊脂糖電泳分離、回收該DNA片段，分別用HindIII和SphI消化pf IB - L片段，用SphI 和PstI消化pflB - R片段。利用T4DNA連接酶使該2種消化片段和溫度敏感性質(zhì)粒 pTH18csl (GenBank 登錄號 AB019610) (Hashimoto - Gotoh，T.，et. al.，Gene，Vol. 241 (1)， ppl85 - 191 (2000))的HindIII及PstI消化物反應(yīng)后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞 (東洋紡績株式會社DNA - 903)中，于30°C在含有10 μ g/ml氯霉素的LB瓊脂板上進行培 養(yǎng)，得到生長的轉(zhuǎn)化體。將所得的菌落于30°C在含有10 μ g/ml氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中 培養(yǎng)一夜，從得到的菌體中回收質(zhì)粒。通過測序確認(rèn)對質(zhì)粒的插入序列，確認(rèn)了作為目標(biāo)的 編碼PflB的基因的5'上游附近片段和3'下游附近片段的2個片段被插入。將該質(zhì)粒命 名為 ρΤΗΛρ?!。
[0180] 〈制造4 :大腸桿菌MG1655pfl、did基因缺失株的制作〉
[0181] 將上述制造3中得到的質(zhì)粒ρΤΗ Λ pf 1轉(zhuǎn)化到MG1655 Λ did株中，得到在30°C下在 含有10 μ g/ml氯霉素的LB瓊脂板上生長的轉(zhuǎn)化體。與上述制造2同樣地對得到的轉(zhuǎn)化體 進行培養(yǎng)、選擇，最終進行Pfl基因缺失株的選擇，由此獲得Pfl基因被破壞的MG1655 Λ did 株，將該株命名為MG1655 Λ pf 1 Λ did株。
[0182] 〈制造5 :大腸桿菌MG1655 Δ pf 1 Δ did Δ mdh株的制作〉
[0183] 大腸桿菌的基因組DNA的全部堿基序列是已知的（GenBank登錄號U00096)，大腸 桿菌的mdh基因的堿基序列也已被報道（Genbank登錄號AE000403)。為了對編碼mdh的基 因的堿基序列附近區(qū)域進行克隆，合成了 4種序列號9、10、11和12所示的寡核苷酸引物。 具有序列號9的喊基序列的引物在5'末端側(cè)具有KpnI識別位點，具有序列號10、11的喊 基序列的引物在5'末端側(cè)具有BamHI識別位點，具有序列號12的喊基序列的引物在5'末 端側(cè)具有XbaI識別位點。
[0184] 通過 Current Protocols in Molecular Biology (JohnWiley&Sons)記載的方 法制備大腸桿菌MG1655株的基因組DNA，并利用得到的基因組DNA、以及序列號9和序列 號10、序列號11和序列號12的組合，在通常的條件下進行PCR，由此擴增出約SOObp (以 下有時稱為mdh - L片段）及約1，OOObp (以下有時稱為mdh - R片段）的DNA片段。利 用瓊脂糖電泳分離、回收該DNA片段，分別用KpnI和BamHI消化mdh - L片段，用BamHI 和XbaI消化mdh - R片段。利用T4DNA連接酶，使上述2種消化片段、和溫度敏感性質(zhì)粒 pTH18csl (GenBank 登錄號 AB019610) (Hashimoto - Gotoh，T.，et. al.，Gene，Vol. 241 (1)， ppl85 - 191 (2000))的KpnI和XbaI消化物進行反應(yīng)，之后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α感受態(tài) 細胞（東洋紡績株式會社DNA - 903)中，于30°C在含有10 μ g/ml氯霉素的LB瓊脂板上培 養(yǎng)，得到生長的轉(zhuǎn)化體。將所得的菌落于30°C在含有10 μ g/ml氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中 培養(yǎng)一夜，從得到的菌體中回收質(zhì)粒。通過測序確認(rèn)對質(zhì)粒的插入序列，確認(rèn)了作為目標(biāo)的 編碼mdh的基因的5'上游附近片段和3'下游附近片段的2個片段被插入。將該質(zhì)粒命名 為 ρΤΗΔmdh。
