使用馬鈴薯糖蛋白的方法
【專利摘要】馬鈴薯糖蛋白，一種能夠從馬鈴薯中獲得的脂肪酶，被發(fā)現(xiàn)具有對于C4至C8脂肪酸的特異選擇性，同樣對存在于三酸甘油酯中的C4至C8脂肪酸也具有特異選擇性。這使得馬鈴薯糖蛋白尤其適用于水解諸如存在于乳脂中的三酸甘油酯，以增強食品的風味。具體地，發(fā)現(xiàn)馬鈴薯糖蛋白有益于增強奶酪的風味。描述了一種應用脂肪酶的水解活性的方法以及馬鈴薯糖蛋白在制造奶酪的方法中的應用。
【專利說明】使用馬鈴薯糖蛋白的方法

【背景技術】
[0001] 在食品的生產(chǎn)中，脂質(zhì)和其它酯類的分解對于風味、結構、紋理或純度是重要的。 被稱為水解的過程產(chǎn)生自由脂肪酸，其中，該自由脂肪酸是風味（即味覺和嗅覺的組合）的 重要因素。具體地，在乳脂中以相對大量存在的短鏈脂肪酸和中鏈脂肪酸是食物的風味的 強力因素。
[0002] 盡管利用強堿或酸能夠化學地水解酯類，這些程序是粗糙且非特異性的，從而導 致產(chǎn)率的損失、不需要的副產(chǎn)物和浪費。酶水解通常更具有特異性，避免了這些問題的至少 一部分。脂肪酶是表面酶，其通常根據(jù)脂肪酸鏈長或脂肪酸鏈位置來選擇用于具體脂質(zhì)的 水解。該特異性決定了對于任何給定的應用，特異性脂肪酶的合適程度。
[0003] 脂肪酶的使用在工業(yè)中是常見的。實例包括外消旋藥物拆分、脂肪和脂質(zhì)改性、風 味合成以及藥物制品和營養(yǎng)制品的生產(chǎn)。目前，盡管在一些應用中也使用動物源脂肪酶，但 是使用中的絕大多數(shù)的脂肪酶是利用真菌或細菌發(fā)酵體系來獲得的。植物源脂肪酶對于工 業(yè)應用是相對稀少的。
[0004] 工業(yè)最適用的脂肪酶是通過細菌發(fā)酵而獲得的，并且需要復雜的下游處理。這樣 的脂肪酶傾向于在總基底和蛋白基底中具有低純度，并且因此含有大量的糖類、鹽并且可 能的不需要的副活性。此外，商購脂肪酶制劑通常含有多種非蛋白材料、鹽和非脂肪酶的酶 (Bjurlin等人 2001JAOCS78-2p153-160)。
[0005] 脂肪酶用于在諸如奶酪的食品中產(chǎn)生風味是相當常見的，并且已經(jīng)報告了多種不 同的脂肪酶。傳統(tǒng)上，來自小牛或豬的消化酶（也被稱為凝乳酶）將被加入到奶酪中，這是 由于凝乳酶能夠引起奶的凝結，并且由于凝乳酶引起自由脂肪酸的產(chǎn)生，而自由脂肪酸賦 予奶酪以風味。該過程涉及需要死亡小?；蜇i的昂貴的酶分離，這是繁瑣的且不適用于素 食者。此外，其引入了疾病轉移的可能性。
[0006] 通常，奶酪是通過奶的凝結來制得的，例如，通過加入凝乳酶和/或酸。經(jīng)過凝結， 奶分離成凝乳和乳清。丟棄乳清，該乳清為奶蛋白的水溶液，同時收集凝乳并且輕輕擠壓以 去除一些殘余的水。盡管如此，所得到的凝乳含有大約30%的水，并且應當被認為是奶脂、 蛋白和水的膠體分散液。將合適的酶加入到奶或凝乳中（例如，以凝乳酶的形式）。對于大 多數(shù)的奶酪，凝乳隨后進行熟化。
[0007] 在制造奶酪中，酶的作用是尤其通過酶解、蛋白水解和脂類分解來啟動奶成分的 主降解途徑。其涉及能夠產(chǎn)生奶酪風味的一些化合物，諸如例如氨基酸，某些肽、酯、醛、酮、 酚和脂肪酸。在脂肪酸的組中，尤其是短鏈脂肪酸和中鏈脂肪酸用于純粹風味的產(chǎn)生，而較 長鏈脂肪酸導致肥膩且不愉快的口感。不同的脂肪酸傳遞給奶酪不同類型的口感。例如， C4脂肪酸在牛奶的奶酪中存在量較高，而(：6脂肪酸在山羊奶酪中是常見的。然而，目前所 使用的脂肪酶對釋放所需的風味成分以及避免不良的肥膩風味顯示出較小選擇性或沒有 選擇性。
[0008] 目前，微生物脂肪酶對于奶酪制造是優(yōu)選的，并且通常，該應用是由轉基因的細菌 來構成以得到一種特異性類型的脂肪酶。這種脂肪酶需要復雜且昂貴的分離方法，并且因 為反應通過需要持續(xù)太長的時間，可能導致最終產(chǎn)品的酸敗。
[0009] 從馬鈴薯中能夠得到植物源脂肪酶。馬鈴薯蛋白能夠被分成三種類別：（i)馬 鈴薯糖蛋白家族，高度同源的酸性43kDa糖蛋白（高分子量部分"HMW"，含有高達40? 50wt. %的馬鈴薯蛋白）；（ii)基本5?25kDa蛋白酶抑制劑（"PI"，30-40wt. %的馬鈴薯 蛋白）以及（iii)其它蛋白，大多是高分子量蛋白（10?20wt. %的馬鈴薯蛋白）。已知的 是，馬鈴薯糖蛋白家族具有一些脂肪酶活性，并且能夠經(jīng)由一步色譜過程，隨后通過濃縮和 干燥來得到。在申請W02008/069650中描述了尤其用于分離高純度的馬鈴薯糖蛋白的高度 便捷的方法。
