用于生產(chǎn)丁醇和丁酸的生物工藝學方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)C4體，優(yōu)選丁酸和/或丁醇的方法，包含以下步驟：使包含在含水培養(yǎng)基中的產(chǎn)乙酸細菌細胞的含水培養(yǎng)基與合成氣接觸，和將步驟a)中獲得的混合物在0至100℃之間的溫度下培育至少30分鐘，其中在步驟b)中，所述含水培養(yǎng)基包含總組合濃度為至少0.1gL-1的乙醇和/或乙酸。
【專利說明】用于生產(chǎn)丁醇和丁酸的生物工藝學方法
[0001] 本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)C4體，優(yōu)選丁酸和/或丁醇的方法，包含以下步驟：使含水培 養(yǎng)基中的產(chǎn)乙酸細菌細胞（acetogenic bacterial cell)與合成氣接觸，將步驟a)中獲得 的混合物在〇至l〇〇°C之間的溫度下培育至少30分鐘，其中在步驟b)中，含水培養(yǎng)基包含 總組合濃度為至少〇. I g L4的乙醇和/或乙酸。
[0002] 不可再生化石燃料的時代正在終結。雖然化學家迄今已能依賴幾乎無限供給的 煤炭、石油和天然氣，但是由埋葬在海洋沉積物中的細菌、浮游生物、植物和動物物質經(jīng)上 百萬年形成的這種資源的可得性在不久的將來必然將受到限制。另外，燃燒化石燃料已經(jīng) 與CO 2的大氣濃度提高和相關的氣候變化，最值得注意的是全球變暖相聯(lián)系。因此，生產(chǎn)通 常衍生自化石資源的散裝化學品（bulk chemical)，例如丁醇、丁酸及其衍生物的下一代方 法，將必須起始于可再生資源，即可容易地和就地質時間刻度而言快速地補充的材料。
[0003] 工業(yè)生物技術，即生物催化劑，例如酶或催化有效生物體（catalyticall competent organism)作為工業(yè)催化劑的應用，為使用化石資源作為進料的許多常規(guī)方法 提供備選方案。與常規(guī)方法相比，生物催化劑不僅能夠轉化由經(jīng)常為農(nóng)業(yè)或工藝廢物的可 再生材料制造的化合物，否則所述廢物將必須被丟棄，而且該生物催化劑不需要使用有毒 的化合物，和最后但并非最不重要的是減少溫室氣體排放。
[0004] 現(xiàn)有技術中已經(jīng)報告許多生產(chǎn)丁醇（CH3-CH2-CH 2-CH2-OH)和丁酸（butyric acid) (CH3-CH2-CH2-C00H，也稱為丁酸（butyrate)及其C4衍生物的方法，但是其中大部分依賴于 裂解化石燃料并氧化所得短鏈烴。相反，幾乎沒有描述從一氧化碳或二氧化碳（得自廢氣 和樣品合成氣的化合物）形式的碳起始的方法。
[0005] 合成氣，表不包含水和氫氣的至少一種和一氧化碳和二氧化碳的至少一種的各種 混合物的術語，是一種可再生的碳源并且可容易地從全世界獲得，使用各種起始材料生產(chǎn) 合成氣的方法是已知的，包括天然氣或液烴的蒸汽轉化和煤炭或生物質的氣化。
[0006] 現(xiàn)有技術中已經(jīng)報告合成氣用于生產(chǎn)包含碳鏈的化合物的用途。但是，先前描述 的方法依賴于添加額外的底物，特別是碳水化合物，例如葡萄糖。基于微生物消耗合成氣作 為碳源的方法導致所需化合物的產(chǎn)率相當不令人滿意。
[0007] 因此，構成本發(fā)明基礎的問題是提供一種從一氧化碳或二氧化碳（優(yōu)選合成氣的 形式）起始生產(chǎn)C4體，優(yōu)選丁醇和/或丁酸的方法。
[0008] 構成本發(fā)明基礎的另一個問題是提供一種生產(chǎn)C4體，優(yōu)選丁醇和/或丁酸的方 法，該方法起始于由合成氣衍生的碳原子而非存在的其它碳源，特別是碳水化合物，例如葡 萄糖制造的一氧化碳或二氧化碳，就產(chǎn)率和/或形成的丁醇和/或丁酸的純度或者C4體， 優(yōu)選丁醇和/或丁酸的比例而言，該方法相比現(xiàn)有技術方法得到改進。