[0185] 將質(zhì)粒ρΤΗ Λ mdh轉(zhuǎn)化到MG1655 Λ pf 1 Λ did中，與上述制造2同樣地進行培養(yǎng)、選 擇，最終進行mdh基因缺失株的選擇，獲得mdh基因被破壞的MG1655 Δ pfl Δ did株，將該株 命名為 MG1655 Apfl AdldAmdh 株。
[0186] 〈制造 6 :大腸桿菌 MG1655 Δ pf 1 Δ did Δ mdh Δ asp 株的制作〉
[0187] 大腸桿菌的基因組DNA的全部堿基序列是已知的（GenBank登錄號U00096)，大腸 桿菌的aspA基因的堿基序列也已被報道（Genbank登錄號AE000486)。為了對編碼aspA的 基因的堿基序列附近區(qū)域進行克隆，合成了 4種序列號13、14、15和16所示的寡核苷酸引 物。
[0188] 通過大腸桿菌MG1655株的基因組DNA、以及序列號13和序列號14、序列號15和 序列號16的組合，在通常的條件下進行PCR，由此擴增約910bp (以下有時稱為aspA - L片 段）和約1，IOObp (以下有時稱為aspA - R片段）的DNA片段。利用瓊脂糖電泳分離、回收 該DNA片段。由于序列號14和序列號15包含互補的區(qū)域，因此將aspA - L片段和aspA - R片段混合，通過在不使用引物的情況下進行PCR反應(yīng)，能夠連接aspA - L片段和aspA - R片段?；诖耍B接aspA - L片段和aspA - R片段，并利用瓊脂糖電泳進行分離、回收。 用DNA Blunting Kit (寶生物）將得到的DNA片段的末端平滑化后，使用T4多聚核苷酸 激酶并通過常規(guī)方法將5'末端磷酸化。另一方面，對于溫度敏感性質(zhì)粒pTH18csl，在SmaI 消化后，用堿性磷酸酶進行脫磷酸化處理。用T4DNA連接酶使上述經(jīng)磷酸化的2種片段和 經(jīng)脫磷酸化的質(zhì)粒反應(yīng)后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞（東洋紡績株式會社DNA - 903)中，于30°C在含有10 μ g/ml氯霉素的LB瓊脂板上培養(yǎng)，得到生長的轉(zhuǎn)化體。將所得 的菌落于30°C在含有10 μ g/ml氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)一夜，從得到的菌體中回收 質(zhì)粒。通過測序確認(rèn)對質(zhì)粒的插入序列，確認(rèn)了作為目標(biāo)的編碼aspA的基因的5'上游附 近片段和3'下游附近片段的2個片段被插入。將該質(zhì)粒命名為pTHAasp。
[0189] 將質(zhì)粒ρΤΗΔ asp轉(zhuǎn)化到大腸桿菌MG1655 Δ pfl Δ did Amdh株中，與上述制 造2同樣地進行培養(yǎng)、選擇，最終進行aspA基因缺失株的選擇，獲得aspA基因被破壞的 MG1655 Δ pf 1 Δ did Δ mdh 株，將該株命名為 MG1655 Δ pf 1 Δ did Δ mdh Δ asp 株。
[0190] 〈制造7 :將大腸桿菌MG1655Apfl AdldAmdhAasp株的基因組上IdhA啟動子替 換為GAPDH啟動子〉
