用于測定對抗癌療法的完全反應(yīng)的方法
【專利摘要】用于按照氟胞苷衍生物和COX-2酶抑制劑療法通過定量CD 133表達水平來鑒別具有結(jié)腸直腸癌的分子或完全緩解的患者的方法。還提供了用于通過定量血清CD133RNA水平來檢測癌癥干細(xì)胞的方法。
【專利說明】用于測定對抗癌療法的完全反應(yīng)的方法
[0001] 本申請要求于2012年5月1日提交的美國臨時專利申請No 61/640,789的權(quán)益， 該美國臨時專利申請的整體內(nèi)容以引用的方式并入本文中。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 本申請與2011年10月25日發(fā)布的美國專利8, 044, 033有關(guān)，該美國專利的整體 內(nèi)容以引用的方式并入本文中。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0004] 本發(fā)明整體上涉及分子生物學(xué)和腫瘤學(xué)領(lǐng)域。更具體來說，其涉及用于檢測癌癥 干細(xì)胞和用于測定對抗癌療法的反應(yīng)的方法。

【背景技術(shù)】
[0005] 結(jié)腸直腸癌是美國癌癥相關(guān)死亡的第二大最常見原因（Jemal等人，2005)。接受 用于轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌的第一線和第二線組合化學(xué)療法的患者的基準(zhǔn)中值總存活期目前 分別是 17-20個月和 10-12個月（Douillard等人，2000 ;Goldberg等人，2004 ;Tournigand 等人，2004 ;Rothenberg 等人，2003 ;Hurwitz 等人，2004 ;Giantonio 等人，2005; Cunningham等人，2004 ;Diaz Rubio等人，2005)。不幸的是，五年總存活期僅僅占5-8%。
[0006] 已經(jīng)使用多種組合療法來處理這種形式的癌癥。將貝伐單抗（bevacizumab)或 西妥昔單抗（cetuximab)與細(xì)胞毒性化學(xué)療法組合可產(chǎn)生60-80%的反應(yīng)率，從而使更多 患者轉(zhuǎn)變成手術(shù)可切除的，而非范圍介于2-10%之間的總完全反應(yīng)（CR)率（Hurwitz等 人，2004 ;Diaz Rubio 等人，2005 ;Hochster, 2006)。然而，關(guān)于化學(xué)療法的 2-10% CR 患者 的自然史了解很少，因為大多數(shù)會在兩年內(nèi)復(fù)發(fā)。這些手術(shù)CR患者的自然史可能與通過化 學(xué)療法呈現(xiàn)的CR患者的自然史最相近。
[0007] 在異種移植物模型中，與任一單獨治療形態(tài)相比，將塞來昔布（celecoxib) (XCEL) (CELEBREX?; Pfizer, New York, NY)( -種選擇性C0X-2抑制劑）添加到化學(xué)療法或 放射療法中顯著增加抗腫瘤功效（Cianchi等人，2001 ;Masferrer等人，2000 ;Sheng等 人，1998 ;Milas，2003)。近年來，研究顯示經(jīng)受XCEL(與卡培他濱（capecitabine)組 合）+/_放射療法的66位轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌患者經(jīng)歷毒性降低且六十六位患者中有十九位 (29% )使用單獨XCEL (n = 9)或XCEL和放射（n = 12)出乎意料地實現(xiàn)CR，參見例如美國 專利8, 044, 033。然而，仍然沒有方法可以預(yù)測哪些患者在這種療法后實現(xiàn)CR或確定患者 中是否保留殘余癌癥干細(xì)胞。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 在第一實施方案中，提供一種用于治療受試者的方法，其包括（a)選擇已經(jīng)接受 或正在接受治療結(jié)腸直腸癌的抗癌療法且經(jīng)測定具有升高的CD133表達水平的受試者，該 療法包括施用氟胞苷衍生物和環(huán)加氧酶-2 (C0X-2)酶抑制劑；和（b)向該受試者施用另一 抗癌療法。舉例來說，在某些方面，受試者經(jīng)測定在血液中具有升高的CD133表達水平。在 一些方面，該CD133表達升高是CD133RNA或蛋白質(zhì)表達升高。舉例來說，受試者可能經(jīng)測定 具有當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)化為 GAPDH RNA 水平時大于約 0? 56、0. 6、0. 7、0. 8、0. 9、1. 0、1. 5、2. 0、2. 5、3. 0、 3. 5.、4. 0、4. 5、5. 0、5. 5、6. 0、6. 5 或 7. 0 的 CD133RNA 表達水平（例如表達水平介于 0. 56 和7. 0之間）。如本文中所使用，CD133RNA表達水平是表示為相對于GAPDH mRNA對照的 ⑶133mRNA數(shù)量（參見例如Iinuma等人，2011，其整體內(nèi)容以引用的方式并入本文中）。本 領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到CD133水平也可以標(biāo)準(zhǔn)化為任何其它對照基因表達水平（例如看家 基因）且雖然原始數(shù)值將不同，但可以從評估得到相同信息。在其它方面，經(jīng)測定具有升高 的⑶133表達水平的受試者經(jīng)測定具有大于無癌癥對照受試者的表達水平的表達水平。舉 例來說，升高的CD133水平可以是血清CD133RNA水平，其比來自無癌癥對照受試者的樣品 中的⑶133表達水平大約2、4、6、8倍和10、20或30倍（例如比對照受試者的水平大不到 約10倍）。
[0009] 在另一方面，實施方案的方法進一步包括為另一抗癌療法選擇經(jīng)測定相對于對照 水平具有升高的癌胚抗原（CEA)、CD133、細(xì)胞角蛋白（CK) 19和/或CK20表達（例如mRNA 表達）的受試者。
[0010] 因此，在另一個實施方案中，提供一種用于治療受試者的方法，其包括（a)選擇如 下受試者：已經(jīng)接受或正在接受治療結(jié)腸直腸癌的抗癌療法，該療法包括施用氟胞苷衍生 物和C0X-2酶抑制劑；且經(jīng)測定具有如下CD133RNA表達水平（例如血液中）：（i)當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)化 為GAPDH RNA水平時大于約0.56 (例如介于0.56和7.0之間或更大）或（ii)大于來自無 癌癥對照的樣品中的CD133RNA表達水平（例如比對照受試者大約2到10倍）；和（b)向 該受試者施用另一抗癌療法。
[0011] 在另一個實施方案中，提供一種檢測受試者中的癌癥干細(xì)胞（或檢測存在癌癥干 細(xì)胞的風(fēng)險）的方法，其包括測定已經(jīng)經(jīng)受或正在經(jīng)受治療結(jié)腸直腸癌的抗癌療法的受 試者的生物樣品中的⑶133表達，該療法包括施用氟胞苷衍生物和C0X-2酶抑制劑，其中 CD133表達水平升高表示受試者中存在癌癥干細(xì)胞（或存在癌癥干細(xì)胞的風(fēng)險）。在一些方 面，⑶133表達升高是蛋白質(zhì)或RNA表達水平升高。舉例來說，實施方案的方法可以包括測 定CD133RNA表達水平，其中大于約0. 56(當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH RNA水平時）或介于約0. 56和 7. 0之間或更大的RNA表達水平表示受試者中存在癌癥干細(xì)胞。在一些方面，介于約0. 56 和 7. 0 之間或介于約 0? 56 和 6. 0、5. 5、4. 0、3. 5、3. 0、2. 5、2. 0、L 5 或 1. 0 之間的 CD133RNA 表達水平表示受試者中存在癌癥干細(xì)胞。在其它方面，方法包括確定受試者是否具有大于 無癌癥對照受試者的血清⑶133RNA (例如大約2到10倍）的血清⑶133RNA水平以鑒別受 試者具有癌癥干細(xì)胞、處于具有癌癥干細(xì)胞的生物標(biāo)志物的風(fēng)險中或具有癌癥干細(xì)胞的生 物標(biāo)志物。在其它方面，實施方案的方法進一步包括測定受試者中的CEA、CK19和/或CK20 表達（例如mRNA表達），其中相對于對照水平的升高的CEA、CK19和/或CK20表達表示受 試者中存在癌癥干細(xì)胞或受試者中存在癌癥干細(xì)胞的風(fēng)險增加。
[0012] 在另一方面，提供一種檢測受試者中的癌癥干細(xì)胞的生物標(biāo)志物的方法，其包 括（a)測定已經(jīng)經(jīng)受或正在經(jīng)受治療結(jié)腸直腸癌的抗癌療法的受試者的生物樣品中的 ⑶133RNA表達，該療法包括施用氟胞苷衍生物和C0X-2酶抑制劑；和（b)如果是如下情況， 那么將該受試者鑒別為具有癌癥干細(xì)胞的生物標(biāo)志物：（i)該樣品中的CD133RNA表達水平 大于約0. 56 ;或（ii)大于來自無癌癥對照的樣品中的CD133RNA表達水平。
[0013] 在另一個實施方案中，提供一種檢測受試者中的癌癥干細(xì)胞的生物標(biāo)志物的方 法，其包括測定已經(jīng)經(jīng)受或正在經(jīng)受治療結(jié)腸直腸癌的抗癌療法的受試者的生物樣品中的 ⑶133表達，該療法包括施用氟胞苷衍生物和C0X-2酶抑制劑，其中升高的⑶133表達水平 表示受試者中存在癌癥干細(xì)胞的生物標(biāo)志物。在某些方面，方法進一步包括如果樣品中的 ⑶133RNA表達水平小于約0. 56或小于來自無癌癥對照的樣品中的⑶133表達水平，那么將 受試者鑒別為不具有癌癥干細(xì)胞的生物標(biāo)志物。舉例來說，在某些方面，將受試者鑒別為不 具有或不具有癌癥干細(xì)胞的生物標(biāo)志物包括報告（例如電子或書面報告）受試者具有（或 不具有）癌癥干細(xì)胞的生物標(biāo)志物。
[0014] 在另一個實施方案中，提供一種確定受試者是否需要另一抗癌療法的方法，其包 括測定已經(jīng)經(jīng)受或正在經(jīng)受治療結(jié)腸直腸癌的抗癌療法的受試者的生物樣品中的CD133 表達，該療法包括施用氟胞苷衍生物和C0X-2酶抑制劑，其中升高的⑶133表達水平表示受 試者需要另一抗癌療法。在一些方面，CD133表達升高是蛋白質(zhì)或RNA表達水平升高。舉 例來說，實施方案的方法可以包括測定⑶133RNA表達水平，其中大于約0. 56或介于約0. 56 和7. 0之間或更大的RNA表達水平表示受試者需要另一抗癌療法。在一些方面，升高的 ⑶133表達水平大于來自無癌癥對照的樣品中的⑶133RNA表達水平（例如大2到10倍）。 在其它方面，實施方案的方法進一步包括測定受試者中的例如CEA、CK19和/或CK20的另 一生物標(biāo)志物基因的表達（例如mRNA表達），其中CEA、CK19和/或CK20表達升高表示受 試者需要另一抗癌療法。
[0015] 在另一個實施方案中，提供一種用于確定受試者是否需要另一抗癌療法的方法， 其包括（a)測定已經(jīng)經(jīng)受或正在經(jīng)受治療結(jié)腸直腸癌的抗癌療法的受試者的生物樣品中 的⑶133RNA表達，該療法包括施用氟胞苷衍生物和C0X-2酶抑制劑；和（b)如果該樣品中 的⑶133RNA表達水平大于約0. 56或大于來自無癌癥對照的樣品中的⑶133表達水平，那 么將該受試者鑒別為需要另一抗癌療法。在其它方面，方法包括如果樣品中的⑶133RNA表 達水平小于約〇. 56或小于來自無癌癥對照的樣品中的⑶133表達水平，那么將受試者鑒別 為不需要另一抗癌療法。舉例來說，在某些方面，將受試者鑒別為需要（或不需要）另一抗 癌療法包括報告（例如電子或書面報告）受試者需要（或不需要）另一抗癌療法。