[0010] 在實際中，由于包括脂肪酶的馬鈴薯蛋白缺乏實際的商業(yè)用途，其主要用作動物 的原料。通常，即使馬鈴薯糖蛋白尤其對于磷脂質(zhì)和單甘脂具有酯酶活性，但是由于馬鈴 薯糖蛋白對于三酸甘油酯是不活躍的，所以馬鈴薯糖蛋白的實際用途被認為是受限的（例 如參見Hirschberg等人，Eur.J.Biochem2001，268, 5037,Galliard等人·，Biochem. J. 1971，121，379 或Andrews等人，BiochemJ. 1988, 252, 199)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明提供了一種在水相中利用馬鈴薯糖蛋白來水解特定類型的脂質(zhì)的手段。已 經(jīng)發(fā)現(xiàn)馬鈴薯糖蛋白能夠從三酸甘油酯水解出C4至C8脂肪酸。然而，馬鈴薯糖蛋白將不會 或基本上不會水解鏈長度較長的甘油脂肪酸酯。因此，尤其是在水性環(huán)境中，馬鈴薯糖蛋白 對于短鏈脂肪酸和中鏈脂肪酸顯示出了令人驚奇的選擇性。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，該選擇性允許在制 造奶酪中的高的實際價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 圖1 :測試小組的百分比，該測試小組用于記錄在凝結前，奶中所示出的馬鈴薯糖 蛋白的濃度下，經(jīng)馬鈴薯糖蛋白處理的奶酪與對照奶酪之間的差異。
[0013] 圖2 :經(jīng)由標記方法測定馬鈴薯糖蛋白在凝乳和乳清中的分布。A:凝結之前的奶。 B:凝結之后的奶。C:凝結之前，含2g/L未標記的馬鈴薯糖蛋白的奶。D:凝結之后，含2g/L 未標記的馬鈴薯糖蛋白的奶。E:凝結之前，含2g/L考馬斯R-250-標記的馬鈴薯糖蛋白的 奶。F:凝結之后，含2g/L考馬斯R-250-標記的馬鈴薯糖蛋白的奶。G:凝結之前，含2g/L 考馬斯G250-標記的馬鈴薯糖蛋白的奶。H:凝結之后，含2g/L考馬斯G-250-標記的馬鈴 薯糖蛋白的奶。
[0014] 圖3 :在不同馬鈴薯糖蛋白劑量下，在凝乳酶-凝結后，乳清中回收的脂肪酶的活 性。
[0015] 圖4 :在馬鈴薯糖蛋白劑量和感官特性之間的劑量-響應關系。
[0016] 圖5 :馬鈴薯糖蛋白優(yōu)先使奶酪脂肪朝向脂肪酸水解。
[0017] 圖6 :在6周（6a)后和在13周（6b)后，在FFA源的揮發(fā)性奶酪風味化合物的增 加。
[0018] 圖7 :兩年間在HMW馬鈴薯蛋白粉末中的脂肪酶活性。

【具體實施方式】
[0019] 在本發(fā)明的范圍中，馬鈴薯糖蛋白（patatin)應當被理解為表示天然馬鈴薯蛋白 分離物的高分子量（HMW)部分，具有30kDa或更高，尤其是35kDa或更高，并且更優(yōu)選約 43kDa的分子量以及等電點小于5. 8,優(yōu)選在4. 8和5. 5之間的糖蛋白的高度同源家族，其 構成約40?50wt. %的馬鈴薯蛋白。馬鈴薯糖蛋白是顯示出酰基-水解酶反應性并且在馬 鈴薯塊莖中占有高達總可溶蛋白的40wt%的糖蛋白的家族。在申請WO2008/069650中記 載了從馬鈴薯果實汁液（PFJ)或馬鈴薯汁（PFW)中分離馬鈴薯糖蛋白的詳細說明，該申請 通過引用而并入本文。
[0020] WO2008/069650的方法需要在pH7?9下，通過二價金屬陽離子處理馬鈴薯果實 汁液以使其絮凝，并且離心該絮凝的馬鈴薯果實汁液，從而形成上清液。隨后，對上清液進 行利用能夠結合馬鈴薯蛋白的吸附劑且在5?35°C的溫度下以及低于11的pH下操作的膨 脹床吸附層析，從而將天然馬鈴薯蛋白吸附至吸附劑。最后，用洗脫劑，從吸附劑中洗脫出 至少一種天然馬鈴薯蛋白分離物。該方法尤其導致高純度的分離的天然馬鈴薯糖蛋白，其 具有最小量的變性蛋白存在，并且具有穩(wěn)定的溶解性的特征。
[0021] 馬鈴薯果實汁液在pH7?9,優(yōu)選7. 0?7. 5下，用二價金屬陽離子進行預處理以 絮凝不需要的材料，隨后通過離心來分離絮凝物。尤其合適的二價金屬陽離子為Ca2+。該 預處理從馬鈴薯果實汁液去除了不需要的材料，諸如帶負電荷的聚合物、果膠、配糖生物堿 和微生物。具體地，果膠和配糖生物堿的去除是有利的，這是因為這些化合物粘附至馬鈴薯 蛋白并且可能引起絮凝，從而導致在溶解性和其它物理性質(zhì)方面不穩(wěn)定的蛋白分離物。
[0022] 在該方法的第二步驟中，對上清液進行膨脹床吸附層析。有利地，保持起始材料的 溫度在35°C以下，以得到馬鈴薯糖蛋白的更好的穩(wěn)定性。此外，優(yōu)選地，使用適度的高流速， 通常在600?1200cm/h的范圍內(nèi)。膨脹床吸附層析在小于11的pH下，優(yōu)選小于10的pH 下操作。
[0023] 在膨脹床吸附柱中，通過將預處理的馬鈴薯果實汁液中的天然馬鈴薯蛋白結合至 合適的吸附劑上而將其從上清液中分離出來。結合特定量的天然馬鈴薯蛋白的柱材料包括 混合式吸附材料，諸如AmershamStreamline?DirectCSTI(GE醫(yī)療），F(xiàn)astline吸附材 料（Upfront色層分析A/S);大孔吸附材料，諸如安伯萊特（Amberlite) ?XAD7HP( &Haas公司）以及離子交換吸附劑。隨后用合適的洗脫液洗脫帶有吸附天然馬鈴薯蛋白的 吸附劑，從而得到天然馬鈴薯蛋白分離物，諸如馬鈴薯糖蛋白。優(yōu)選地，洗脫劑具有在4至 12范圍內(nèi)，更優(yōu)選在5. 5至11.0范圍內(nèi)的pH。