[0009] 構成本發(fā)明基礎的另一個問題是提供一種從合成氣起始生產(chǎn)C4體的方法，其中 相對于一氧化碳和二氧化碳之外的含碳反應物，C4產(chǎn)物的產(chǎn)率得到改善，即合成所需的一 氧化碳和二氧化碳之外的碳化合物的量得到降低。
[0010] 在第一個方面，構成本發(fā)明基礎的問題由一種生產(chǎn)C4體，優(yōu)選丁酸和/或丁醇的 方法解決，該方法包含以下步驟： a) 在厭氧條件下使含水培養(yǎng)基中的產(chǎn)乙酸細菌細胞與合成氣接觸， b) 將步驟a)中獲得的混合物在O至100°C之間的溫度下培育至少30分鐘， 其中在步驟b)中，含水培養(yǎng)基包含總組合濃度超過0.1 g I71的乙醇和/或乙酸。
[0011] 在本發(fā)明的第一個方面的第一個實施方案中，問題由一種方法解決，其中乙醇和/ 或乙酸是外源性產(chǎn)生的乙醇和/或乙酸。
[0012] 在第一個方面的第二個實施方案中，其也是第一個方面的第一個實施方案的實施 方案，問題由一種方法解決，其中乙醇和/或乙酸的總組合濃度為0.5 g I/1至20 g L'
[0013] 在第一個方面的第三個實施方案中，其也是第一個方面的第一個至第二個實施方 案的實施方案，問題由一種方法解決，其中合成氣包含40至100,優(yōu)選40至95%的C0。
[0014] 在第一個方面的第四個實施方案中，其也是第一個方面的第一個至第三個實施方 案的實施方案，問題由一種方法解決，其中合成氣包含少于10%的co 2。
[0015] 在第一個方面的第五個實施方案中，其也是第一個方面的第一個至第四個實施方 案的實施方案，問題由一種方法解決，其中合成氣包含少于10%的C0。
[0016] 在第一個方面的第六個實施方案中，其也是第一個方面的第一個至第五個實施方 案的實施方案，問題由一種方法解決，其中該方法包含以下步驟： C)步驟b)之后從混合物中分離和任選再循環(huán)乙醇和/或乙酸。
[0017] 在第一個方面的第七個實施方案中，其也是第一個方面的第一個至第六個實施方 案的實施方案，問題由一種方法解決，其中所述產(chǎn)乙酸細菌細胞選自梭菌， 穆爾氏菌紙和一氧化碳嗜熱菌，和優(yōu)選為CZo 1S car box i di vorans 〇
[0018] 在第一個方面的第八個實施方案中，其也是第一個方面的第一個至第七個實施方 案的實施方案，問題由一種方法解決，其中步驟a)和b)中的pH保持在3至7之間，優(yōu)選4 至6,更優(yōu)選5至5. 5。
[0019] 在第一個方面的第九實施方案中，其也是第一個方面的第一個至第八個實施方案 的實施方案，問題由一種方法解決，其中步驟b)在15°C至45°C之間的溫度，優(yōu)選30°C至 40°C下進行。
[0020] 在第一個方面的第十個實施方案中，其也是第一個方面的第一個至第九個實施方 案的實施方案，問題由一種方法解決，其中合成氣提供超過80,優(yōu)選超過90%的最初在步驟 a)中存在的碳。
[0021] 在第一個方面的第十一個實施方案中，其也是第一個方面的第一個至第十個實施 方案的實施方案，問題由一種方法解決，其中該方法以連續(xù)方式進行。
[0022] 在第一個方面的第十二個實施方案中，其也是第一個方面的第一個至第十一個實 施方案的實施方案，問題由一種方法解決，其中步驟b)在沒有碳水化合物存在下進行。
[0023] 在第二個方面，構成本發(fā)明基礎的問題由乙醇和/或乙酸用于增加由產(chǎn)乙酸細菌 細胞轉化的合成氣對C4體，優(yōu)選丁酸和/或丁醇的比例的用途解決。
[0024] 在第二個方面的第一個實施方案中，問題由一種用途解決，其中乙醇和/或乙酸 外源性產(chǎn)生的乙醇和/或乙酸，并且優(yōu)選在聚集可檢測量的由所述細胞外源性產(chǎn)生的乙醇 和/或乙酸之前，加入到包含產(chǎn)乙酸細菌細胞的含水培養(yǎng)基中。