[0016] 在一個相關(guān)實施方案中，提供一種用于測定受試者對抗癌療法的完全反應(yīng)的方 法，其包括：（a)測定已經(jīng)經(jīng)受或正在經(jīng)受治療結(jié)腸直腸癌的抗癌療法的受試者的生物樣 品中的⑶133RNA表達，該療法包括施用氟胞苷衍生物和C0X-2酶抑制劑；和（b)如果該樣 品中的CD133RNA表達水平（i)當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH RNA水平時小于約0. 56或（ii)小于來 自無癌癥對照的樣品中的⑶133RNA表達水平，那么將該受試者鑒別為對抗癌療法具有完 全反應(yīng)。
[0017] 在某些方面，選擇經(jīng)測定具有升高的⑶133、CEA、CK19和/或CK20表達水平的受 試者包括測量受試者中（例如來自受試者的樣品中）的CD133、CEA、CK19和/或CK20表 達。在其它方面，選擇受試者可以包括獲得提供受試者的⑶133、CEA、CK19和/或CK20表 達水平的報告，例如書面或電子報告。
[0018] 在某些方面，實施方案的方法包括測定受試者中的⑶133、CEA、CK19和/或CK20 表達水平。在一些方面，測定⑶133、CEA、CK19和/或CK20蛋白質(zhì)表達水平?？梢杂糜跍y 定該蛋白質(zhì)表達的方法包括（但不限于）質(zhì)譜學(xué)、適體結(jié)合分析或使用抗體的免疫檢測方 法（例如蛋白質(zhì)印跡0^8七6111131〇〇31154或111〇。在其它方面，測定〇)133、0￡4、〇(19 和/或CK20表達水平包括測定RNA表達水平?？梢杂糜跍y定RNA表達水平的方法包括（但 不限于）核酸雜交（例如RNA印跡（Northern blot)或陣列雜交）、核酸測序或反轉(zhuǎn)錄聚合 酶鏈反應(yīng)（RT-PCR)。在其它方面，實施方案的方法進一步包括報告受試者的CD133表達水 平（例如書面或電子報告）。在其它方面，實施方案的方法包括報告受試者的CD133、CEA、 CK19和/或CK20表達水平；報告受試者是否包含癌癥干細(xì)胞；或報告受試者是否對抗癌療 法具有完全反應(yīng)。
[0019] 在其它方面，實施方案的方法包括測定或獲得受試者中除CD133以外的至少第二 種基因的表達水平。在一些情況下，該第二種基因是在癌細(xì)胞中或在癌癥干細(xì)胞中表達的 基因。在其它方面，第二種基因是參考基因。實施方案的某些方面涉及測定或獲得受試 者（或來自受試者的樣品中）的⑶133RNA表達水平。在某些方面，⑶133RNA表達水平是 與參考RNA表達相比的相對表達水平。舉例來說，在一些情況下，參考RNA可以是編碼甘 油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH)的RNA，參見例如以引用的方式并入本文中的NCBI登記號 NM_002046。同樣，其它生物標(biāo)志物基因（例如CEA、CK19和/或CK20)的表達可以相對于 參考基因（例如GAPDH)的表達來測定。
[0020] 實施方案的某些方面涉及經(jīng)測定具有升高的⑶133表達的受試者。在一些方面， ⑶133表達升高是來自受試者的全血、血清或組織樣品中的表達升高。在一些方面，實施方 案的方法可以包括從受試者獲得生物樣品。應(yīng)認(rèn)識到樣品可以直接從受試者獲得（例如通 過從受試者抽血）或可以通過第三方（例如醫(yī)生或?qū)嶒炇遥┇@得。在某些方面，生物樣品 可以是血液、血清、糞便或組織樣品。在某些方面，實施方案的方法涉及評估、獲得或比較來 自無癌癥對照受試者的樣品中的CD133水平。在一些方面，無癌癥受試者是從未患癌癥且 從未接受抗癌療法的受試者。在其它方面，對照受試者是年齡匹配對照，例如年齡在1〇、5 或2歲內(nèi)的待評估受試者的對照。
[0021] 實施方案的方面涉及已經(jīng)或正在接受抗癌療法和任選地另一抗癌療法的受試者， 該療法包括施用氟胞苷衍生物、C0X-2酶抑制劑。在一些特定方面，受試者已經(jīng)或正在接受 包括施用塞來昔布和卡培他濱的抗癌療法。在某些方面，受試者已經(jīng)或正在接受抗癌療法， 包括施用氟胞苷衍生物、C0X-2酶抑制劑和放射療法。在其它方面，受試者已經(jīng)或正在接受 包括施用塞來昔布、卡培他濱和放射的抗癌療法。
[0022] 在某些方面，實施方案的受試者是犬、貓、馬、牛或人類受試者。在一些方面，受試 者被診斷患有或先前被診斷患有結(jié)腸直腸癌（例如轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌）。在其它方面，受 試者正在治療或先前治療過結(jié)腸直腸癌。舉例來說，結(jié)腸直腸癌可以是轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸 癌，例如包含結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移（例如孤立性或群集性結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移）的癌癥。在一些方面，實施方案 的受試者可以進一步定義為已經(jīng)或先前已經(jīng)患有卡培他濱誘發(fā)性手足綜合癥（hand-foot syndrome ;HFS)的受試者。
[0023] 在其它方面，實施方案的受試者是不包含升高的CD133表達水平（例如升高的 CD133RNA表達水平）的受試者。因此，實施方案的某些方面可以包含受試者不包含癌癥干 細(xì)胞的報告；或受試者對抗癌療法具有完全反應(yīng)的報告。
[0024] 實施方案的方面涉及涉及C0X-2酶抑制劑的抗癌療法。在某些方面，該C0X-2酶 抑制劑是選擇性C0X-2抑制劑。舉例來說，在一些方面，C0X-2選擇性酶抑制劑可以是美 洛昔康（meloxicam)、伐地昔布（valdecoxib)(BextraTM)、塞來昔布（CelebrexTM)、羅非 昔布（rofecoxib) (VioxxTM)或萘普生（naproxen) (AleveTM)。雖然在一個優(yōu)選實施方案 中，C0X-2抑制劑是塞來昔布，但預(yù)期包括除塞來昔布以外的C0X-2抑制劑作為本發(fā)明的 一個實施方案。在某些情況下，向受試者施用的塞來昔布的劑量可以定義為小于約200mg b. i. d、大于 200mgb. i. d 或約 200mg b. i. d。
[0025] 在某些方面，實施方案涉及涉及氟胞苷衍生物的抗癌療法。舉例來說，氟胞苷衍生 物可以是衍生物5' -脫氧-5-氟胞苷衍生物或美國專利No. 4, 966, 891中所述的衍生物， 該美國專利以引用的方式并入本文中。在某些方面，氟胞苷衍生物是卡培他濱。在某些方 面，卡培他濱是經(jīng)口施用。舉例來說，卡培他濱可以約850到約1300mg/m2/d、約900到約 1250mg/m2/d的劑量或約1000mg/m2/d的劑量施用。
[0026] 實施方案的某些方面涉及向受試者（例如經(jīng)測定具有升高的CD133表達水平的受 試者）施用另一抗癌療法。在一些方面，另一抗癌療法包含放射療法、化學(xué)療法、免疫療法 或手術(shù)。在某些方面，另一抗癌療法是放射療法。該放射療法可以涉及例如向受試者施用 約25到約65Gy、約35到約50Gy或約35到約45Gy放射。此外，在某些情況下，放射療法包 括3-D適形規(guī)劃技術(shù)。在一些方面，另一抗癌療法包括用氟胞苷衍生物、C0X-2酶抑制劑和 任選地放射療法治療。
[0027] 如本文說明書中所使用，"一個（a/an) "可以意指一個或多個。如本文權(quán)利要求中 所使用，當(dāng)結(jié)合單詞"包含"使用時，單詞"一個"可以意指一個或多于一個。
[0028] 除非明確地表示僅是指替代物或替代物是互相排斥的，否則在權(quán)利要求中使用術(shù) 語"或"是用于意指"和/或"，但本公開支持僅是指替代物和"和/或"的定義。如本文中 所使用，"另一個"可以意指至少第二個或更多個。
[0029] 在整個本申請中，術(shù)語"約"是用于表示值包括用于測定該值的裝置、方法所產(chǎn)生 的誤差的固有變化或研究受試者之間存在的變化。
[0030] 本發(fā)明的其它目標(biāo)、特點和優(yōu)點將從以下詳細(xì)描述而變得顯而易見。然而，應(yīng)了解 詳細(xì)描述和特定實施例當(dāng)表示本發(fā)明的優(yōu)選實施方案時僅以說明方式給出，因為在本發(fā)明 的精神和范圍內(nèi)的多種改變和修改對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將從這一詳細(xì)說明而變得顯 而易見。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0031] 以下圖示形成本說明書的一部分并且被包括以進一步說明本發(fā)明的某些方面。可 以通過參考這些圖示中的一個或多個結(jié)合本文中呈現(xiàn)的特定實施方案的詳細(xì)描述來更好 地理解本發(fā)明。
[0032] 圖1:可歸因于XCEL的常見不利事件（n = 65)(研究1);
[0033] 圖2:根據(jù)疾病部位的反應(yīng)率（研究1);
[0034] 圖3:接受XCEL作為第一線或第二線療法的患者的卡普蘭-邁耶存活期分析 (Kaplan-Meier survival analysis)。曲線圖說明無進展存活期（研究1);
[0035] 圖4:接受XCEL作為第一線或第二線療法的患者的卡普蘭-邁耶存活期分析；曲 線圖說明總存活期（研究1);
[0036] 圖5:事件圖表分析（n = 21)(研究2);
[0037] 圖6 :在已切除（n = 6)和未切除患者（n = 13)中的完全反應(yīng)持續(xù)時間（研究 2)；
[0038] 圖7:在已切除和未切除患者（n = 19)中的無進展存活期和總存活期（研究2);
[0039] 圖8:可歸因的不利事件（研究2);
[0040] 圖9:來自結(jié)腸直腸癌診斷的事件圖表分析（研究3);
[0041] 圖10A-B:維持相對于不維持XCEL的RFS (圖10A)和0S (圖10B)(研究3);
[0042] 圖11:當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)化為GusB和GAPDH看家基因時的⑶133mRNA拷貝數(shù)結(jié)果的比較；結(jié) 果顯示標(biāo)準(zhǔn)化為GusB或GAPDH提供類似結(jié)果，從而表明任何等效看家基因可以用于該標(biāo)準(zhǔn) 化。

【具體實施方式】
[0043] I.本發(fā)明
[0044] 近來已經(jīng)證明化學(xué)治療劑和C0X-2抑制劑（例如塞來昔布）的組合（XCEL療法） 高度有效治療轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌。事實上，最新研究已經(jīng)顯示多達29%的治療患者可以實 現(xiàn)CR(美國專利8, 044, 033)。然而，即使鑒于該等成果，仍沒有預(yù)測哪些患者在該療法后展 現(xiàn)CR的方法。具體來說，先前沒有方法能確定例如XCEL等療法是否可有效地提供完全反 應(yīng)以相對于只是處于臨床緩解階段但仍然包含癌癥干細(xì)胞的那些受試者來說，實現(xiàn)分子緩 解（即，通過有效殺死可能存在于所治療受試者中的癌癥干細(xì)胞來實現(xiàn)）。對于療法這是一 個重大障礙，因為無法鑒別可能需要另一抗癌療法的患者直到癌癥復(fù)發(fā)。相反，已經(jīng)實現(xiàn)分 子緩解的患者可能要繼續(xù)經(jīng)受不需要的療法。