[0024] 在優(yōu)選的實施方式中，利用混合式吸附材料，蛋白能夠以等電點和分子量被分餾。 這就允許例如馬鈴薯糖蛋白部分和蛋白酶抑制劑部分的分離。在5. 7至8. 7的pH，優(yōu)選5. 8 至6. 5的pH下洗脫馬鈴薯糖蛋白分離物。
[0025] ?；?水解酶反應性通常被理解為（一類）酶通過水分子催化酯鍵水解以形成組 成的羧酸和醇的能力。通過適當?shù)馗淖兎磻獥l件該反應有時是可逆的，在那種情況下，發(fā)生 羧酸和醇的酯化反應?？赡苡绊懛磻较虻姆磻獥l件包括例如溫度、反應物恒等式，和/或 存在的水、羧酸和醇的量。本發(fā)明公開了馬鈴薯糖蛋白具有高度選擇?；?水解酶反應性， 其使得馬鈴薯糖蛋白高度適用于奶酪制造。
[0026] 馬鈴薯糖蛋白的水解酶活性尤其涉及在脂質(zhì)，尤其是單?；视王?、雙?；视?酯和三?；视王ブ邪l(fā)現(xiàn)的?；?。已知的是，馬鈴薯糖蛋白的水解酶活性對于單?；?油酯較強。然而，還報道了，發(fā)現(xiàn)對于三酸甘油酯沒有這種活性（例如參見Hirschberg等 人，Eur.J.Biochem2001，268, 5037,Galliard等人·，Biochem.J. 1971，121，379 或Andrews 等人，BiochemJ. 1988, 252, 199)。根據(jù)本發(fā)明，驚奇地發(fā)現(xiàn)，盡管存在這些報道，但是事實 上，馬鈴薯糖蛋白存在三酸甘油酯水解酶活性，并且該活性對于C4至C8脂肪酸非常具有特 異性。
[0027] 脂肪酸是特征如下的一類化合物：在另一直鏈碳鏈上存在1-位的羧酸基團。碳鏈 的長度是脂肪酸的重要特性，從而具有10個連續(xù)直鏈碳原子的碳鏈的脂肪酸也被稱為Cki 脂肪酸。通常，已知的脂肪酸為C4至C36脂肪酸。碳鏈可為飽和的，也可包括一個或多個雙 鍵。
[0028] 傳統(tǒng)上，利用不同的方法脂肪酸被分為幾個組。一種方法是根據(jù)它們的飽和度來 對其進行分類。然后，一組的脂肪酸被定義為飽和脂肪酸，在它們的碳鏈中的任意兩個碳原 子之間不具有雙鍵。
[0029] 不飽和脂肪酸在碳鏈中具有一個或多個雙鍵。在不飽和脂肪酸中，在碳鏈中存 在有一個雙鍵的單不飽和脂肪酸（MUFA)以及在碳鏈中存在多個雙鍵的多不飽和脂肪酸 (PUFA)。
[0030] 也可根據(jù)脂肪酸的碳鏈長度來對脂肪酸進行分類。因此，存在短鏈脂肪酸（SCFA)， 其具有小于6個碳原子的碳鏈。中鏈脂肪酸（MCFA)具有6至12個碳原子的碳鏈，以及長 鏈脂肪酸（LCFA)具有13至21個碳原子的碳鏈。非常長鏈脂肪酸（VLCFA)具有大于22個 碳原子的碳鏈。當根據(jù)鏈長分類脂肪酸時，碳鏈可為飽和的或單不飽和的或多不飽和的。
[0031] 脂肪酸存在于所有的生物體中，并且具有幾種功能。通常，這些功能通過整合至大 分子一種或多種脂肪酸來表現(xiàn)。因此，脂肪酸可連接至糖、氨基酸或甘油衍生物，并且具有 從能量儲存至細胞結構以及更多的功能。
[0032] 在本發(fā)明的范圍中，脂質(zhì)是任何這樣的化合物：其中脂肪酸通過酯鍵聯(lián)接至甘油 的羥基上。單酰基甘油酯（MG或單酸甘油酯）是甘油與一個脂肪酸的酯并且具有兩個自 由羥基。雙?；视王ィ―AG或雙酸甘油酯）是甘油與兩個脂肪酸的酯并且具有一個自由 羥基。三?；视王ィ═AG或三酸甘油酯）是甘油與三個脂肪酸的酯。通俗地，三酰基甘油 酯也被稱為"脂肪"，油也被稱為脂肪，但是"脂肪"通常用于表示固體或半固體的三酸甘油 酯，而"油"用于表示液體或粘性三酸甘油酯。
[0033] 存在有許多不同脂肪酸，并且各種脂肪酸的相對豐度在同一物種中接近恒定。各 種脂肪酸在三酸甘油酯中的分布幾乎是隨機的。因此，三酸甘油酯通常包括三種不同的脂 肪酸，但是發(fā)現(xiàn)具有兩個相同脂肪酸的三酸甘油酯的統(tǒng)計學機會是不可忽視的。此外，自然 存在具有三個相同脂肪酸單元的三酸甘油酯。一個實例是三丁酸甘油酯（在單個甘油骨架 上有三個C4脂肪酸），已知其存在于黃油中。
[0034] 上述的所有的甘油和一種或多種脂肪酸的酯可被稱為"脂質(zhì)"。然而，脂質(zhì)還包括 MG和DAG，其中MG-甘油或DAG-甘油的自由羥基被聯(lián)接到另一基團，諸如磷酸酯基。兩 個脂肪酸和磷酸基被聯(lián)接到單個甘油分子的分子被稱作磷脂質(zhì)，而僅一個脂肪酸被聯(lián)接到 甘油，剩余自由羥基的分子被稱作溶血磷脂質(zhì)。磷脂質(zhì)或溶血磷脂質(zhì)在磷酸酯基上可具有 其它取代基。例如，磷酸酯基被膽堿進一步官能化的磷脂質(zhì)或溶血磷脂質(zhì)被稱為磷脂酰膽 堿，并且因此，其為一類磷脂，并且也是一類脂質(zhì)。