[0191] 大腸桿菌的IdhA基因的堿基序列已經(jīng)被報道（GenBank登錄號U36928)。為了獲 得甘油醛3-磷酸脫氫酶（GAPDH)啟動子，使用大腸桿菌MG1655株的基因組DNA作為模 板，利用 AACGAATTCTCGCAATGATTGACACGATTC(序列號 17)以及 ACAGAATTCGCTAITTGTTAGTGA ATAAAAGG (序列號18)，通過PCR法進行擴增，用限制酶EcoRI消化所得的DNA片段，由此得 到約IOObp的編碼GAPDH啟動子的片段。
[0192] 另外，大腸桿菌的基因組DNA的全部堿基序列是已知的（GenBank登錄號 U00096)，大腸桿菌的IdhA基因的堿基序列也已被報道（Genbank登錄號U36928)。為了 獲得D -乳酸脫氫酶基因（IdhA)，使用大腸桿菌MG1655株的基因組DNA作為模板，利用 GGAATTCCGGAGAAAGTCTTATGAAACT(序列號 19)以及 CCCAAGCTTTTAAACCAGTTCGTTCGGGC(序 列號20)，通過PCR法進行擴增，用限制酶EcoRI和HindIII對所得的DNA片段進行消化， 由此得到約I. Okbp的D -乳酸脫氫酶（IdhA)基因片段。將上述2個DNA片段和使用限制 酶EcoRI和HindIII消化質(zhì)粒pUC18所得的片段混合，使用連接酶連接后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 DH5 α感受態(tài)細胞（東洋紡績株式會社DNA - 903)中，得到在含有50 μ g/mL氨芐青霉素的 LB瓊脂板上生長的轉(zhuǎn)化體。將所得的菌落于30°C在含有50 μ g/mL氨芐青霉素的LB液體 培養(yǎng)基中培養(yǎng)一夜，從所得的菌體中回收質(zhì)粒。通過測序確認(rèn)對質(zhì)粒的插入序列，作為目標(biāo) 的編碼GAPDH啟動子和IdhA的基因被插入，得到了預(yù)計通過GAPDH啟動子來表達IdhA的 質(zhì)粒。將該質(zhì)粒命名為PGAP - ldhA。
[0193] 使用基于來自大腸桿菌MG1655株的IdhA基因5'附近區(qū)域的基因信息制備的 AAGGTACCACCAGAGCGTTCTCAAGC(序列號 21)和 GCTCTAGATTCTCCAGTGATGTTGAATCAC(序列號 22)，以大腸桿菌基因組DNA為模板進行PCR，由此擴增約IOOObp的DNA片段。
[0194] 另外，使用基于大腸桿菌MG1655株的甘油醛3 -磷酸脫氫酶（GAPDH)啟動子的序 列信息制作的GGTCTAGAGCAATGATTCACACGATTCG(序列號23)和基于大腸桿菌MG1655株的 IdhA基因的序列信息制作的AACTGCAGGTTCGTTCTCATACACGTCC(序列號24)，以之前制作的 載體pGAP - IdhA為模板進行PCR，得到由GAPDH啟動子和IdhA基因的起始密碼子附近區(qū) 域形成的約850bp的DNA片段。
[0195] 分別利用限制酶KpnI和Xbal、XbaI和PstI消化如上所述得到的片段，將該片段 與利用KpnI和PstI消化溫度敏感性質(zhì)粒pTH18csl所得的片段混合，使用連接酶連接后， 轉(zhuǎn)化到DH5 α感受態(tài)細胞（東洋紡績株式會社DNA - 903)中，得到于30°C在含有10 μ g/ ml氯霉素的LB瓊脂板上生長的轉(zhuǎn)化體。將所得的菌落于30°C在含有10 μ g/ml氯霉素的 LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)一夜，從所得的菌體中回收質(zhì)粒。通過測序確認(rèn)對質(zhì)粒的插入序列，確 認(rèn)了作為目標(biāo)的編碼IdhA的基因的5'上游附近片段以及GAPDH啟動子和IdhA基因的起 始密碼子的附近區(qū)域被插入。將該質(zhì)粒命名為pTHGAPldhA。