[0045] 本文中詳述的研究證明了已經(jīng)經(jīng)受抗癌療法（XCEL)的受試者中的⑶133表達 增加可用于確定該受試者是否對該療法已經(jīng)具有完全反應(yīng)。具體來說，發(fā)現(xiàn)血液樣品中 的⑶133RNA表達升高表示存在癌癥干細(xì)胞。因此，通過評估經(jīng)受或已經(jīng)經(jīng)受的患者中的 CD133表達，相對于已經(jīng)具有完全反應(yīng)的患者可以鑒別具有殘余癌癥干細(xì)胞的抗癌療法患 者。具體來說，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)對療法具有完全反應(yīng)的患者具有小于約0. 56的血清⑶133RNA水 平（當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH mRNA水平時）。同樣，與健康無癌癥對照受試者相比，完全反應(yīng)者展 現(xiàn)顯著低于健康對照的血清⑶133RNA水平。因此，根據(jù)實施方案評估⑶133RNA水平允許 在發(fā)現(xiàn)患者仍然包含癌癥干細(xì)胞的情況下進行早期其它治療性介入。同樣，可以在對療法 顯示完全反應(yīng)的受試者中中斷抗癌療法（和可伴隨療法的顯著副作用）。
[0046] II.檢測基因表達
[0047] 在某些實施方案中，本文中所提供的方法涉及檢測測定受試者中的基因表達。在 一些方面，測定CEA、⑶133、CK19和/或CK20的表達水平。舉例來說，在一些實施方案中， 測定⑶133包括定量⑶133RNA或蛋白質(zhì)表達。在一些方面，定量⑶133表達包括相對于參 考基因測定⑶133表達。本文中論述用于測定⑶133表達水平的方法同樣適用于測定其它 生物標(biāo)志物基因（例如CEA、CK19和/或CK20)的表達水平。
[0048] 在臨床診斷和/或監(jiān)測受試者時，相較于來自未患癌癥或?qū)拱┋煼ㄒ呀?jīng)具有完 全反應(yīng)的受試者的相應(yīng)生物樣品中的水平（即參考水平）檢測CD133的表達增加表示受試 者包含癌癥干細(xì)胞（或受試者需要另一抗癌療法）。
[0049] 本領(lǐng)域技術(shù)人員已知任何臨床診斷并不一定是基于單一分離方法進行的。因此， 實施方案的方法可以包括測定或獲得除⑶133表達水平以外兩種、三種或更多種生物標(biāo)志 物的表達水平或存在和/或一個或多個臨床癥狀以診斷受試者。
[0050]A?核酸檢測
[0051] 在一些實施方案中，評估⑶133表達可以涉及定量mRNA表達。舉例來說，使 RNA反轉(zhuǎn)錄（RT)為cDNA、隨后相對定量PCRTM (RT-PCRTM)可用于測定特定mRNA (例如 CD133 編碼 RNA，例如由 NCBI 登記號 NM_001145847. 1、NM_001145848. 1、NM_001145849. 1、 NM_001145850. 1、NM_001145851. 1、NM_001145852. 1 或 NM_006017. 2 提供的那些 RNA，其中 每一個都以引用的方式并入本文中）的相對濃度。通過測定特定mRNA的濃度相對于參考 RNA (例如編碼對照基因的RNA，例如GAPDH)有所變化，可以表明編碼特定mRNA種類的基因 差異表達。在某些方面，mRNA表達可以相對于該參考mRNA的表達進行定量。舉例來說，用 于相對于GAPDH定量⑶133mRNA表達的方法先前已經(jīng)描述于Iinuma等人，2011中，其整體 內(nèi)容以引用的方式并入本文中。
[0052] 在一些實施方案中，可以使如上文所述的擴增產(chǎn)物經(jīng)受序列分析以使用標(biāo)準(zhǔn)序列 分析技術(shù)鑒別特定種類的變化。在某些方法中，基因的詳盡分析是通過使用設(shè)計成用于最 佳測序的引物對的序列分析進行。本發(fā)明實施方案提供可以使用這些類型的分析中的任一 種或全部的方法。使用已知序列CD133和/或參考基因，寡核苷酸引物可以設(shè)計成允許整個 給定基因的序列（或蛋白質(zhì)編碼序列）擴增，其隨后可以通過直接測序來分析。同樣，DNA測 序可以用于檢測和/或定量CD133或其它標(biāo)志物或參考基因的表達。用于該等序列的方法 包括（但不限于）可逆終止子方法（例如由Illumina?和Hclicos? lUoSciences所使用的）、 焦磷酸測序（例如來自Roche的454測序）和通過連接測序（例如Life TechnologiesTM SOLiDTM 測序）
[0053] 在PCRTM中，擴增的靶DNA的分子數(shù)目隨著反應(yīng)的每個循環(huán)增加接近兩倍直到一 些試劑變得有限。隨后，擴增率變得逐漸變小直到在循環(huán)之間擴增的靶不再增加。如果繪 制X軸上是循環(huán)數(shù)目且Y軸上是擴增靶DNA的濃度的log的曲線圖，那么特征形狀的曲線是 通過連接繪制的點而形成。從第一個循環(huán)開始，直線斜率是正的且恒定的。這可以說是曲 線的線性部分。在試劑變得有限后，直線斜率開始減小且最后變成零。此時，擴增的靶DNA 的濃度變得漸近某一固定值。這可以說是曲線的平臺部分。
[0054] 在PCRTM擴增的線性部分中靶DNA的濃度與在反應(yīng)開始之前靶的起始濃度成正 t匕。通過測定已經(jīng)完成相同循環(huán)數(shù)目且在其線性范圍內(nèi)的PCRTM反應(yīng)中靶DNA的擴增產(chǎn)物 的濃度，可以測定原始DNA混合物中特定靶序列的相對濃度。如果DNA混合物是由從不同 組織或細(xì)胞分離的RNA合成的cDNA，那么可以對于各組織或細(xì)胞測定靶序列所來源的特定 mRNA的相對豐度。PCRTM產(chǎn)物的濃度和相對mRNA豐度之間的這一正比僅在PCRTM反應(yīng)的 線性范圍內(nèi)是正確的。
[0055] 在曲線的平臺期部分中靶DNA的最終濃度是通過反應(yīng)混合物中試劑的可用性來 測定的并且與靶DNA的原始濃度無關(guān)。因此，在對于RNA群體來說可以通過RT-PCRTM測定 mRNA種類的相對豐度之前必須滿足的第一個條件是當(dāng)PCRTM反應(yīng)是處于其曲線的線性部 分中時必須對擴增的PCRTM產(chǎn)物的濃度進行取樣。
[0056] 對于RT-PCRTM實驗來說必須滿足以成功測定特定mRNA種類的相對豐度的第二個 條件是可擴增cDNA的相對濃度必須標(biāo)準(zhǔn)化為某一獨立標(biāo)準(zhǔn)物。RT-PCRTM實驗的目標(biāo)是相 對于樣品中所有mRNA種類的平均豐度測定特定mRNA種類的豐度。
[0057] 用于競爭性PCRTM的大多數(shù)方案利用大約與靶一樣豐富的內(nèi)部PCRTM標(biāo)準(zhǔn)物。如 果在其線性階段期間對PCRTM擴增的產(chǎn)物進行取樣，那么這些策略是有效的。如果當(dāng)反應(yīng) 接近平臺期階段時對產(chǎn)物取樣，那么豐度較小的產(chǎn)物變得相對過量存在。許多不同RNA樣 品的相對豐度的比較（例如針對差異表達檢查RNA樣品時的情況）變得以使得RNA的相對 豐度的差異顯得小于其實際情況的方式改變。如果內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物比靶更豐富，那么這不是一 個重要問題。如果內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物比靶更豐富，那么可以在RNA樣品之間進行直接線性比較。
[0058] 用于檢測RNA表達的RNA印跡技術(shù)也為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。RNA印跡涉及使 用RNA作為靶。簡單地說，使用探針靶向已經(jīng)固定于合適的基質(zhì)（經(jīng)常是硝化纖維濾膜） 上的RNA種類。不同種類應(yīng)在空間上進行分隔以有助于分析。這經(jīng)常伴隨進行核酸種類的 凝膠電泳，隨后"印跡"到濾膜上。隨后，將所印跡的靶與探針（例如經(jīng)標(biāo)記探針）在促進 變性和再雜交的條件下一起孵育。因為該探針是設(shè)計成與靶進行堿基配對，所以探針將在 復(fù)性條件下結(jié)合靶序列的一部分。然后除去未結(jié)合的探針，且完成檢測。
[0059] 在一些實施方案中，在凝膠分離和用溴化乙錠染色以及在UV光下目測后定量核 酸。在一些實施方案中，如果核酸由使用整體放射或熒光標(biāo)記的核苷酸合成或擴增來產(chǎn)生， 那么隨后在分離后可以使產(chǎn)物暴露于x射線膜或在適當(dāng)刺激光譜下目測。
[0060] 在一些實施方案中，間接實現(xiàn)目測。在分離核酸后，使經(jīng)標(biāo)記的核酸與靶序列接 觸。使探針綴合于發(fā)色團或放射性同位素。在另一個實施方案中，使探針綴合于結(jié)合配偶 體，例如抗體或生物素，且結(jié)合對的另一成員帶有可檢測部分。上述情況的一個實例描述于 以引用的方式并入本文中的美國專利No. 5, 279, 721中，其公開用于自動電泳和轉(zhuǎn)移核酸 的設(shè)備和方法。該設(shè)備允許電泳和印跡而對凝膠無外部操作且理想地適合于進行根據(jù)本發(fā) 明實施方案的方法。
[0061] B.蛋白質(zhì)的檢測
[0062] 在一些方面，實施方案的方法涉及檢測⑶133蛋白質(zhì)的表達。舉例來說，可以使 用用于結(jié)合、純化、除去、定量和/或另外一般檢測蛋白質(zhì)組分（例如CD133)的免疫檢測 方法。根據(jù)本發(fā)明實施方案制備的抗體可以用于檢測CD133。一些免疫檢測方法包括（列 舉幾種）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA)、放射免疫分析（RIA)、免疫放射測定分析、熒光免疫 分析、化學(xué)發(fā)光分析、生物發(fā)光分析和蛋白質(zhì)印跡。多種適用免疫檢測方法的步驟已經(jīng)描 述于科學(xué)文獻中，例如 Doolittle 和 Ben-Zeev, 1999 ;Gulbis 和 Galand, 1993 ;De Jager 等 人，1993 ;和Nakamura等人，1987,每一篇以引用的方式并入本文中。
[0063] 一般來說，免疫結(jié)合方法包括獲得懷疑含有⑶133蛋白質(zhì)、多肽和/或肽的樣品， 并且根據(jù)本發(fā)明實施方案使該樣品與第一抗CD133抗體在有效允許形成免疫復(fù)合物的條 件下接觸。該抗體將優(yōu)選地連接于固體載體，例如以列矩陣形式，且含有生物標(biāo)志物蛋白質(zhì) 抗原組分的樣品將施加到該固定抗體中。將從管柱洗滌出不需要的組分，留下與固定抗體 免疫復(fù)合的抗原，然后通過從管柱除去蛋白質(zhì)和/或肽來收集生物標(biāo)志物蛋白質(zhì)抗原。
[0064] 免疫結(jié)合方法還包括用于檢測和定量樣品中的⑶133的量的方法。本文中，將獲 得樣品且使該樣品與抗體接觸，然后檢測和定量在特定條件下形成的免疫復(fù)合物的量。[0065] 依據(jù)抗原檢測，所分析的生物樣品可以是懷疑含有表達CD133的細(xì)胞的任何樣 品，例如血清或全血樣品、組織提取物或另一種生物流體。