[0035] 通俗地講，術語脂質(zhì)進一步包括這樣的化合物：在該化合物中，一個或多個脂肪酸 通過酯鍵聯(lián)接到糖，諸如單糖、二糖或多糖。在這種情況下，也被稱為脂肪酸糖酯或糖脂。另 夕卜，脂質(zhì)可包括脂肪酸的其它酯，諸如留醇酯。然而，在本發(fā)明的范圍中，術語脂質(zhì)被限制為 甘油的脂肪酸酯；這些脂肪酸與糖或留醇的其它酯并不認為是脂質(zhì)的組中的一部分。
[0036] 脂質(zhì)通常被分為兩個組：極性脂質(zhì)和中性脂質(zhì)。極性脂質(zhì)溶解在水中以形成例如 膠體或雙分子層，而中性油脂顯示出非常低的水溶解度。磷脂質(zhì)被認為是極性脂質(zhì)，并且通 常具有5和10之間的辛醇-水系數(shù)（LogP)。中性脂質(zhì)具有低的水溶解度，并且通常具有 高于10的LogP。然而，確實存在具有較低辛醇-水系數(shù)的三酸甘油酯，諸如例如三乙酸甘 油酯（LogP= 0· 25)、三丁酸甘油酯（C4,LogP= 3. 27)、三己酸甘油酯（C6,LogP= 5. 6)、三 辛酸甘油酯（C8,LogP= 9. 2)，三癸酸甘油酯（Cltl)具有LogP= 10. 9。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯糖 蛋白在相對極性的三酸甘油酯（即，那些具有低于10的LogP)的水解中是有效的（參見下 文）。
[0037] 在本發(fā)明的范圍中，術語三酸甘油酯包括單甘酯、雙苷酯和三酸甘油酯。由于單苷 酯和雙苷酯天然中基本上并不存在，而是通過三酸甘油酯的水解而形成，中性脂質(zhì)的分解 總是開始于三酸甘油酯的分解。因此，在中性脂質(zhì)水解的過程中，當發(fā)生三酸甘油酯水解時 是有利的。
[0038] 存在幾種類型的混合物。在本發(fā)明的上下文中，重要的混合物類型是：
[0039] ?溶液
[0040] ?膠體分散液
[0041] ?乳液
[0042] ?懸浮液。
[0043] 丁鐸爾效應是光通過大于所用光的波長的顆粒的彈性散射。如本領域所已知的， 其最常見于膠體分散液和懸浮液中，并且可被用于確定在這些介質(zhì)中的粒徑。
[0044] 在本文中所使用的體系可為任何液體環(huán)境或半液體環(huán)境,其將允許通過反應物的 分散來發(fā)生化學反應，從而它們能夠"找到彼此"并且互相作用。其可采用均質(zhì)溶液、懸浮 液、油包水乳液或水包油乳液，以及膠體分散液的形式，或液體形式或高度粘性透明固體的 形式。
[0045] 溶液是通過混合溶質(zhì)和溶劑而形成的混合物。溶質(zhì)為被溶解的物質(zhì)。溶劑為進行 該溶解的物質(zhì)。溶液是均質(zhì)的并且并不顯示出丁鐸爾效應。
[0046] 膠體分散液是這樣的混合物：在該混合物中，存在有兩個或更多個不混溶的相，從 而一個相（被分布相或內(nèi)部相）被分布在另一相（連續(xù)相）內(nèi)。也可存在額外的不混溶 相。除了氣體-氣體分散體系并不存在之外，內(nèi)部相可為液體、固體或氣體，并且類似地，連 續(xù)相可為液體、固體或氣體。膠體分散液似乎是均質(zhì)的，但是實際上是異質(zhì)的。然而，一種 或多種內(nèi)部相被均質(zhì)地分布在連續(xù)相中。在本發(fā)明的范圍中的特征在于：當長時間靜置時， 只要組成未發(fā)生化學改變，膠體分散液并不沉淀。凝乳和奶是膠體分散液的實例。膠體分 散液確實顯示出了 丁鐸爾效應。
[0047] 乳液是至少兩種不混溶液體的異質(zhì)混合物。由于液體分布相被分布在液體連續(xù)相 中，乳液也享有膠體分散液的該特征。然而，在本發(fā)明的范圍中，當乳液被靜置足夠長的時 間時，乳液將沉淀出其構成相。因此，乳液與膠體分散液的區(qū)別在于：其在一定時間內(nèi)保持 穩(wěn)定體系，其中一個相被均質(zhì)地分布在另一個相中。
[0048] 通常，將防止乳液分層的某一形式的穩(wěn)定劑加入到乳液。然而，如果沒有這種穩(wěn)定 化作用，該體系將在一定時間內(nèi)分成兩層，至少直至發(fā)生分層時這樣的體系被認為是乳液。 乳液顯示出丁鐸爾效應。
[0049] 懸浮液是固體和液體的異質(zhì)混合物，其中，固體并未溶解。因此，它們包括至少兩 相，其中，一個相均質(zhì)地分布在另一個相中，并且享有膠體分散液的該特征。在本發(fā)明的術 語中，懸浮液具有大于固體-液體膠體分散液的顆粒，并且當靜置時發(fā)生沉淀。懸浮液顯示 丁鐸爾效應。
[0050] 該發(fā)明公開了一種用于從三酸甘油酯水解脂肪酸的方法，該三酸甘油酯含有至少 一種C4至C8脂肪酸，該方法包括在水的存在下，對該三酸甘油酯遭遇馬鈴薯糖蛋白，其中， 該馬鈴薯糖蛋白水解C4至C8脂肪酸，或催化C4至C8脂肪酸的水解。
[0051] 在包括不同脂肪酸的三酸甘油酯混合物中，選擇性地發(fā)生水解。這被解釋為基本 上僅C4至C8脂肪酸從甘油骨架中水解出來。因此，馬鈴薯糖蛋白有助于C4至C8脂肪酸和 甘油骨架之間的酯鍵的分解。在馬鈴薯糖蛋白的存在下，具有更短或更長碳鏈的脂肪酸基 本上不水解，并且維持附接到甘油骨架。優(yōu)選地，C4和C6脂肪酸被水解，并且尤其是在制造 牛奶奶酪，最優(yōu)選的是僅水解C4脂肪酸；或尤其是在制造山羊奶酪中，僅水解C6脂肪酸。