[0196] 將質(zhì)粒 pTHGAPldhA 轉(zhuǎn)化到 MG1655 Λ pf 1 Λ did Λ mdh Λ asp 株中，在 30°C下在含有 10 μ g/ml氯霉素的LB瓊脂板上培養(yǎng)一夜，得到轉(zhuǎn)化體。將所得的轉(zhuǎn)化體接種到含有10 μ g/ ml氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于30°C培養(yǎng)一夜。接著，將這些菌體涂布到含有10 μ g/ml 氯霉素的LB瓊脂板上，得到在42°C下生長的菌落。將所得的菌落在30°C下在LB液體培養(yǎng) 基中培養(yǎng)一夜，再涂布到LB瓊脂板上，得到在42°C下生長的菌落。
[0197] 從出現(xiàn)的菌落中隨機挑選100個菌落，使其分別在LB瓊脂板和含有10 μ g/ml氯 霉素的LB瓊脂板上生長，選出氯霉素敏感性克隆體。再通過PCR，從這些目標(biāo)克隆體的染色 體DNA，擴增出含有GAPDH啟動子和IdhA基因的約800bp片段，選擇IdhA啟動子區(qū)域被替 換為GAPDH啟動子的株，將滿足以上條件的克隆體命名為MG1655 Λ pfl Λ did Amdh Λ asp/ GAPldhA基因組插入株。
[0198] [實施例1]利用MG1655 Apfl AdldAmdhAasp株/GAPldhA插入株的、在無機鹽 培養(yǎng)基中的D -乳酸生產(chǎn)
[0199] 作為預(yù)培養(yǎng)，向錐形燒瓶中的100ml LB Broth, Miller培養(yǎng)液（Difco244620)中 接種在制造例1中制作的MG1655 Δ pf 1 Δ did Δ mdh Δ asp株/pGAPldhA株，以120rpm攬祥 培養(yǎng)一夜。對加入了 475g由表1的組成形成的無機鹽培養(yǎng)基的IL容量的培養(yǎng)槽（ABLE公 司制培養(yǎng)裝置BMJ - 01)進行高壓釜滅菌，向其中移入預(yù)培養(yǎng)液25ml，進行培養(yǎng)。培養(yǎng)在 大氣壓下，以通氣量〇. 5vvm、攪拌速度300rpm、培養(yǎng)溫度35°C、pH7. 5 (用20wt%氫氧化鈣、 80wt%純水的漿料進行pH調(diào)節(jié)）的條件進行至葡萄糖枯竭。培養(yǎng)結(jié)束后，使用HPLC通過 常規(guī)方法測定所得培養(yǎng)液中的D -乳酸蓄積量（柱：ULTRON PS - 80H(信和化工）、洗脫 液：高氯酸水溶液（pH = 2. 1))。發(fā)酵結(jié)束時間為18小時，D -乳酸蓄積量為92. 7g/L。所 謂發(fā)酵結(jié)束時間，是添加的糖全部被消耗的時間，通過該時長可以評價生產(chǎn)率。
[0200] [表 1]
[0201] 表1:培養(yǎng)基組成
[0202] (g/L)
[0203]

【權(quán)利要求】
1. 一種D -乳酸的生產(chǎn)方法，通過在含有無機電解質(zhì)和碳源、并且滿足選自下述（a)、 (b) 、（c)和（d)中至少一個條件的無機鹽培養(yǎng)基中對生產(chǎn)D-乳酸的大腸桿菌進行培養(yǎng)， 從而生產(chǎn)D -乳酸， (a) 所述無機鹽培養(yǎng)基中，除所述碳源以外的有機物的含量在培養(yǎng)開始時為10g/L以 下， (b) 所述無機鹽培養(yǎng)基中所述無機電解質(zhì)的含量在培養(yǎng)開始時為llg/L以下， (c) 所述無機鹽培養(yǎng)基中硫胺素的含量為0. lmg/L以下， (d) 所述無機鹽培養(yǎng)基中過渡金屬離子的含量為10mg/L以下。
2. 如權(quán)利要求1所述的D -乳酸的生產(chǎn)方法，其中，所述無機鹽培養(yǎng)基至少滿足所述 (c) 或所述（d)中的任一個條件。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的D -乳酸的生產(chǎn)方法，其用于生產(chǎn)作為聚合物原料的D - 乳酸。