[0066]在足以允許形成免疫復(fù)合物（初級免疫復(fù)合物）的有效條件和一段時間下使所選 生物樣品與抗體接觸一般就是將抗體組合物簡單地添加到樣品中并且孵育混合物足夠長 以使抗體與（即結(jié)合于）存在的任何CD133蛋白質(zhì)抗原形成免疫復(fù)合物的一段時間。此后， 一般將洗滌樣品-抗體組合物（例如組織切片、ELISA培養(yǎng)板、斑點印跡或蛋白質(zhì)印跡）以 除去任何非特異性結(jié)合抗體種類，從而僅允許那些特異性結(jié)合于初級免疫復(fù)合物內(nèi)的抗體 被檢測到。
[0067] 一般來說，免疫復(fù)合物形成的檢測在本領(lǐng)域中是眾所周知的并且可以通過應(yīng)用 許多方法來實現(xiàn)。這些方法一般是基于標(biāo)記或標(biāo)志物的檢測，例如那些放射性、熒光、生 物和酶標(biāo)簽中的任一種。涉及此類標(biāo)記的用途的美國專利包括3, 817, 837 ;3, 850, 752 ; 3,939,350 ;3, 996, 345 ;4, 277, 437 ;4, 275, 149 和 4, 366, 241，其中的每一個以引用的方式 并入本文中。當(dāng)然，如本領(lǐng)域中所已知，通過使用次級結(jié)合配體（例如第二抗體）和/或生 物素/抗生物素蛋白配體結(jié)合配置可能會發(fā)現(xiàn)額外優(yōu)點。
[0068]在一些實施方案中，用于檢測的⑶133抗體（例如抗⑶133抗體）自身可連接于 可檢測標(biāo)記，其中隨后將簡單地檢測這一標(biāo)記，從而允許組合物中初級免疫復(fù)合物的量被 測定出。在一些實施方案中，變得結(jié)合于初級免疫復(fù)合物內(nèi)的第一抗體可以借助于對于該 抗體具有結(jié)合親和性的第二結(jié)合配體來檢測。在某些實施方案中，第二結(jié)合配體可以連接 于可檢測標(biāo)記。第二結(jié)合配體自身經(jīng)常是抗體，其因此可以被稱為"次級"抗體。在足以允 許形成次級免疫復(fù)合物的有效條件和一段時間下使初級免疫復(fù)合物與經(jīng)標(biāo)記的次級結(jié)合 配體或抗體接觸。隨后一般洗滌次級免疫復(fù)合物以除去任何非特異性結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記的次級 抗體或配體，且隨后檢測次級免疫復(fù)合物中的殘余標(biāo)記。
[0069]其它方法包括通過兩步法檢測初級免疫復(fù)合物。如上文所述，將對于抗體具有結(jié) 合親和性的第二結(jié)合配體（例如抗體）用于形成次級免疫復(fù)合物。洗滌后，再次在足以允 許形成免疫復(fù)合物（三級免疫復(fù)合物）的有效條件和一段時間下，使次級免疫復(fù)合物與對 于第二抗體具有結(jié)合親和性的第三結(jié)合配體或抗體接觸。該第三配體或抗體連接于可檢測 標(biāo)記，從而允許檢測由此形成的三級免疫復(fù)合物。如果需要的話，這種系統(tǒng)可以提供信號放 大。
[0070] -種免疫檢測方法使用兩種不同抗體。使用第一步驟生物素化單克隆或多克隆抗 體檢測靶抗原，然后使用第二步驟抗體檢測連接于復(fù)合生物素的生物素。在那種方法中，首 先將待測試的樣品在含有第一步驟抗體的溶液中孵育。如果靶抗原存在，那么一些抗體結(jié) 合于該抗原以形成生物素化抗體/抗原復(fù)合物。隨后通過在抗生蛋白鏈菌素（或抗生物素 蛋白）、生物素化DNA和/或補充生物素化DNA的連續(xù)溶液中孵育來擴增抗體/抗原復(fù)合物， 其中每一步驟將額外生物素位點添加到抗體/抗原復(fù)合物中。重復(fù)擴增步驟直到實現(xiàn)合適 的擴增水平，此時將樣品在含有針對生物素的第二步驟抗體的溶液中孵育。這種第二步驟 抗體例如經(jīng)可用于通過組織酶學(xué)使用色原底物檢測抗體/抗原復(fù)合物的存在的酶標(biāo)記。在 合適的擴增下，可以產(chǎn)生肉眼可見的綴合物。
[0071] 另一已知的免疫檢測方法利用免疫-PCR方法。PCRTM方法直到與生物素化DNA - 起孵育為止是類似于康托爾法（Cantor method),然而，用釋放抗體的低pH值或高鹽緩沖 液洗滌出DNA/生物素/抗生蛋白鏈菌素/抗體復(fù)合物，以替代使用多輪抗生蛋白鏈菌素和 生物素化DNA孵育。然后使用所得洗液用合適的引物和適當(dāng)對照進行PCRTM反應(yīng)。至少理 論上，可以利用PCRTM的巨大擴增能力和特異性來檢測單一抗原分子。
[0072] 本發(fā)明實施方案的免疫檢測方法在診斷和預(yù)后例如多種形式的發(fā)炎性疾?。ɡ?如KD)的病狀中具有明顯效用。本文中，使用懷疑含有CD133生物標(biāo)志物蛋白質(zhì)、多肽、肽 和/或突變體的生物和/或臨床樣品。然而，這些實施方案也適用于非臨床樣品，例如在滴 定抗原或抗體樣品時，例如在鑒別發(fā)炎細(xì)胞介體時。
[0073] III?抗癌療法
[0074] 如上文所詳述，實施方案的某些方面涉及抗癌療法的用途。舉例來說，在一些方 面，在用使用氟胞苷衍生物和C0X-2酶抑制劑的方案治療后選擇受試者來施用另一抗癌療 法。在一些情況下，該另一抗癌療法可以是用氟胞苷衍生物（例如卡培他濱）和C0X-2酶 抑制劑（例如塞來昔布）進一步治療。在其它方面，另一療法可以是用化學(xué)療法、放射線療 法、免疫療法、基因療法、手術(shù)療法或其組合治療。
[0075] A?化學(xué)療法
[0076]在某些實施方案中，受試者可以用另一化學(xué)治療劑治療?；瘜W(xué)治療劑的實例包括 (但不限于）燒化劑，例如塞替派（thiotepa)和環(huán)磷酰胺（cyclosphosphamide);磺酸燒 基酯，例如白消安（busulfan)、英丙舒凡（improsulfan)和哌泊舒凡（piposulfan);氮丙 陡，例如苯佐替派（benzodopa)、卡波醌（carboquone)、美妥替派（meturedopa)和烏瑞替 派（uredopa);乙烯亞胺和曱基蜜胺（methylamelamine)，包括六甲蜜胺（altretamine)、 三亞乙基亞胺（triethylenemelamine)、三亞乙基憐酉先胺（trietylenephosphoramide)、 三亞乙基硫代磷酰胺（triethiylenethiophosphoramide)和三甲基三聚氰胺 (trimethylolomelamine);多聚乙酰（尤其是布拉它辛（bullatacin)和布拉它辛 酮（bullatacinone));喜樹堿（包括合成類似物拓?fù)涮婵担╰opotecan));苔蘚抑素 (bryostatin);卡利斯達?。╟allystatin) ;CC_1065(包括其阿多來新（adozelesin))、 卡折來新（carzelesin)和比折來新（bizelesin)合成類似物）；隱藻素（尤其是隱藻 素1和隱藻素8);海兔毒素（dolastatin);倍癌霉素（duocarmycin)(包括合成類似物、 KW-2189 和 CB1-TM1);艾植塞洛素（eleutherobin);水鬼蕉堿（pancratistatin);匍枝珊 蝴醇（sarcodictyin);海綿抑素（spongistatin);氮芥，例如苯丁酸氮芥（chlorambucil)、 萘氮芥（chlornaphazine)、氯憐醜胺（cholophosphamide)、雌莫司?。╡stramustine)、 異環(huán)憐醜胺（ifosfamide)、氮芥（mechlorethamine)、鹽酸氧氮芥（mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法侖（melphalan)、新氮芥（novembichin)、苯芥膽留醇 (phenesterine)、潑尼莫司?。╬rednimustine)、曲憐胺（trofosfamide)、尿啼陡氮芥 (uracil mustard);亞硝脲，例如卡莫司?。╟armustine)、氯脲菌素（chlorozotocin)、 福莫司?。╢otemustine)、洛莫司?。╨omustine)、尼莫司?。╪imustine)和雷莫司 ?。╮animnustine);抗生素，例如烯二炔抗生素（例如加利車霉素（calicheamicin)， 尤其是加利車霉素Y II和加利車霉素《 II ;達內(nèi)霉素（dynemicin)，包括達內(nèi)霉 素A;雙磷酸鹽，例如氯膦酸鹽（clodronate);埃斯波霉素（esperamicin);以及新制 癌菌素（neocarzinostatin)發(fā)色團和相關(guān)色蛋白烯二炔抗生素發(fā)色團、阿克拉霉素 (aclacinomysin)、放線菌素（actinomycin)、氨茴霉素（authrarnycin)、偶氮絲氨酸 (azaserine)、博來霉素（bleomycin)、放線菌素 C(cactinomycin)、卡拉比辛（carabicin)、 洋紅霉素（carminomycin)、嗜癌菌素（carzinophilin)、色霉素（chromomycinis)、放 線菌素 D (dactinomycin)、柔紅霉素（daunorubicin)、地托比星（detorubicin)、6_ 重 氮-5-氧代-L-正亮氨酸（6-diaz〇-5-〇x〇-L_norleucine)、阿霉素（doxorubicin)(包括 嗎啉代阿霉素、氰基嗎啉代阿霉素、2-批咯代阿霉素和脫氧阿霉素（deoxydoxorubicin))、 表柔比星（epirubicin)、依索比星（esorubicin)、伊達比星（idarubicin)、麻西羅霉 素（marcellomycin)、絲裂霉素（mitomycin)例如絲裂霉素C、霉酚酸（mycophenolic acid)、諾拉霉素（nogalarnycin)、橄欖霉素（olivomycin)、培洛霉素（peplomycin)、 紫菜霉素（potfiromycin)、卩票呤霉素（puromycin)、三鐵阿霉素（quelamycin)、羅多比 星（rodorubicin)、鏈黑菌素（streptonigrin)、鏈佐星（streptozocin)、殺結(jié)核菌素 (tubercidin)、烏苯美司（ubenimex)、凈司他?。▃inostatin)、佐柔比星（zorubicin); 抗代謝物，例如甲氨碟呤（methotrexate)和5-氟尿啼陡（5-FU);葉酸類似物，例如 二甲葉酸（denopterin)、蝶羅呤（pteropterin)、三甲曲沙（trimetrexate);卩票呤類 似物，例如氟達拉濱（fludarabine)、6_巰基卩票呤、硫咪卩票呤（thiamiprine)、硫鳥卩票呤 (thioguanine);啼陡類似物，例如安西他濱（ancitabine)、阿扎胞苷（azacitidine)、 6-氮尿苷、卡莫氟（carmofur)、阿糖胞苷（cytarabine)、雙脫氧尿苷（dideoxyuridine)、 脫氧氟尿苷（doxifluridine)、依諾他濱（enocitabine)、氟尿苷（floxuridine);雄激 素，例如卡魯睪酮（calusterone)、丙酸屈他雄酮（dromostanolone propionate)、環(huán)硫 雄醇（epitiostanol)、美雄焼（mepitiostane)、睪內(nèi)酯（testolactone);抗腎上腺，例 如米托坦（mitotane)、曲洛司坦（trilostane);葉酸補充劑，例如亞葉酸；醋葡醒內(nèi)酯 (aceglatone);醒磷酰胺糖苷（aldophosphamide glycoside);氨基乙酰丙酸；恩尿啼陡 (eniluracil);安 R丫陡（amsacrine);倍思塔布（bestrabucil);比生群（bisantrene); 依達曲沙（edatraxate);得弗伐胺（defofamine);地美可辛（demecolcine);地卩丫醌 (diaziquone);埃夫密辛（elformithine);乙酸依利醋銨（elliptinium acetate); 埃坡霉素（epothilone);依托格魯（etoglucid);硝酸鎵；輕基脲（hydroxyurea); 香燕多糖（lentinan);羅尼達寧（lonidainine);類美登素（maytansinoid)，例 如美登素（maytansine)和安絲菌素（ansamitocin);丙脒腙（mitoguazone);米 托蒽醌（mitoxantrone);莫比達摩（mopidanmol);硝拉維林（nitraerine);噴司 他?。