[0052] 脂肪酸定位在甘油骨架上的位置并沒有影響。外部脂肪酸位置（sn(l)和（sn(3)) 一定程度更有效地被水解，但是定位在中心位置（sn(2))的脂肪酸也可被水解。因此，在優(yōu) 選的實施方式中，甘油骨架的外部位置優(yōu)先在中心位置被水解。
[0053] 脂肪酸的飽和度并不相關，并且利用本發(fā)明能夠水解飽和的C4至C8脂肪酸和不飽 和的C4至C8脂肪酸。然而，不飽和C4至C8脂肪酸是罕見的，從而優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明水解 飽和的C4至C8脂肪酸。
[0054] 因此，根據(jù)本發(fā)明，水解導致自由的C4至C8脂肪酸和雙甘酯。隨后，繼續(xù)進行水解 以形成更多的自由脂肪酸和單甘酯和甘油。根據(jù)本發(fā)明，C4至C8脂肪酸的水解在水解完成 前的任何合適的時間處可被停止。
[0055] 在另一優(yōu)選的實施方式中，三酸甘油酯的選擇性水解僅限于在其甘油骨架上僅具 有C4至C8脂肪酸的那些三酸甘油酯。優(yōu)選地，在這種情況下，在甘油骨架的外部位置處的 脂肪酸被選擇性地水解。在進一步優(yōu)選的實施方式中，用于水解的脂肪酸為C4脂肪酸和C6 脂肪酸，并且最優(yōu)選，尤其是在制造牛奶奶酪中僅(；脂肪酸被水解；或尤其在制造山羊奶酪 中，僅C6脂肪酸被水解。
[0056] 根據(jù)本發(fā)明，待被水解的三酸甘油酯的水溶性最好用辛醇-水分配系數(shù)IogP來描 述。根據(jù)本發(fā)明的方法，待被水解的三酸甘油酯的LogP等于或低于10,優(yōu)選地，低于9. 2， 優(yōu)選地，低于6. 3。甚至更優(yōu)選地，IogP應當在0.25至6. 3的范圍內(nèi)，并且甚至更優(yōu)選地， 在3. 27至6. 3的范圍內(nèi)。在本發(fā)明的范圍下，IogP被定義為在25°C下三酸甘油酯在辛醇 和去礦質(zhì)水之間的分配系數(shù)，其可由本領域技術人員常規(guī)測定，例如利用燒瓶震蕩法。
[0057] 天然脂肪或天然油主要由三酸甘油酯組成，該三酸甘油酯具有廣泛的各種鏈長的 不同的脂肪酸。然而，天然脂肪或天然油可含有雜質(zhì)，諸如雙酸甘油酯，其通過三酸甘油酯 的水解而形成。天然脂肪和油中存在的各種脂肪酸可具有4至28個碳原子的碳鏈。根據(jù) deJong和Badings, 1990,JHighResolutionChrom. 13:94-98,利用任何方法，諸如例如 通過GC-類方法可確定具體類型脂肪的脂肪酸譜圖。優(yōu)選地，該方法涉及天然脂肪或天然 油的水解。
[0058] 本發(fā)明所使用的馬鈴葉糖蛋白源自于馬鈴葉前科前屬（Solanumtuberosum)。優(yōu) 選地，在淀粉研磨后得到的馬鈴薯汁液中分離出馬鈴薯糖蛋白。馬鈴薯汁液來自于用于工 業(yè)淀粉生產(chǎn)或直接人類消耗或飼料的所有類型的馬鈴薯品種。優(yōu)選地，馬鈴薯糖蛋白從馬 鈴薯汁液中分離出來，并且優(yōu)選地，其也被純化，諸如來自于其它馬鈴薯蛋白和雜質(zhì)。此外， 對根據(jù)本發(fā)明的方法優(yōu)選的是利用天然形式的馬鈴薯糖蛋白，即，未變性的馬鈴薯糖蛋白。 最優(yōu)選地，使用在水相中自由溶解或分散的天然馬鈴薯糖蛋白。
[0059] 在任何溶劑或沒有溶劑下，只要存在足夠的水以允許進行水解，即可完成根據(jù)本 發(fā)明的酯的水解。本發(fā)明的重要方面是，盡管多數(shù)的脂肪酶在親水區(qū)和疏水區(qū)之間的界面 上起作用，但是馬鈴薯糖蛋白最好在水相中起作用。因此，本發(fā)明的方法適用于在水的存在 下，優(yōu)選在水相中，用馬鈴薯糖蛋白使三酸甘油酯水解。優(yōu)選地，這種水相被包括在更疏水 的相中，諸如乳液或膠體分散液中，以允許疏水相中非極性三酸甘油酯和水相中馬鈴薯糖 蛋白之間的充分接觸。此外，水相可為多相體系中的連續(xù)相。至今為止，已經(jīng)證實了的馬鈴 薯糖蛋白的實際應用包括水溶液、懸浮液或乳液，其中，是否是油包水乳液或水包油乳液并 不是重要的。然而，最優(yōu)選地，馬鈴薯糖蛋白被用在膠體分散液或乳液中從三酸甘油酯中水 解一種或多種脂肪酸的方法中。在使用乳液的情況下，優(yōu)選為油包水乳液。
[0060] 在本發(fā)明中，首要條件是存在足夠的水以允許在任何體系中使C4至C8脂肪酸水解 離開三酸甘油脂的甘油骨架。就該點而言，足夠的水意味著：以總體系的百分比來計，水含 量至少為1體積％，優(yōu)選為至少5體積％，更優(yōu)選至少10體積％，更優(yōu)選至少15體積％，更 優(yōu)選至少20體積％，并且最優(yōu)選至少25體積％。