4. 如權(quán)利要求1?3中任一項所述的D -乳酸的生產(chǎn)方法，其中，培養(yǎng)開始時的所述無 機鹽培養(yǎng)基進一步滿足下述（e)， (e) 所述無機鹽培養(yǎng)基中所述過渡金屬離子的含量為0. 85mg/L以下。
5. 如權(quán)利要求1?4中任一項所述的D -乳酸的生產(chǎn)方法，其中，所述碳源為糖。
6. 如權(quán)利要求5所述的D-乳酸的生產(chǎn)方法，其中，所述糖包含選自葡萄糖、果糖、木 糖、蔗糖、甘油、阿拉伯糖、蜜二糖、海藻糖、麥芽糖、蜜二糖酸、乳糖、麥芽三糖、核糖、半乳 糖、半乳糖醛酸、葡糖酸、葡糖胺、葡糖醛酸、甘露醇、甘露糖、糖精酸、山梨糖醇、巖藻糖、鼠 李糖、阿洛糖和N -乙酰葡糖胺中的一種以上的化合物。
7. 如權(quán)利要求1?6中任一項所述的D -乳酸的生產(chǎn)方法，其中，所述無機電解質(zhì)包含 選自鉀離子、磷酸根離子、銨離子、硫酸根離子和鎂離子中的一種以上離子作為構(gòu)成成分。
8. 如權(quán)利要求1?7中任一項所述的D -乳酸的生產(chǎn)方法，其中，所述無機電解質(zhì)包含 鉀離子， 在培養(yǎng)開始時的所述無機鹽培養(yǎng)基中，所述鉀離子的濃度為5. 8mmol/L以上、且 73mmol/L 以下。
9. 如權(quán)利要求1?8中任一項所述的D -乳酸的生產(chǎn)方法，其中，所述無機鹽培養(yǎng)基是 將所述無機電解質(zhì)溶解或混懸于水中而制備的液體。
10. 如權(quán)利要求1?9中任一項所述的D -乳酸的生產(chǎn)方法，其中，所述無機鹽培養(yǎng)基 進一步包含甜菜堿。
11. 如權(quán)利要求1?10中任一項所述的D -乳酸的生產(chǎn)方法，其中，所述生產(chǎn)D -乳酸 的大腸桿菌為重組大腸桿菌。
12. 如權(quán)利要求1?11中任一項所述的D -乳酸的生產(chǎn)方法，其包括以下工序： 在所述無機鹽培養(yǎng)基中使所述生產(chǎn)D -乳酸的大腸桿菌與所述碳源接觸，得到D -乳 酸鹽的工序；和 從含有所述D -乳酸鹽的所述無機鹽培養(yǎng)基中除去所述生產(chǎn)D -乳酸的大腸桿菌后， 將所述D -乳酸鹽脫鹽，得到D -乳酸的工序。
13. 如權(quán)利要求12所述的D -乳酸的生產(chǎn)方法，其中，在得到所述D -乳酸鹽的所述工 序中，得到D -乳酸的堿土金屬鹽， 在得到所述D -乳酸的所述工序中，通過將D -乳酸的所述堿土金屬鹽脫鹽，使含有堿 土金屬的無機鹽析出。
14. 如權(quán)利要求12所述的D -乳酸的生產(chǎn)方法，其中，在得到所述D -乳酸鹽的所述工 序中，得到D -乳酸的堿金屬鹽， 在得到所述D -乳酸的所述工序中，通過電解透析處理將D -乳酸的所述堿土金屬鹽 脫鹽。
15. 如權(quán)利要求12?14中任一項所述的D -乳酸的生產(chǎn)方法，其進一步包括在將所述 D -乳酸鹽脫鹽得到D -乳酸的所述工序后，進行所述D -乳酸純化的純化工序， 在所述純化工序中，一邊水解一邊進行蒸餾。
16. -種聚合物的生產(chǎn)方法，使用通過權(quán)利要求1?15中任一項所述的D -乳酸的生 產(chǎn)方法得到的D -乳酸進行聚合反應(yīng)。
17. -種聚合物，是通過權(quán)利要求16所述的聚合物的生產(chǎn)方法得到的。
【文檔編號】C12P7/56GK104487584SQ201380038822
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2013年7月23日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月23日
【發(fā)明者】宮澤大輔, 酒井智美, 高橋均, 大垣弘毅 申請人:三井化學(xué)株式會社