╬entostatin);凡那明（phenamet);卩比柔比星（pirarubicin);洛索蒽醌 (losoxantrone);鬼曰酸（podophyllinic acid) ;2_ 乙酉先餅（2-ethylhydrazide);丙卡 巴肼（procarbazine) ;PSK多糖復(fù)合物；雷佐生（razoxane);根霉素（rhizoxin);西佐喃 (sizofiran);螺旋錯（spirogermanium);細(xì)交鏈抱菌酮酸（tenuazonic acid);三乙撐 亞胺苯醌（triaziquone) ;2,2'，2"-三氯三乙胺；單端孢霉烯（trichothecene)(尤其 是T-2毒素、弗納庫林A(verracurin A)、桿孢菌素A(roridin A)和胺癸盯（anguidine); 氨基甲酸乙酯（urethan);長春地辛（vindesine);達卡巴嗪（dacarbazine);甘露醇氮芥 (mannomustine);二溴甘露酉享（mitobronitol);二溴衛(wèi)矛酉享（mitolactol) ; (pipobroman); 哌泊溴焼（gacytosine);阿糖胞苷（"Ara-C"）；環(huán)磷酰胺；紫杉焼（taxoid)，例如紫 杉醇（paclitaxel)和多烯紫杉醇（docetaxel)吉西他濱（gemcitabine) ;6_硫鳥口票 呤；巰基嘌呤；鉬配位絡(luò)合物，例如順鉬（cisplatin)、奧沙利鉬（oxaliplatin)和卡 鉬（carboplatin);長春堿（vinblastine);鉬；依托泊苷（etoposide) (VP-16);異環(huán) 磷酰胺（ifosfamide);米托蒽醌；長春新堿（vincristine);長春瑞濱（vinorelbine); 諾凡特龍（novantrone);替尼泊苷（teniposide);依達曲沙（edatrexate);柔紅霉素 (daunomycin);氨基碟呤（aminopterin);希羅達（xeloda);伊班勝酸鹽（ibandronate); 伊立替康（irinotecan)(例如CPT-11);拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑RFS 2000;二氟甲基鳥氨酸 (DMF0);類視黃酸，例如視黃酸；卡培他濱（capecitabine);卡鉬（carboplatin)、普魯節(jié)肼 (procarbazine)、普卡霉素（plicomycin)、吉西他濱、諾維本（navelbine)、法尼基蛋白質(zhì) 轉(zhuǎn)移酶抑制劑、反鉬（transplatinum)和以上任一種的藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。
[0077] B?放射療法
[0078] 在本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案中，塞來昔布和卡倍他濱可以用于使細(xì)胞對放射療 法致敏。放射療法可以包括例如Y射線、X射線和/或?qū)⒎派湫酝凰刂苯舆f送到腫瘤細(xì) 胞。在某些情況下，根據(jù)本發(fā)明的方法也可以使用微波和/或UV照射。X射線的劑量范圍 在長時間（3到4周）50到200倫琴的日劑量到2000到6000的單次劑量倫琴范圍內(nèi)。放 射性同位素的劑量范圍變化廣泛，且取決于同位素的半衰期、所發(fā)出的放射的強度和類型 和贅生性細(xì)胞的攝取。
[0079] 術(shù)語"接觸"和"暴露"當(dāng)應(yīng)用于細(xì)胞時在本文中用于描述將治療性構(gòu)建體和化學(xué) 治療劑或放射治療劑遞送到靶細(xì)胞中或與靶細(xì)胞直接并置的過程。為了實現(xiàn)細(xì)胞殺死或停 滯，將兩種藥劑以有效殺死細(xì)胞或防止其分裂的組合量遞送到細(xì)胞中。
[0080] C.抗激素藥劑
[0081] 在某些方面，另一抗癌療法是抗激素療法，其用于調(diào)控或抑制激素對腫瘤的作 用，例如抗雌激素和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑（SERM)，包括例如他莫西芬（tamoxifen)、 雷洛昔芬（raloxifene)、屈洛昔芬（droloxifene)、4-輕基他莫西芬、曲沃昔芬 (trioxifene)、雷洛昔芬鹽酸鹽（keoxifene)、LY117018、奧那司酮（onapristone)和托 瑞米芬（toremifene);抑制芳香酶的芳香酶抑制劑，其調(diào)控腎上腺中的雌激素產(chǎn)生，例如 4(5)-咪唑、氨魯米特（aminoglutethimide)、乙酸甲地孕酮（megestrol acetate)、依西 美坦（exemestane)、福美坦（formestanie)、法曲唑（fadrozole)、伏氯唑（vorozole)、來 曲唑（letrozole)和阿那曲唑（anastrozole);和抗雄激素，例如氟他胺（flutamide)、 尼魯米特（nilutamide)、比卡魯胺（bicalutamide)、亮丙瑞林（leuprolide)和戈舍瑞林 (goserelin);以及曲沙他濱（troxacitabine) (1,3-二氧戊環(huán)核苷胞啼陡類似物）；反義寡 核苷酸，尤其是那些抑制異常細(xì)胞增殖所涉及的信號傳導(dǎo)通道中的基因表達的反義寡核苷 酸，例如PKC- a、Ralf和H-Ras ;核糖酶，例如VEGF表達抑制劑和HER2表達抑制劑；疫苗， 例如基因療法疫苗和以上任一種的藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。
[0082] D.免疫療法藥劑
[0083] 在一些中，另一抗癌療法是免疫療法。免疫治療劑一般依靠使用免疫效應(yīng)細(xì)胞和 分子靶向并破壞癌細(xì)胞。免疫效應(yīng)物可以是例如對于腫瘤細(xì)胞表面上的一些標(biāo)志物具有特 異性的抗體?？贵w單獨可以用作療法的效應(yīng)物或其可以募集其它細(xì)胞以實際上實現(xiàn)細(xì)胞殺 死?？贵w也可以綴合于藥物或毒素（化學(xué)治療劑、放射性核素、篦麻毒素A鏈、霍亂毒素、百 日咳毒素等）并且僅用作靶向劑?？蛇x地，效應(yīng)物可以是帶有直接或間接與腫瘤細(xì)胞靶相 互作用的表面分子的淋巴細(xì)胞。多種效應(yīng)細(xì)胞包括細(xì)胞毒性T細(xì)胞和NK細(xì)胞。
[0084]在一些實施方案中，免疫療法可以包括向患者施用一種或多種腫瘤抗原（例如癌 癥疫苗）或使患者的免疫細(xì)胞暴露于癌癥抗原（例如自體細(xì)胞免疫療法）?？捎糜谥委熜?方法中的抗原包括（但不限于）前列腺酸磷酸酶（PAP)、MUCl、HER2/neu、5T4(例如從牛痘 病毒載體表達的5T4)和整個殺死的癌細(xì)胞。
[0085] 一般來說，腫瘤細(xì)胞必須帶有適于靶向的某一種標(biāo)志物，即不存在于大多數(shù)其它 細(xì)胞上。存在許多腫瘤標(biāo)志物且這些腫瘤標(biāo)志物中的任一種在本發(fā)明文中可以適于靶向。 常見腫瘤標(biāo)志物包括癌胚抗原、前列腺特異性抗原、泌尿器腫瘤相關(guān)抗原、胚胎性抗原、酪 氨酸酶（p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸化路易斯寡糖抗原（Sialyl Lewis Antigen)、 MucA、MucB、PLAP、雌激素受體、層粘連蛋白受體、erb B和pl55。
[0086] E?基因療法
[0087] 在一些實施方案中，另一抗癌療法是基因療法（例如治療性多核苷酸組合物）。用 于表達基因產(chǎn)物的病毒載體在本領(lǐng)域中是眾所周知的，且包括真核表達系統(tǒng)，例如腺病毒、 腺病毒相關(guān)病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、皰疹病毒、慢病毒、痘病毒（包括牛痘病毒）和人乳頭狀瘤病 毒（包括SV40)?？蛇x地，施用表達構(gòu)建體可以用基于脂質(zhì)的載體（例如脂質(zhì)體或D0TAP: 膽固醇小泡）來完成。所有這些方法在本領(lǐng)域中都是眾所周知（參見例如Sambrook等 人，1989 ;Ausubel 等人，1998 ;Ausubel, 1996)。
[0088] 遞送編碼以下基因產(chǎn)物之一的載體將對靶組織具有組合的抗過度增生作用。
[0089] E?手術(shù)療法
[0090] 在一些方面，另一抗癌療法是手術(shù)療法（例如在手術(shù)切除術(shù)腫瘤之前或期間）。約 60%患癌癥的人將經(jīng)受某一類型的手術(shù)，其包括預(yù)防性、診斷性或分期性、治愈性和減輕性 手術(shù)。洽愈性手術(shù)是可以結(jié)合其它療法的癌癥治療使用，例如本發(fā)明的治療、化學(xué)療法、放 射療法、激素療法、基因療法、免疫療法和/或替代性療法。
[0091] 洽愈性手術(shù)包括切除術(shù)，其中從身體上除去、割去和/或破壞癌性組織的全部或 一部分。腫瘤切除術(shù)是指從身體上除去腫瘤的至少一部分。除腫瘤切除術(shù)以外，通過手術(shù) 治療包括激光手術(shù)、冷凍手術(shù)、電手術(shù)和顯微鏡控制手術(shù)（莫氏手術(shù)（Mohs'surgery))。另 外預(yù)期本發(fā)明可以結(jié)合除去淺表癌、癌前期或次要量的正常組織使用。
[0092] 在切除部分或所有癌細(xì)胞、組織或腫瘤時，可能會在身體內(nèi)形成空腔?？梢酝ㄟ^用 另一抗癌療法對區(qū)域進行灌注、直接注射或局部施用來完成治療?？梢灾貜?fù)該治療，例如每 1、2、3、4、5、6 或 7 天一次，或每 1、2、3、4 和 5 周一次，或每 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11 或 12 個月一次。這些治療也可以具有不同劑量。
[0093]F.其它治療劑
[0094] 在一些實施方案中，其它抗癌療法包括施用另一藥劑，例如消炎劑。消炎劑在本文 中定義成是指已知或懷疑在治療或預(yù)防受試者的發(fā)炎時有益的藥劑。皮質(zhì)類固醇是一類主 要消炎劑。皮質(zhì)類固醇可以是短效、中效或長效的，并且可以各種方法遞送。本發(fā)明中所涵 蓋的皮質(zhì)類固醇的非限制性清單包括口服皮質(zhì)類固醇，例如：可的松（cortisone)、氫化可 的松（hydrocortisone)、強的松（prednisone)和地塞米松（dexamethasone)。
[0095] 另一類主要消炎劑是非類固醇消炎劑。非類固醇消炎劑包括一類用于治療發(fā)炎 和疼痛的藥物。這一類藥物的準(zhǔn)確作用方式是未知的。這一類藥劑的成員的實例包括 (但不限于）布洛芬（ibuprofen)、酮洛芬（ketoprofen)、氟比洛芬（flurbiprofen)、萘 丁美酮（nabumetone)、批羅昔康（piroxicam)、萘普生、雙氯芬酸（diclofenac)、卩引哚美辛 (indomethacin)、舒林酸（sulindac)、托美?。╰olmetin)、依托度酸（etodolac)、氟滅酸 (flufenamic acid)、二氟苯水楊酸（diflunisal)、奧沙普秦（oxaprozin)、羅非昔布和塞來 昔布。本領(lǐng)域技術(shù)人員將熟悉這些藥劑。這個種類中包括水楊酸鹽和水楊酸鹽的衍生物， 例如乙酰水楊酸、水楊酸鈉、膽堿水楊酸鹽、膽堿水楊酸鎂和二氟苯水楊酸。