[0061] 優(yōu)選地，適用于水解一種或多種C4至C8脂肪酸的溫度為在該溫度下，馬鈴薯糖蛋 白是活化的，諸如，4°C至80°C，優(yōu)選為KTC至65°C。對于慢反應速率產(chǎn)生最好結果的過程， 諸如，奶酪制造來說，最好使用11°C至23°C，優(yōu)選13°C的溫度。對于需要較高反應速率的過 程，最好使用剛剛低于變性條件的溫度，例如諸如50°C至65°C。
[0062] 類似地，應當使用在該pH下馬鈴薯糖蛋白是活化的pH，進行C4至C8脂肪酸的水解 的合適的pH值為在4. 5和9之間，優(yōu)選為8. 5。對于奶酪的制造，使用的最佳的pH在4. 8 和6. 7之間。
[0063] 在本發(fā)明的一個更優(yōu)選的實施方式中，發(fā)生C4至C8脂肪酸水解的乳液或膠體分散 液包括乳脂。乳脂天然地富含短鏈三酸甘油酯和中鏈三酸甘油酯，為此原因，馬鈴薯糖蛋白 高度適用于奶的選擇性水解。因此，乳液或膠體分散液優(yōu)選地包括奶。
[0064] 含有包括(；至(：8脂肪酸的三酸甘油酯的任何類型的奶能夠被馬鈴薯糖蛋白水解。 因此，任何哺乳動物的奶是合適的，包括奶牛、綿羊、山羊、驢、馬、水牛、牦牛、馴鹿、駱駝和 駝鹿。然而，優(yōu)選地，奶牛、綿羊或山羊的奶，尤其是奶牛的奶與馬鈴薯糖蛋白組合使用。 [0065] 在替代優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的乳液或膠體分散液是凝乳。凝乳是由奶得到 的膠體分散液，包括三酸甘油酯、馬鈴薯糖蛋白和約30%的水。三酸甘油酯包括相對高豐度 的C4至C8脂肪酸，這使得它們高度適用于通過馬鈴薯糖蛋白來選擇性水解。凝乳采用各種 類固體塊的形式。此外，其用于制造奶酪。
[0066] 通過將馬鈴薯糖蛋白加入到在食品生產(chǎn)過程中使用的乳液或膠體分散液中（諸 如優(yōu)選奶或凝乳）以水解C4至C8脂肪酸，與使用其它脂肪酶相比，短鏈脂肪酸風味成分和 中鏈脂肪酸風味成分以較高的速率從甘油骨架中釋放出來。就該點而言，風味是味覺和嗅 覺的組合。其允許了使用馬鈴薯糖蛋白以增強食品的風味。根據(jù)該實施方式，水解在這樣 的體系中進行：該體系為食品的起始材料或起始材料的一部分。優(yōu)選地，該食品為奶酪，更 優(yōu)選地，為意大利式奶酪、藍奶酪或酶改性奶酪。在該優(yōu)選的實施方式中，例如，水解在用于 制造奶酪的奶中進行，并且因此形成制備該食品，即奶酪的方法的一部分。
[0067] 與使用其它脂肪酶（諸如微生物脂肪酶或凝乳酶）相比，在奶酪制造過程中使用 馬鈴薯糖蛋白具有相當?shù)膬?yōu)勢。對于C4至C8脂肪酸的特異性導致加速的奶酪生產(chǎn)過程，和 /或?qū)е戮哂性鰪婏L味的奶酪。為此，加入馬鈴薯糖蛋白的凝乳或奶能夠便利地用于奶酪制 造中。
[0068] 當馬鈴薯糖蛋白被用在制造奶酪的方法中時，其可被加入在制造奶酪的任何相或 所有相中。其可被直接加入到凝乳中，但是優(yōu)選地，馬鈴薯糖蛋白被加入到凝結之前的奶 中。在凝結過程中，其將主要分出凝乳。所得到的凝乳含有約30%的水，并且應當被認為是 乳脂、馬鈴薯糖蛋白和水的膠體分散液。與利用其他源的酶相比，利用馬鈴薯糖蛋白的優(yōu)點 在于，馬鈴薯糖蛋白具有從乳脂三酸甘油酯中釋放C4至C8脂肪酸的高選擇性，增加了奶酪 熟化的速度，并且增加風味的發(fā)展，從而增強了風味。同時，防止了賦予奶酪肥膩口感的較 長鏈長的脂肪酸的水解，因為馬鈴薯糖蛋白對此類底物沒有反應性。此外，馬鈴薯糖蛋白選 擇性地水解釋放風味的脂肪酸而不水解甘油的其它脂肪酸酯，從而防止由于過度大量水解 而引起酸敗的失控反應。最后，與許多微生物脂酶相比，馬鈴薯糖蛋白很容易去活化。
[0069] 將溫度升高至普通巴氏滅菌法溫度，諸如例如，在50°C和80°C之間，優(yōu)選70°C至 75°C并且更優(yōu)選75°C，基本不減除馬鈴薯糖蛋白的活性。在75°C，在至多IOs內(nèi)觀察到活 性降低90%，而在70°C，在17s內(nèi)觀察到活性降低90%。觀察到了pH依賴性，導致在較低 pH下具有較長的去活化時間，然而，在pH6. 7時，馬鈴薯糖蛋白的活性在75°C下，在8. 2s 內(nèi)降低至90%。
[0070] 馬鈴薯糖蛋白可與其它酶，諸如例如天然凝乳酶或微生物凝乳酶組合使用，從而 增加奶酪的熟化速度以及賦予增加的風味發(fā)展。馬鈴薯糖蛋白可與任何類型的奶凝結物組 合物使用。因此，通過加入馬鈴薯糖蛋白，有益于通過凝乳酶或通過微生物凝結的酶促凝乳 的奶酪。此外，由于馬鈴薯糖蛋白特異性水解性質(zhì)，所以加入的馬鈴薯糖蛋白有益于酸凝乳 的奶酪以及乳清奶酪。
[0071] 因此，本發(fā)明公開了一種生產(chǎn)奶酪的方法，包括使用馬鈴薯糖蛋白。該方法包括以 下步驟：
[0072] ?使奶凝結以得到凝乳；
[0073] ?浙干（drain)凝乳；以及
[0074] ?形成新鮮奶酪，可選地，隨后進行熟化步驟；
[0075] 其中，如上所述，將馬鈴薯糖蛋白加入到奶或加入到凝乳中以水解一種C4至C 8脂 肪酸。
[0076] 如本領域所已知的，通過加入酸和/或凝乳酶能夠完成奶的凝結。優(yōu)選地，上述奶 為奶酪奶，其為用于具體類型的奶酪已經(jīng)標準化和/或經(jīng)過巴氏消毒的奶。如上所述，可使 用任何的奶。