[0025] 在第二個方面的第二個實施方案中，其也是第二個方面的第一個實施方案的實施 方案，問題由一種用途解決，其中乙酸和/或乙醇以超過0.5 g I71，而不超過20 g I71的乙 醇和/或乙酸的總組合濃度存在于包含產(chǎn)乙酸細菌細胞的含水培養(yǎng)基中。
[0026] 在第二個方面的第三個實施方案中，其也是第二個方面的第一個至第二個實施方 案的實施方案，問題由一種用途解決，其中產(chǎn)乙酸細菌細胞選自梭菌，穆爾氏菌和一氧化碳 嗜熱菌，和優(yōu)選為 trit/i應 car辦(orit/i rara/75。
[0027] 不希望受任何理論束縛，本發(fā)明人們創(chuàng)立理論，乙醇或乙酸的存在引起將合成氣 轉化為C4體，優(yōu)選丁醇和/或丁酸所必須的基因表達，因此增加產(chǎn)乙酸細菌細胞代謝來自 合成氣的一氧化碳和二氧化碳的生產(chǎn)率。
[0028] 本發(fā)明集中在使用產(chǎn)乙酸細菌細胞生產(chǎn)C4體，優(yōu)選丁醇和/或丁酸。在優(yōu)選的 實施方案中，如在此使用的，術語"產(chǎn)乙酸細菌細胞"表示能夠在厭氧條件下，優(yōu)選使用氫 氣作為電子給體和二氧化碳作為電子受體或一氧化碳代替二氧化碳，生產(chǎn)乙酸的細菌或古 細菌細胞。許多產(chǎn)乙酸細菌已經(jīng)在現(xiàn)有技術中公開，包括但不限于醋酸梭菌 acetic^?) (Wieringa，K. T. (1936)，J. Microbiol. Serol. 3,263_273)，伍氏醋酸桿菌 Gceto辦acteri應 root/i) (Balch, W. E. , Schobert, S. , Tanner, R. S?和 Wolfe, R. S. (1977)，Int. J. Sys. Bacteriol. 27,335-361)，熱醋梭菌（C/ostrit/itt? 從e/maceticwfi?) (Fontaine，F(xiàn). E，Peterson W. H.，McCoy，E?和 Johnson，M. J. (1942)，J. Bact. 43， 701-715), Clostridium lungdahlii (W00068407), Clostridium autoethanogenum (Aribini 等 Archives of Microbiology 161,345-351)，穆爾氏菌種 HUC22-1 (Sakai 等， Biotechnology Letters 29,1697-1612)，和一氧化碳嗜熱菌從e/sw/s)屬的那 些（Svetlichny 等（1991), Systematic and Applied Microbiology 14,254_260)。這些 和其它產(chǎn)乙酸細菌細胞是例如可購自美國組織和培養(yǎng)物保藏中心（American Tissue and Culture Collection (ATTC))，美國，或德國微生物菌種保藏中心（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Braunschweig)，德國。包含至少兩種產(chǎn)乙酸細 菌細胞的混合培養(yǎng)物也在本發(fā)明范圍內(nèi)。
[0029] 在優(yōu)選的實施方案中，如在此使用的，術語"C4體"表示以與包含碳之外的原子的 官能團的任何組合的，包含總共四個碳原子的任何有機化合物。在更優(yōu)選實施方案中，如在 此使用的，術語"C4體"表示由丁醇或丁酸制造的任何衍生物。在最優(yōu)選實施方案中，所述 衍生物由衍生化獲得，所述衍生化包括不同于包括向丁醇或丁酸或其衍生物"凈添加或去 除"碳原子的那些反應的任何反應，包括但不限于氧化，特別是羥基化，還原，和甲基轉移， 其中特征"凈添加或去除碳原子"不排除暫時添加或去除碳原子，例如將C4體或衍生物暫 時束縛至酶或其輔因子。C4體的實例包含1-丁醇（在本申請中表示為"丁醇"），2-丁醇， 丁酸，1，4- 丁二醇，2, 3- 丁二醇，氨基丁烷，硫代丁醇，異丁烯醇和異丁醇。