[0096] 其它消炎劑包括抗風(fēng)濕病藥劑，例如金鹽（例如硫代蘋果酸金鈉（gold sodium thiomalate)、金硫代葡萄糖（aurothioglucose)和金諾芬（auranofin))、抗風(fēng)濕病藥劑 (例如氯奎（chloroquine)、輕氯奎（hydroxychloroquine)和青霉胺（penicillamine))、 抗組胺劑（例如苯海拉明（diphenhydramine)、氯芬胺（chlorpheniramine)、氯馬斯汀 (clemastine)、輕嗪和曲普利陡（triprolidine))和免疫抑制劑（例如甲氨碟呤、氮芥、環(huán) 磷酰胺、苯丁酸氮芥、環(huán)孢素和咪唑硫嘌呤）。本發(fā)明所涵蓋的其它免疫抑制劑是他克莫司 (tacrolimus)和依維莫司（everolimus)。他克莫司抑制干擾與T細(xì)胞活化相關(guān)的白細(xì)胞 介素-2產(chǎn)生，抑制細(xì)胞毒性T細(xì)胞的分化和增殖。如今，其是世界公認(rèn)的免疫抑制劑療法 的基礎(chǔ)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將熟悉這些藥劑，和這一類藥劑的其它成員，以及這些藥劑的作用 機制和關(guān)于使用這些藥劑的指示。
[0097] 預(yù)期其它藥劑可以用作其它抗癌療法或與本發(fā)明實施方案組合。這些其它藥劑包 括免疫調(diào)節(jié)劑、影響細(xì)胞表面受體上調(diào)和GAP連接的藥劑、細(xì)胞抑制和分化劑、細(xì)胞粘著抑 制劑或增加過度增生細(xì)胞對細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑的敏感性的藥劑。免疫調(diào)節(jié)劑包括腫瘤壞死 因子；干擾素a、0和 Y ;IL_2和其它細(xì)胞因子；F42K和其它細(xì)胞因子類似物；或MIP-1、 MIP-10、MCP-1、RANTES和其它趨化因子。另外預(yù)期細(xì)胞表面受體或其配體（例如Fas/Fas 配體、DR4或DR5/TRAIL)的上調(diào)將通過對過度增生細(xì)胞形成自分泌或旁分泌作用而加強本 發(fā)明的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)能力。通過提高GAP連接數(shù)目來增加細(xì)胞間信號傳導(dǎo)將增加對相鄰過 度增生細(xì)胞群體的抗過度增生作用。在其它實施方案中，細(xì)胞抑制或分化劑可與本發(fā)明組 合用于改善治療的抗過度增生功效。預(yù)期細(xì)胞粘著抑制劑改善本發(fā)明的功效。細(xì)胞粘著抑 制劑的實例是黏著斑激酶（FAK)抑制劑和洛弗斯特?。↙ovastatin)。另外預(yù)期增加過度增 生細(xì)胞對細(xì)胞凋亡的敏感性的其它藥劑（例如抗體c225)可與本發(fā)明組合用于改善治療功 效。
[0098] IV?治療性施用
[0099] 在一些實施方案中，向患者施用有效量的抗癌劑或其組合（例如塞來昔布和卡倍 他濱）。如本文中所使用，術(shù)語"有效量"是定義為導(dǎo)致當(dāng)單獨施用或與另一細(xì)胞毒性療法 組合時施用其的患者的生理變化所必需的本發(fā)明的塞來昔布和/或卡倍他濱的量。如本文 中所使用，術(shù)語"治療有效量"是定義為消除、減少、延緩或最小化疾病的副作用（例如癌癥 或HFS)的塞來昔布和卡倍他濱的量。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易認(rèn)識到在很多情況下，本發(fā)明的 方法可能不會提供治愈，而是僅可能提供部分益處，例如減輕或改善至少一種癥狀。在一些 實施方案中，具有一些益處的生理變化也被視為治療有益的。另外應(yīng)清楚治療有效量可取 決于包括同時或依序施用其它治療性方案。因此，應(yīng)了解在某些實施方案中，物理變化可以 使得第二治療性治療有效性增強。
[01 00] 舉例來說，塞來昔布和卡倍他濱可以自身或以藥物組合物的形式向受試者施用以 治療癌癥。藥物組合物可以常規(guī)方式使用有助于將蛋白質(zhì)加工成在藥學(xué)上可以使用的制劑 的一種或多種生理上可接受的載劑、稀釋劑、賦形劑或助劑來配制。適當(dāng)配制是取決于所選 施用途徑。
[0101] 在一些方面，本發(fā)明的方法涉及全身制劑，包括那些設(shè)計成用于通過注射（例如 皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、鞘內(nèi)或腹膜內(nèi)注射）施用的制劑，以及那些設(shè)計成用于經(jīng)皮、經(jīng)粘 液、吸入、經(jīng)口或經(jīng)肺施用的制劑。在最優(yōu)選實施方案中，塞來昔布和卡倍他濱是通過經(jīng)口 施用來遞送。
[0102] 關(guān)于注射，可以將本發(fā)明的蛋白質(zhì)配制在水性溶液中，優(yōu)選地在生理上相容的緩 沖液中，例如漢氏溶液（Hanks'solution)、任氏溶液（Ringer's solution)或生理鹽水緩 沖液。溶液可以含有配制劑，例如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。
[0103] 可選地，蛋白質(zhì)可以呈粉末形式以在使用之前用合適的媒介物（例如無菌的無熱 原水）復(fù)原。
[0104] A.有效劑量
[0105] 實施方案的抗癌療法（例如塞來昔布和卡倍他濱）一般將以有效實現(xiàn)預(yù)期目的的 量使用。為了用于治療或預(yù)防疾病病狀，本發(fā)明的分子或其藥物組合物是以治療有效量施 用或應(yīng)用。治療有效量是有效改善或預(yù)防所治療患者的癥狀或延長其存活期的量。治療 有效量的測定完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)，尤其根據(jù)本文中所提供的詳細(xì)公開內(nèi) 容。
[0106] 對于全身施用，治療有效劑量可以最初從體外分析來估計。舉例來說，劑量可以在 動物模型中配制以實現(xiàn)循環(huán)濃度范圍，包括如在細(xì)胞培養(yǎng)所測定的IC50。該信息可用于更 精確地測定適用于人類的劑量。
[0107] 初始劑量也可以使用在本領(lǐng)域中眾所周知的技術(shù)從體內(nèi)數(shù)據(jù)（例如動物模型）來 估計。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地基于動物數(shù)據(jù)優(yōu)化對人類的施用。
[0108] 劑量和時間間隔可以個別調(diào)整以提供足以維持治療作用的分子的血漿水平。用于 通過注射施用的常用患者劑量在每天約0. 1到5mg/kg、優(yōu)選地每天約0. 5到lmg/kg的范圍 內(nèi)。治療有效血清水平可以通過每天施用多次劑量來實現(xiàn)。
[0109] 在局部施用或選擇吸收的情況下，蛋白質(zhì)的有效局部濃度可能與血漿濃度無關(guān)。 本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠優(yōu)化治療有效局部劑量而無需過度實驗。
[0110] 當(dāng)然，施用分子的量將取決于所治療的受試者、受試者的體重、痛苦的嚴(yán)重程度、 施用方式和主治醫(yī)生的判斷。
[0111] 當(dāng)可檢測到癥狀或即使當(dāng)其不可檢測到時，可以間歇地重復(fù)療法。療法可以單獨 提供或與其它藥物組合提供。
[0112] B.毒性
[0113] 優(yōu)選地，抗癌療法（例如塞來昔布/卡倍他濱組合療法）的治療有效劑量將提供 治療益處而不會引起明顯毒性。
[0114] 本文中所述的分子的毒性可以通過標(biāo)準(zhǔn)藥物程序在細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒瀯游镏袦y 定，例如通過測定LD50(群體50%的致死劑量）或LD100 (群體100%的致命劑量）。有毒 和治療作用之間的劑量比是治療指數(shù)。展現(xiàn)高治療指數(shù)的蛋白質(zhì)是優(yōu)選的。從這些細(xì)胞培 養(yǎng)分析和動物研究獲得的數(shù)據(jù)可用于配制無毒性以用于人類的劑量范圍。本文中所述的蛋 白質(zhì)的劑量優(yōu)選地在循環(huán)濃度范圍內(nèi)，包括具有極小毒性或無毒性的有效劑量。劑量可以 在這一范圍內(nèi)變化，取決于所用劑型和所用施用途徑。精確配制、施用途徑和劑量可以通過 個別醫(yī)生鑒于患者病狀來選擇。（參見例如Fingl等人，1975)。
[0115] C?藥物制劑
[0116] 本發(fā)明的藥物組合物可以包含溶解或分散于藥學(xué)上可接受的載劑中的有效量的 抗癌劑或其組合（例如塞來昔布和卡倍他濱）。短語"藥學(xué)上或藥理學(xué)上可接受的"是指當(dāng) 酌情施用于動物（例如人類）時不會產(chǎn)生不利、過敏或其它不良反應(yīng)的分子實體和組合物。 藥物組合物的制備將根據(jù)本公開而為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知，如以引用的方式并入本文中 的 Remington's Pharmaceutical Sciences,第 18 版 Mack Printing Company, 1990 所不 例。此外，對于動物（例如人類）施用，應(yīng)了解制劑將滿足如FDA生物標(biāo)準(zhǔn)辦公室所需的無 菌、致熱、一般安全性和純度標(biāo)準(zhǔn)。
[0117] 如本文中所使用，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的，"藥學(xué)上可接受的載劑"包括任何 和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、表面活性劑、抗氧化劑、防腐劑（例如抗菌劑、抗真菌劑）、等 張劑、吸收延遲劑、鹽、防腐劑、藥物、藥物穩(wěn)定劑、凝膠、粘合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、 甜味劑、調(diào)味劑、染料、這類類似材料和其組合（參加例如Remington's Pharmaceutical Sciences,第 18 版 Mack Printing Company, 1990，第 1289-1329 頁，其以引用的方式并入 本文中）。除非任何常規(guī)載劑與活性成分不相容，否則預(yù)期將其用于治療或藥物組合物中。