[0077] 凝結引起凝乳的形成。同時，形成可溶的奶蛋白的水溶液，也被稱為乳清。優(yōu)選地， 將發(fā)酵劑加入到奶或加入到凝乳中。如本領域所知的，發(fā)酵劑包括至少一種酶，優(yōu)選為酶混 合物，其降解奶成分，諸如脂肪和蛋白以凝固奶酪，并且以引起風味形成。如在本方法中，將 馬鈴薯糖蛋白加入到奶、凝乳或發(fā)酵劑中，增強了風味的形成，并且因此在制造奶酪中是高 度有益的。
[0078] 浙干凝乳意味著從凝乳中分離出乳清的至少一部分。通常，通過擠壓來完成，但是 也可以想到其它方法。優(yōu)選地，凝乳是成型的和/或經(jīng)腌制的，以得到誘人的形狀和口味， 并且用于防止微生物的生長。
[0079] 充分浙干的結果是新鮮奶酪的形成。某些奶酪是通常以新鮮奶酪而食用，但是，通 常，熟化步驟提高奶酪的品質(zhì)。因此，可選地，允許對新鮮奶酪進行熟化。熟化新鮮奶酪意 味著將浙干的凝乳靜止一定時間，該時間取決于奶酪的類型。熟化的軟奶酪通常具有最小 的熟化時間，但是其它類型的奶酪可需要長很多的時間，諸如幾個月或幾年來熟化。足夠時 間的熟化導致最終奶酪。
[0080] 優(yōu)選地，奶酪諸如意大利式奶酪，藍奶酪和/或酶改性奶酪能夠根據(jù)該方法來制 備，并且因此，優(yōu)選使用馬鈴薯糖蛋白來增加意大利式奶酪，藍奶酪和/或酶改性奶酪的風 味。
[0081] 現(xiàn)將通過下列非限制性實施例來說明本發(fā)明。
[0082]實施例1:在酸-凝結的全奶中馬鈴薯糖蛋白催化的脂類分解的可行性
[0083] 在實驗室熱板上加熱在2L的燒杯中的IL的全奶。經(jīng)過煮沸，關閉加熱元件，并且 在攪拌下，加入乙酸使得從30%溶液直至形成凝乳。在濾鍋中利用奶酪布收集凝乳，并且使 該凝乳進行冷卻。將凝乳分成兩個部分。將IOmL的10%w:V的馬鈴薯糖蛋白溶液（Solanic 206P)緩慢傾倒在一個部分中，同時將IOmL的去礦質(zhì)水傾倒在另一個部分中用作未處理的 對照。通過輕輕擠壓從凝乳中去除殘余乳清。在5分鐘內(nèi)，馬鈴薯糖蛋白處理的凝乳塊散 發(fā)出強烈的奶酪氣味，而未處理的對照保持煮沸的奶氣味。
[0084] 實施例2 :凝乳酶-凝結的奶酪中的馬鈴薯糖蛋白劑量-響應關系
[0085] 凝乳酶購自西格瑪-奧德里奇（R5876)。全奶的500mL等分被補充有濃度在 0.lmg/L和I.Og/L之間的馬鈴薯糖蛋白，并且通過10mg/L凝乳酶的作用在35°C下凝結90 分鐘。除了不加入馬鈴薯糖蛋白之外，相似地制備對照的凝結奶（"HMW")。通過奶酪布和 擠壓來濾出凝結物從而回收凝乳部分。將所得到的材料完全浸沒在90g/L氯化鈉溶液中1 小時來進行腌制，并且隨后使該材料在室溫下進行熟化三天。要求由生化實驗室人員組成 的9人測試小組以確定表明是否每種奶酪的氣味都顯著不同于不含有馬鈴薯糖蛋白的對 照奶酪的氣味。三天之后，含lmg/L或更多馬鈴薯糖蛋白的奶酪具有與對照奶酪顯著不同 的氣味（對于圖表結果，參見圖1)。
[0086] 實施例3 :在凝乳酶-引起的凝結中的凝乳和乳清中馬鈴薯糖蛋白的分布
[0087] 馬鈴薯糖蛋白標記
[0088]SolanicHMW馬鈴薯蛋白分離物被用作基本純的馬鈴薯糖蛋白制劑。考馬斯亮藍 來自于默克（G-2501. 15444,R-2501. 12553)。HHO凝膠過濾柱來自于GE醫(yī)療。凝乳酶購 自西格瑪-奧德里奇（R5876)。
[0089] 在去礦物質(zhì)水中制備馬鈴薯糖蛋白的4.0% (m:m)溶液，并且在室溫下，在恒定攪 拌下用等摩爾量的考馬斯亮藍R-250或考馬斯亮藍G-250溫育30分鐘。在溫育后，在roiO一次性凝膠過濾柱上通過凝膠過濾從蛋白上去除任何未結合的染料。將染料標記的馬鈴薯 糖蛋白溶液儲存在-28°C下直至使用。
[0090] 經(jīng)由標記的馬鈴薯糖蛋白來確定馬鈴薯糖蛋白在凝乳和乳清上的分布
[0091] 奶的5mL等分被補充有20mg/L至2. Og/L之間的不同劑量的經(jīng)標記的馬鈴薯糖蛋 白。如果需要，通過加入去礦物質(zhì)水來保持總體積的恒定。所得到的混合物以及作為對照 的未處理的牛奶通過加入l〇mg/L的凝乳酶，在35°C下溫育90分鐘而凝結。所得到的材料 通過在9000g下離心10分鐘而被分成凝乳和乳清。該乳清隨后被轉移至微量試管中并且 在15000g下再次離心10分鐘以得到略微不透明的溶液。
[0092] 拍攝凝乳部分和乳清部分的照片以允許光學地檢查染料的分布（圖2)。由于通過 離心或微量過濾不足以除去殘余的渾濁性，乳清中藍染料的量的分光定量分析未成功。[0093] 經(jīng)由脂肪酶活性測量來確定馬鈴薯糖蛋白在凝乳和乳清上的分布