[0030] 本發(fā)明預期野生型產(chǎn)乙酸細菌細胞和遺傳修飾的產(chǎn)乙酸細菌細胞兩者的用途。 在優(yōu)選實施方案中，遺傳修飾的產(chǎn)乙酸細菌細胞為已經(jīng)修飾的產(chǎn)乙酸細菌細胞，使得至少 一種酶的活性涉及Wood-Ljungdahl路徑，即將一氧化碳、二氧化碳和氫氣轉換為乙酸的 路徑。在優(yōu)選實施方案中，如在此使用的，術語"涉及Wood-Ljungdahl路徑的酶"包含結 合至所述路徑的底物之一，或優(yōu)選接受所述途徑的底物之一作為底物的任何酶，所述途徑 的底物優(yōu)選一氧化碳、二氧化碳或氫氣，或當?shù)孜镛D化成乙酸或其衍生物時從任何的這些 底物開始的路徑內(nèi)形成的任何中間體。在另一個優(yōu)選實施方案中，如在此使用的，術語 "Wood-Ljungdahl路徑的酶"表示選自CO脫氫酶和乙酰輔酶A合成酶的酶（Diekert和 Wohlfahrt, (1994) Antonie van Leeuwenhoek 66 (1-3)，209-221)?？捎脕磉z傳修飾細 菌細胞的技術在現(xiàn)有技術中描述，例如Sambrook等（Molecular Cloning-A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press)，如增加酶在細菌細胞中的活性 的方法，例如通過染色體基因擴增的方式，增加編碼具有所關心活性的酶的基因的表達（W0 03/014330和WO 03/040373)。在優(yōu)選實施方案中，所述產(chǎn)乙酸細菌細胞選自腫 carboxidivorans, Clostridium drakei 熱場{Clostridium Ijungdahlii)。
[0031] 必要的是該方法在厭氧條件下進行。在優(yōu)選實施方案中，如在此使用的，術語 "厭氧條件"表示按照優(yōu)先度遞增的順序，所關心的溶液中的氧氣飽和度小于30,20,10， 5,2. 5或1飽和度百分率，其中100%飽和度表示在可比較條件下，例如在20°C大氣壓下， 用純氧氣體大面積吹洗溶液的情況下，存在的氧氣的濃度。對于氣體，如在此使用的，術 語"厭氧條件"在優(yōu)選實施方案中表示按照優(yōu)先遞增的順序和參考總體積，該氣體包含小 于30, 20,10, 5, 2. 5,1，0. 5,0. 1，0. 01%的氧氣。在另一個優(yōu)選實施方案中，如在此使用的， 術語"厭氧條件"表示在氣體混合物或溶液中，氧氣的濃度是使其不抑制厭氧產(chǎn)乙酸細菌， 優(yōu)選的生長。本領域技術人員熟知可用來將反應荃和溶 液轉變?yōu)閰捬醯募夹g，例如用氮氣、氬氣等沖洗氣密容器和溶液，或用耗氧的酶體系，例如 0. 6% (w/v) 0 -D-葡萄糖，0. 5單位mr1葡萄糖氧化酶（Sigma)和200單位mr1過氧化 氫酶（Sigma)補充含水溶液，如 Richter, C. D?等（2002)，J. Biol. Chem. 277 (5)， 3094-3100 描述的。
[0032] 合成氣為生產(chǎn)C4體，優(yōu)選丁醇和/或丁酸的本發(fā)明的主要碳源。在優(yōu)選實施方案 中，如在此使用的，術語"合成氣^示包含水和氫氣（H 2)的至少一種和一氧化碳（CO)和二 氧化碳（CO2)的至少一種的混合物，其中水、氫氣、一氧化碳和二氧化碳的總混合體積為混 合物總體積的至少80%，優(yōu)選90%。其它組分包含氮氣，惰性氣體等。在優(yōu)選實施方案中，合 成氣包含40至95%的一氧化碳。在優(yōu)選實施方案中，合成氣包含40至100%，優(yōu)選40至95% 的二氧化碳和〇. 5至20%的H2。在另一個優(yōu)選實施方案中，合成氣包含小于10%的二氧化 碳。在另一個優(yōu)選實施方案中，合成氣包含小于10%的一氧化碳。在另一個優(yōu)選實施方案 中，合成氣包含至少5%，優(yōu)選10%的一氧化碳。在另一個優(yōu)選實施方案中，按照優(yōu)先度遞增 的順序，氫氣和二氧化碳的總組合體積大于混合物總體積的50,60, 70,80, 90,95或99%。在 優(yōu)選實施方案中，如在此使用的，術語使微生物與本申請中說明的任何組成的"合成氣""接 觸"表示微生物存在于由所述組成的合成氣組成的環(huán)境中。