[0118] 本發(fā)明的組合物可以包含不同類型的載劑，這取決于其是以固體、液體還是氣溶 膠形式施用，和其是否需要無菌以用于例如注射的施用途徑。本發(fā)明可以通過以下方式 施用：靜脈內(nèi)，皮內(nèi)，動脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，病灶內(nèi)，顱內(nèi)，關(guān)節(jié)內(nèi)，前列腺內(nèi)，胸膜內(nèi)，氣管內(nèi)，鼻 內(nèi)，玻璃體內(nèi)，陰道內(nèi)，直腸內(nèi)，表面，腫瘤內(nèi)，肌肉內(nèi)，腹膜內(nèi)，皮下，結(jié)膜下，血管內(nèi)，粘膜 內(nèi)，心包內(nèi)，臍內(nèi)，眼內(nèi)，經(jīng)口，表面，局部，吸入（例如氣溶膠吸入），注射，輸注，連續(xù)輸注， 直接、經(jīng)由導(dǎo)管、經(jīng)由灌洗、以軟膏形式、以脂質(zhì)組合物（例如脂質(zhì)體）形式沐浴靶細(xì)胞的 局部灌注，或通過其它方法或上述方法的任何組合，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知（參見例如 Remington's Pharmaceutical Sciences,第 18 版 Mack Printing Company, 1990,其以弓 | 用的方式并入本文中）。
[0119] 向動物患者施用的本發(fā)明的組合物的實際劑量可以通過身體和生理學(xué)因素來測 定，例如體重、病灶的嚴(yán)重程度、所治療的疾病類型、先前或同時的治療性介入、患者的特發(fā) 病和施用途徑。負(fù)責(zé)施用的開業(yè)醫(yī)生將會在任何情況下測定組合物中的活性成分的濃度和 用于個別受試者的適當(dāng)劑量。
[0120] 在某些實施方案中，藥物組合物可以包含例如至少約0. 1%的活性化合物。在其 它實施方案中，活性化合物可以占單位重量的約2%到約75%或例如約25%到約60%，和 從其中可得到的任何范圍。在其它非限制性實例中，劑量也可以包含約5mg/kg/體重到約 100mg/kg/體重、約5微克/kg/體重到約500毫克/kg/體重等，可以基于如上文所述的數(shù) 量來施用。
[0121] 在任何情況下，組合物可以包含多種抗氧化劑以延遲一種或多種組分的氧化。另 夕卜，防止微生物的作用可以通過防腐劑來實現(xiàn)，例如多種抗菌劑和抗真菌劑，包括（但不限 于）對羥苯甲酸酯（例如對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯）、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫 柳汞或其組合。
[0122] 在根據(jù)本發(fā)明的組合物以液體形式提供的實施方案中，載劑可以是溶劑或分散介 質(zhì)，包含（但不限于）水、乙醇、多元醇（例如甘油、丙二醇、液體聚乙二醇等）、脂質(zhì)（例如 甘油三酯、植物油、脂質(zhì)體）和其組合?？梢跃S持適當(dāng)?shù)牧鲃有裕缤ㄟ^使用包衣，例如卵 磷脂；通過分散于載劑（例如液體多元醇或脂質(zhì)）中來維持所需粒徑；通過使用表面活性 齊IJ，例如羥丙基纖維素；或此類方法的組合。在許多情況下，其將優(yōu)選包括等張劑，例如糖、 氯化鈉或其組合。
[0123] 無菌可注射溶液是通過視需要將所需量的活性化合物與以上所列舉的多種其它 成分合并在適當(dāng)溶劑中，隨后過濾滅菌來制備。一般來說，分散液是通過將多種無菌活性成 分合并到含有基礎(chǔ)分散介質(zhì)和/或其它成分的無菌媒介物中而制備的。在用于制備無菌可 注射溶液、懸浮液或乳液的無菌粉末的情況下，優(yōu)選制備方法是真空干燥或凍干技術(shù)，其由 其先前無菌過濾的液體介質(zhì)產(chǎn)生活性成分加上任何其它所需成分的粉末。必要時，液體介 質(zhì)應(yīng)適當(dāng)?shù)亟?jīng)過緩沖，且在注射之前首先用足夠生理鹽水或葡萄糖使液體稀釋劑等張。還 涵蓋用于直接注射的高度濃縮組合物的制備，其中使用DMS0作為溶劑導(dǎo)致極快的滲透，從 而將高濃度的活化劑遞送到小區(qū)域中。
[0124] 組合物必須在制造和貯存條件下是穩(wěn)定的，并且防止微生物（例如細(xì)菌和真菌） 的污染作用。應(yīng)了解內(nèi)毒素污染應(yīng)在安全水平下保持最低程度，例如小于〇. 5ng/mg蛋白 質(zhì)。
[0125] 在特定實施方案中，可注射組合物的長時間吸收可以通過在組合物中使用延遲吸 收的藥劑（例如單硬脂酸鋁、明膠或其組合）來實現(xiàn)。
[0126] V.實施例
[0127] 包括以下實施例以說明本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，以下實 施例中所公開的技術(shù)表示
【發(fā)明者】所發(fā)現(xiàn)的技術(shù)在本發(fā)明的實踐中發(fā)揮良好作用，且因此可 以被認(rèn)為構(gòu)成用于其實踐的優(yōu)選方式。然而，根據(jù)本公開，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，可以在 不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下在所公開的特定實施方案中進行許多改變且仍然獲 得同樣或類似結(jié)果。
[0128] 實施例1
[0129] 研究1的材料和方法
[0130] 患者
[0131] 得克薩斯大學(xué)（University of Texas)M. D. Anderson癌癥中心的機構(gòu)審查委員會 批準(zhǔn)了這一回顧性擴展群組研究。在2000年10月和2003年12月之間，七十四位轉(zhuǎn)移性 結(jié)腸直腸癌患者接受了卡培他濱和同時接受了塞來昔布（n = 66)或羅非昔布（n = 2)、布 洛芬（n = 2)、舒林酸（n = 2)和大劑量阿司匹林（aspirin) (n = 2)。這項研究分析了接 受卡培他濱和塞來昔布（XCEL)的六十六位患者。
[0132] 治療
[0133] 除了以1250mg/m2/d b. i. d開始的四位患者和以900mg/m2/d b. i. d開始的六位 老年患者，未接受同時放射療法的患者經(jīng)口接受每天兩次（b. i. d) 1000mg/m2/d劑量的卡 培他濱，每21天持續(xù)14天。接受放射療法的所有34位患者都接受了 1000mg/m2/d b. i. d 的卡培他濱。在放射期間的周一到周五且繼續(xù)l〇〇〇mg/m2/d b. i.d.的卡培他濱，每21天持 續(xù)14天。以3-D適形規(guī)劃技術(shù)使用18MV光子將放射遞送到靶區(qū)域。放射劑量是35-40Gy(n =18)或>45Gy(n = 15)，其中一位患者缺少放射劑量。所有66位患者都接受了連續(xù)口服 塞來昔布200mg b. i. d，其中一個目標(biāo)是減輕卡培他濱誘發(fā)性HFS ;而所有患者都具有與腫 瘤（n = 37)或肌骨胳系統(tǒng)（n = 29)有關(guān)的疼痛。十五位患者需要其它阿片類物質(zhì)。在這 一研究期間無患者接受吡哆醇，有反應(yīng)的患者（那些癌胚抗原（CEA)水平下降、疼痛控制改 善或腫瘤大小穩(wěn)定或減小的患者）繼續(xù)XCEL直到其經(jīng)歷完全緩解、疾病進展或無法忍受的 副作用。所有患者都經(jīng)歷由放射和/或塞來昔布引起的疼痛減輕，但未在所有患者中進行 形式上的疼痛評分。塞來昔布與卡培他濱一起繼續(xù)防止HFS并改善存活期。在對單獨XCEL 或XCEL和放射起反應(yīng)后，在腫瘤變得相當(dāng)大后，六位患者以治愈目的對其腫瘤進行了切除 且四位患者在術(shù)后服用XCEL ;兩位患者進行了射頻消融術(shù)且一位患者對原發(fā)性結(jié)腸進行 了減輕性切除。
[0134] 評估和定義
[0135] 使所有患者經(jīng)受常規(guī)臨床檢查、實驗室分析和計算機斷層分析。如果原地治療， 則在放射療法期間每周檢查患者，或每6-9周隨身體檢查、實驗室測試和計算機斷層分析 而檢查患者。使用國家衛(wèi)生研究院（National Institutes of Health)的常見毒性標(biāo)準(zhǔn) (Common Toxicities Criteria ;CTC) 2.0版來對治療相關(guān)毒性進行分級。使用RECIST標(biāo) 準(zhǔn)評估腫瘤反應(yīng)。完全反應(yīng)是定義為可測量或可評估疾病的完全影像學(xué)消失或穩(wěn)定的最小 影像學(xué)發(fā)現(xiàn)；部分反應(yīng)是定義為可測量疾病的最長尺寸減小至少50% ;穩(wěn)定疾病是定義為 最長尺寸減小不到25% ;這些反應(yīng)或穩(wěn)定必須至少通過3個月時間間隔評估來證實；進行 性疾病是定義為腫瘤的最長尺寸生長超過25%或發(fā)展新病變?？偡磻?yīng)率是定義為完全和 部分反應(yīng)率的總和且腫瘤控制率是定義為總反應(yīng)率與穩(wěn)定疾病率的總和。死亡日期是通過 癌癥登記或通過在社會保障死亡索引（Social Security Death Index) (ssdi. genealogy. rootsweb. com)中搜索患者社會保障號來確定。數(shù)據(jù)收集的截止點是2004年4月。
[0136] 統(tǒng)計分析
[0137] 連續(xù)變量是使用平均值（土標(biāo)準(zhǔn)偏差）或中值（范圍）來概括。使用威爾科克森 秩和檢驗（Wilcoxon rank-sum test)對患者亞組（放射、手術(shù)、高或低乳酸脫氫酶（LDH) 和高或低CEA)的這些變量進行比較。分類變量概括于頻率表中。視情況使用卡方檢驗 (chi-square test)或費雪精確檢驗（Fisher's exact test)對這些變量的重要亞組進行 比較。無進展存活期是定義為從開始XCEL療法到疾病進展或任何原因引起的死亡的時間。 總存活期是定義為從開始XCEL療法到任何原因引起的死亡的時間。如果患者未有進展或 死亡，那么在最后隨訪日檢查患者。使用Kaplan和Meier的方法概括無進展和總存活期分 布。使用時序檢驗（log-rank test)分析亞組的無進展和總存活期差異。使用比例風(fēng)險 (Cox)回歸模型評估無進展存活期和總存活期的預(yù)測值的多變量模型。P〈0. 05被視為統(tǒng)計 上顯著的。
[0138] 實施例2
[0139] 組合療法的作用（研究1)
[0140] 患者的基線臨床和治療特征概括在表1中。接受弟一線XCEL的24位患者的中值 年齡是73歲（范圍是45-86歲），且7位患者是78歲或78歲以上。在接受XCEL作為第二 線療法的42患者中，9位仍然對第一線治療有反應(yīng)或?qū)谝亮⑻婵档闹委熋舾校溆?3 位患者的疾病在第一線治療期間有進展。接受放射的34位患者中有二十四位（71 % )先前 接受第一線化學(xué)療法。
[0141]復(fù)1
[0142] 某線患者、疾病和治療特征（n=21)

【權(quán)利要求】
1. 一種用于在受試者中測定對抗癌療法的完全反應(yīng)的體外方法，其包括： (a) 測定已經(jīng)經(jīng)受或正在經(jīng)受治療結(jié)腸直腸癌的抗癌療法的受試者的生物樣品中的 ⑶133 RNA表達水平，所述療法包括施用氟胞苷衍生物和C0X-2酶抑制劑；和 (b) 如果所述樣品中的所述CD133 RNA表達水平（i)當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH RNA水平時小 于約0.56,或（ii)小于來自無癌癥對照的樣品中的CD133 RNA表達水平，那么將所述受試 者鑒別為對所述抗癌療法具有完全反應(yīng)。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其包括如果所述樣品中的所述⑶133 RNA表達水平小于 來自無癌癥對照的樣品中的⑶133 RNA表達水平的一半，那么將所述受試者鑒別為對所述 抗癌療法具有完全反應(yīng)。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其包括如果所述樣品中的所述⑶133 RNA表達水平小于 來自無癌癥對照的樣品中的⑶133 RNA表達水平的三分之一，那么將所述受試者鑒別為對 所述抗癌療法具有完全反應(yīng)。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中將所述受試者鑒別為對所述抗癌療法具有完全反應(yīng) 包括所述受試者對所述抗癌療法已經(jīng)具有完全反應(yīng)的報告。