[0094] 已知的脂肪酶物質(zhì)購自西格瑪-奧德里奇（4-硝基苯基辛酸酯，21742)。奶的5mL 等分被補充有50mg/L至500mg/L之間的不同劑量的馬鈴薯糖蛋白。如果需要，通過加入 去礦物質(zhì)水來保持總體積的恒定。所得到的混合物以及作為對照的未處理的奶通過加入 10mg/L的凝乳酶，在35°C下溫育90分鐘而凝結。所得到的材料通過在9000g下離心10分 鐘而被分成凝乳和乳清。該乳清隨后被轉移至微量試管中并且在15000g下再次離心10分 鐘以得到略微不透明的溶液。將其在去礦質(zhì)水中稀釋10000倍。將凝乳部分在pH7. 5的 IOOmM的檸檬酸鹽緩沖液中再懸浮，并且也進行稀釋。將原始奶溶液的等分部分也稀釋至相 同的程度。在96孔板中將100μL的這些稀釋液暴露在pH8. 0的含2mM的4-硝基苯基辛 酸酯的100μL的30mMTris-HCl溶液中，并且利用BioRad型608酶標儀在室溫下以10秒 間隔在405nm處分析吸光度5分鐘（圖3)。乳清中馬鈴薯糖蛋白的活性遠遠低于加入的馬 鈴薯糖蛋白的活性，這表明了在奶凝結過程中，馬鈴薯糖蛋白主要分配在凝乳中。
[0095] 實施例4 :馬鈴薯糖蛋白失活
[0096] 由于在乳清中殘余的脂肪酶可導致剩余乳脂的降解，所以乳清中剩余的脂肪酶可 能是不需要的。這將導致在乳清中存在揮發(fā)性的難聞的自由脂肪酸，隨著時間變化會改變 口味。此外，由乳清制備的產(chǎn)品將含有脂解活性，潛在地限制了它們的應用。
[0097] 將馬鈴薯糖蛋白（Solanic206PHMW馬鈴薯蛋白）以lg/L的濃度溶解在pH5、6 和7的緩沖溶液中以及溶解在pH6. 7的新鮮制備的乳清中。經(jīng)由在截流系統(tǒng)中熱輻射量 測量殘余活性來構建在這些溶液中的脂肪酶活性的動力學降解模型。
[0098] 通過將全奶在30°C下暴露在10mg/L的凝乳酶（西格瑪-奧德里奇，R5876)下90 分鐘來制備乳清，并且經(jīng)由奶酪布通過過濾來去除凝乳。馬鈴薯糖蛋白溶液被暴露在50°C 和80°C的溫度下，暴露時間在4ms直至IOs的范圍內(nèi)。通過在340nm下測量在pH8.0的 30mM的磷酸鹽緩沖液下在4-甲基-乙酰氧基香豆素（AlfaAesarA12147)上作用3分鐘 的馬鈴薯糖蛋白溶液的吸光度的增加來測量脂肪酶活性。通過Anton和Barret的方法基 本上根據(jù)阿累尼烏斯動力學來擬合該數(shù)據(jù)（Anton，G.E.和BarrotD.M.，2002JAFC，50，p.4 119-25"InactivationofQuality-RelatedEnzymesinCarrotsandPotatoes，'）。
[0099] 表I:在不同條件下的馬鈴薯糖蛋白的熱失活。D-值代表引起活性降低90%所需 的時間，并且以秒來記錄。k為以赫茲計的反應速率，Ea為以kj/mol計的失活反應的活化 能量。
[0100]

【權利要求】
1. 一種用于從三酸甘油酯水解脂肪酸的方法，所述三酸甘油酯含有至少一種(；至(:8脂 肪酸，所述方法包括：在水的存在下，使所述三酸甘油酯遭遇馬鈴薯糖蛋白，其中，所述馬鈴 薯糖蛋白水解(；至(:8脂肪酸。
2. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述水解發(fā)生在乳液或膠體分散液中。
3. 根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其中，所述馬鈴薯糖蛋白處于天然形式。
4. 根據(jù)權利要求1至3中任一項所述的方法，其中，所述乳液或膠體分散液包括乳脂。
5. 根據(jù)權利要求4所述的方法，其中，所述乳液或膠體分散液包括奶。
6. 根據(jù)權利要求4所述的方法，其中，所述乳液或膠體分散液是凝乳。
7. 根據(jù)權利要求6所述的方法，其中，所述凝乳被用在奶酪制造中。
8. 根據(jù)權利要求1至7中任一項所述的方法，其中，所述馬鈴薯糖蛋白隨后通過加熱到 50 °C和80 °C之間的溫度而失活。
9. 根據(jù)權利要求1至8中任一項所述的方法，其中，所述三酸甘油酯具有等于或低于 9. 2,或優(yōu)選低于6. 3的水-辛醇分配系數(shù)。
10. 根據(jù)權利要求5或6所述的方法，其中，所述水解導致食品的風味增強。
11. 根據(jù)權利要求10所述的方法，其中，所述食品為奶酪。
12. 根據(jù)權利要求11所述的方法，其中，所述奶酪為意大利式奶酪、藍奶酪或酶改性奶 酪。
13. -種制造奶酪的方法，所述方法包括以下步驟： 使奶凝結以得到凝乳； 浙干所述凝乳；以及 形成新鮮奶酪，可選地，隨后進行熟化步驟， 其中，根據(jù)權利要求1至12中任一項所述的將馬鈴薯糖蛋白加入到所述奶中或被加入 到所述凝乳中以水解C4至C8脂肪酸。
【文檔編號】A23C19/05GK104428419SQ201380035673
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年7月3日 優(yōu)先權日:2012年7月4日
【發(fā)明者】羅賓·埃里克·雅各布斯·斯貝爾布靈克, 馬爾克·路易吉·費代里科·朱塞平, 馬敦·羅伯特·艾格蒙特 申請人:艾維貝合作公司