[0033] 根據(jù)本發(fā)明的方法，使產(chǎn)乙酸細菌細胞在含水培養(yǎng)基中在沒有氧氣存在下與合成 氣接觸。在優(yōu)選實施方案中，術語"含水培養(yǎng)基"包含任何含水溶液，該含水溶液包含生長或 支持產(chǎn)乙酸細菌細胞并且支持乙酸化所需的量的鹽和緩沖劑。例如，根據(jù)Hurst，K. M.和 Lewis，R. (2010) ,Biochemical Engineering Journal 2010,48,159-165 的含水培養(yǎng)基可 用來進行本發(fā)明的教導。在優(yōu)選實施方案中，含水培養(yǎng)基包含酵母提取物。
[0034] 本發(fā)明的關鍵方面是乙醇（CH3-CH2-OH)和/或乙酸（CH 3-COCT)從反應開始時存 在于含水培養(yǎng)基中，其總組合濃度，即乙酸陽離子的濃度和乙醇的濃度的總和為至少〇. I g L'在其它優(yōu)選實施方案中，乙醇和/或乙醇的濃度為0. 1至50,0. 2至40,0. 25至20或 0? 5 至 20 g L'
[0035] 不同于等待細胞生產(chǎn)內(nèi)源性乙酸，外源生產(chǎn)的乙酸和/或乙醇最初在步驟a)中存 在于含水培養(yǎng)基中。在優(yōu)選實施方案中，如在此使用的，術語"外源性生產(chǎn)的"乙酸和/或 乙醇表示在接觸產(chǎn)乙酸細菌細胞之前，在獨立的反應釜中生產(chǎn)或純化的乙酸或乙醇，與步 驟b)中（即步驟a)之后）生產(chǎn)的乙酸和/或乙醇相反。在優(yōu)選實施方案中，術語"外源性 生產(chǎn)的"乙酸和/或乙醇包含由產(chǎn)乙酸細菌細胞生產(chǎn)的乙酸和/或乙醇，或實際上由與步驟 a)中使用的相同產(chǎn)乙酸細菌細胞生產(chǎn)，但是從反應釜中移出，與生產(chǎn)的任何C4體分離并再 循環(huán)的乙酸和/或乙醇。在優(yōu)選實施方案中，外源性生產(chǎn)的乙酸和/或乙醇的濃度在含水 培養(yǎng)基中保持在最初存在的值或值范圍，只要步驟b)中由產(chǎn)乙酸細菌細胞催化的反應繼 續(xù)。在優(yōu)選實施方案中，含水培養(yǎng)基中的乙酸和/或乙醇作為整體被認為是外源性的，只要 外源性生產(chǎn)的乙酸和/或乙醇占含水培養(yǎng)基中存在的全部乙酸和/或乙醇的大于80%，優(yōu)選 大于90%。
[0036] 步驟a)中獲得的混合物可以培育至少0. 5，1，2,3,5，10，12，16,24,36,48，120或 160小時。在優(yōu)選實施方案中，步驟b)中存在還原劑。本領域技術人員熟知還原劑，例如含 硫醇試劑，例如半胱氨酸或連二亞硫酸鹽。起始濃度可以為至少〇. 1，〇. 5,1，2, 5或10 mM。
[0037] 優(yōu)選的是該方法包含步驟b)之后從混合物中再循環(huán)乙醇和/或乙酸。在優(yōu)選實施 方案中，這意味著移出一部分來自步驟b)的反應混合物，并將其中的乙酸和/或乙醇與形 成的任何C4體分離，隨后將用這樣的方式獲得的乙酸和/或乙醇輸送回到反應混合物中。 可以以分批方式或優(yōu)選以連續(xù)方式移出步驟b)中的一部分反應混合物。在后者情況下，可 以在分離步驟之前收集連續(xù)移出的反應混合物。
[0038] 本領域技術人員熟知可用來將水溶液中存在的乙酸和/或乙醇與任何丁醇和/或 丁酸分離的方法，例如使用疏水性有機溶劑萃取，蒸餾等。