5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述報告是書面或電子報告。
6. 如權(quán)利要求4所述的方法，其包括向所述受試者、健康護理提供者或保險公司報告。
7. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述無癌癥對照是年齡匹配對照。
8. -種檢測受試者中的癌癥干細(xì)胞的生物標(biāo)志物的體外方法，其包括： (a) 測定已經(jīng)經(jīng)受或正在經(jīng)受治療結(jié)腸直腸癌的抗癌療法的受試者的生物樣品中的 ⑶133 RNA表達水平，所述療法包括施用氟胞苷衍生物和COX-2酶抑制劑；和 (b) 如果所述樣品中的所述CD133 RNA表達水平當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH RNA水平時大于約 0. 56,那么將所述受試者鑒別為具有癌癥干細(xì)胞的生物標(biāo)志物。
9. 如權(quán)利要求8或1所述的方法，其中所述生物樣品是血清樣品。
10. 如權(quán)利要求8或1所述的方法，其中測定⑶133 RNA表達包括核酸雜交。
11. 如權(quán)利要求8或1所述的方法，其中測定⑶133 RNA表達包括RT-PCR。
12. 如權(quán)利要求8所述的方法，其進一步包括如果所述樣品中的所述⑶133 RNA表達水 平當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH RNA水平時小于約0. 56,那么將所述受試者鑒別為不具有癌癥干細(xì)胞 的生物標(biāo)志物。
13. 如權(quán)利要求8所述的方法，其進一步包括測定所述樣品中的至少第二種基因的表 達水平。
14. 如權(quán)利要求13所述的方法，其進一步包括測定所述受試者的生物樣品中的CEA、 CK19或CK20的表達水平，其中相對于對照水平CEA、CK19或CK20的表達水平升高指示受 試者中存在癌癥干細(xì)胞的生物標(biāo)志物。
15. 如權(quán)利要求8所述的方法，其中將所述受試者鑒別為具有癌癥干細(xì)胞的生物標(biāo)志 物包括所述受試者具有癌癥干細(xì)胞的生物標(biāo)志物的報告。
16. 如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述報告是書面或電子報告。
17. 如權(quán)利要求8所述的方法，其進一步包括如果所述樣品中的所述⑶133 RNA表達水 平當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH RNA水平時大于約0. 56,那么將所述受試者鑒別為具有癌癥干細(xì)胞。
18. 如權(quán)利要求17所述的方法，其進一步包括報告所述受試者是否具有癌癥干細(xì)胞。
19. 如權(quán)利要求8所述的方法，其進一步包括如果所述樣品中的所述⑶133 RNA表達水 平當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH RNA水平時小于約0. 56,那么將所述受試者鑒別為對所述抗癌療法具 有完全反應(yīng)。
20. 如權(quán)利要求19所述的方法，其進一步包括報告所述受試者是否對所述抗癌療法具 有完全反應(yīng)。
21. -種用于治療受試者的方法，其包括： a) 選擇如下受試者：已經(jīng)接受或正在接受治療結(jié)腸直腸癌的抗癌療法，所述療法包括 施用氟胞苷衍生物和COX-2酶抑制劑；且經(jīng)測定具有如下⑶133 RNA表達水平：（i)當(dāng)標(biāo)準(zhǔn) 化為GAPDH RNA水平時大于約0. 56 ;或（ii)大于來自無癌癥對照的樣品中的CD133 RNA表 達水平；和 b) 向所述受試者施用另一抗癌療法。
22. 如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述另一抗癌療法包括用氟胞苷衍生物和COX-2 酶抑制劑治療。
23. 如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述另一抗癌療法包括放射療法、化學(xué)療法、免疫 療法或手術(shù)。
24. 如權(quán)利要求21所述的方法，其中選擇受試者包括測量所述受試者的CD133 RNA表 達水平。
25. 如權(quán)利要求21所述的方法，其包括選擇經(jīng)測定具有當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH RNA水平時 大于約0. 56的⑶133 RNA表達水平的受試者。
26. 如權(quán)利要求25所述的方法，其包括選擇經(jīng)測定具有當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH RNA水平時 介于約0. 56和7. 0之間的⑶133 RNA表達水平的受試者。
27. 如權(quán)利要求21所述的方法，其包括選擇經(jīng)測定具有大于來自無癌癥對照的樣品的 ⑶133 RNA表達水平的⑶133 RNA表達水平的受試者。
28. 如權(quán)利要求27所述的方法，其包括選擇經(jīng)測定具有比來自無癌癥對照的樣品的 ⑶133 RNA表達水平高不到10倍的⑶133 RNA表達水平的受試者。
29. 如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述無癌癥對照是年齡匹配對照。
30. 如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述結(jié)腸直腸癌是轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌。
31. 如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述結(jié)腸直腸癌是具有結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直 腸癌。
32. 如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述氟胞苷衍生物是卡培他濱。
33. 如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述COX-2酶抑制劑是美洛昔康、伐地昔布、塞來 昔布、羅非昔布或萘普生。
34. 如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述COX-2酶抑制劑是塞來昔布。
35. 如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述受試者進一步經(jīng)測定具有相對于對照水平的 升高的CEA、CK19或CK20表達水平。
36. -種確定受試者是否需要另一抗癌療法的體外方法，其包括： (a) 測定已經(jīng)經(jīng)受或正在經(jīng)受治療結(jié)腸直腸癌的抗癌療法的受試者的生物樣品中的 ⑶133 RNA表達水平，所述療法包括施用氟胞苷衍生物和COX-2酶抑制劑；和 (b) 如果所述樣品中的所述CD133 RNA表達水平（i)當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH RNA水平時大 于約0.56,或（ii)大于來自無癌癥對照的樣品中的CD133 RNA表達水平，那么將所述受試 者鑒別為需要另一抗癌療法。
37. 如權(quán)利要求36所述的方法，其包括如果所述樣品中的所述⑶133 RNA表達水平當(dāng) 標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH RNA水平時大于約0. 56,那么將所述受試者鑒別為需要另一抗癌療法。
38. 如權(quán)利要求37所述的方法，其包括如果所述樣品中的所述⑶133 RNA表達水平當(dāng) 標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH RNA水平時介于約0. 56和7. 0之間，那么將所述受試者鑒別為需要另一抗 癌療法。
39. 如權(quán)利要求36所述的方法，其包括如果所述樣品中的所述⑶133 RNA表達水平大 于來自無癌癥對照的樣品中的⑶133 RNA表達水平，那么將所述受試者鑒別為需要另一抗 癌療法。
40. 如權(quán)利要求39所述的方法，其包括如果所述樣品中的所述⑶133 RNA表達水平比 來自無癌癥對照的樣品中的⑶133 RNA表達水平高不到10倍，那么將所述受試者鑒別為需 要另一抗癌療法。
41. 如權(quán)利要求36所述的方法，其中所述無癌癥對照是年齡匹配對照。
42. 如權(quán)利要求36所述的方法，其中所述生物樣品是血清樣品。
43. 如權(quán)利要求36所述的方法，其中測定⑶133 RNA表達包括核酸雜交。
44. 如權(quán)利要求36所述的方法，其中測定⑶133 RNA表達包括RT-PCR。
45. 如權(quán)利要求36所述的方法，其進一步包括如果所述樣品中的所述⑶133 RNA表達 水平當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH RNA水平時小于約0. 56,那么將所述受試者鑒別為不需要另一抗癌 療法。
46. 如權(quán)利要求36所述的方法，其進一步包括測定所述樣品中的至少第二種基因的表 達水平。
47. 如權(quán)利要求46所述的方法，其進一步包括測定所述樣品中的CEA、CK19或CK20的 表達水平，其中相對于對照水平CEA、CK19或CK20的表達水平升高指示所述受試者需要另 一抗癌療法。
48. 如權(quán)利要求36所述的方法，其中將所述受試者鑒別為需要另一抗癌療法包括所述 受試者需要另一抗癌療法的報告。
49. 如權(quán)利要求48所述的方法，其中所述報告是書面或電子報告。
50. 如權(quán)利要求36所述的方法，其進一步包括如果所述樣品中的所述⑶133 RNA表達 水平當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH RNA水平時大于約0. 56,那么向所述受試者施用另一抗癌療法。
51. 如權(quán)利要求50所述的方法，其中所述另一抗癌療法包括用氟胞苷衍生物和COX-2 酶抑制劑治療。
52. 如權(quán)利要求50所述的方法，其中所述另一抗癌療法包括放射療法、化學(xué)療法、免疫 療法或手術(shù)。
【文檔編號】C12Q1/68GK104520441SQ201380032766
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2013年5月1日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月1日
【發(fā)明者】林惠國 申請人:得克薩斯大學(xué)體系董事會