[0039] 本申請中涉及的任何有機化合物，例如C4體，乙酸，乙醇，丁酸和丁醇包含所關心 的化合物的質子化形式以及該化合物的各種鹽。例如，乙酸可以包含乙酸（CH 3-COOH)，還有 乙酸的各種鹽，例如乙酸鈉（CH3-COCTNa+)，乙酸鉀（CH 3-COOTO，乙酸銨（CH3-C00_NH4+)等。
[0040] 在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明以連續(xù)方式進行，其中連續(xù)去除用于進行步 驟a)和b)的來自容器的含水溶液，分離成富集C4體，優(yōu)選丁醇和/或丁酸的級分，和富集 乙酸和/或乙醇的另一個級分，將后一級分加入到用于進行步驟a)和b)的容器中。
[0041] 考慮到一方面產(chǎn)乙酸細菌細胞的需要，另一方面熱力學參數(shù)的需要，步驟a)和b) 中的溫度需要加以選擇。現(xiàn)有技術教導大量產(chǎn)乙酸細菌的溫度范圍和最佳溫度。例如， C/iostrit/i應從erffioacetic應可以在高至60°C的溫度下培育（Fontaine等，1942)。同 樣參見關于可用來生長產(chǎn)乙酸細菌和古細菌細胞的溫度的微生物學的標準教科書，例如 Dworkin 等（2006) The Prokaryotes-A Handbook on the Biology of Bacteria，2 卷。在 優(yōu)選實施方案中，步驟b)中施加的溫度為0至100°C，10至80°C，20至60°C和30至45°C。 在優(yōu)選實施方案中，施加的合成氣的壓力為0.5至10 bar,更優(yōu)選為0.8至8 bar,更優(yōu)選 為1.5至6匕&1~。在另一個優(yōu)選實施方案中，壓力大于1，1.5,2,3,4,5,6,7,8,9，10匕 &1'。在 優(yōu)選實施方案中，施加的壓力超過大氣壓。在優(yōu)選實施方案中，如在此表示的，單位"表壓" 表示相對于局部常壓或環(huán)境壓力的壓力。例如，假設局部大氣壓為I bar，容器內(nèi)部的壓力 為I. 8 bar,貝Ij表壓為0? 8 bar (表壓）。
[0042] 本發(fā)明的特別的強度是C4體，優(yōu)選丁醇和/或丁酸的形成不依賴于包含多于兩個 碳原子的碳鏈的有機化合物的大量存在。在優(yōu)選實施方案中，步驟a)和b)可以在但是并 非必須在沒有碳水化合物存在下進行。在優(yōu)選實施方案中，術語"在沒有碳水化合物存在 下"表示按照度優(yōu)先遞增的順序，碳水化合物的濃度小于5,1，0. 5,0. 1或0. 05% (每體積重 量）。在優(yōu)選實施方案中，術語"碳水化合物"包含具有至少兩個官能團的任何有機化合物， 所述官能團選自羥基、醛或酮基，以及包含五個或更多碳原子的直線碳鏈。示例性碳水化合 物包含己糖，例如葡萄糖或果糖，戊糖，例如核酮糖，以及包含兩個或多個碳水化合物單體 的復糖，例如蔗糖。
[0043] 同樣，優(yōu)選的是按照優(yōu)先度遞增的順序，合成氣提供多于70, 75,80,85,90或95% 的最初存在于步驟a)中的碳。在優(yōu)選實施方案中，如在此使用的，術語"合成氣提供多于 X%的最初存在于步驟a)中的碳"表示反應釜中存在的多于X%的碳原子為一氧化碳或二氧 化碳分子中的碳原子。例如，如果存在9摩爾的二氧化碳，小于1摩爾的甲烷和一些氫氣， 但是沒有包含至少一個碳原子的其它化合物，則合成氣提供多于90%的存在的碳。
[0044] 該方法可以以分批方式進行。如果是這種情況，如在此使用的，在優(yōu)選實施方案 中，術語"培育混合物…至少X分鐘"表示使產(chǎn)乙酸細菌細胞批料在規(guī)定的條件下停留X分 鐘，所述條件例如存在含水培養(yǎng)基，存在與產(chǎn)乙酸細菌細胞接觸的合成氣，溫度設定，存在 乙醇和/或乙酸等。另外，該方法可以以連續(xù)方式進行。如果是這種情況，如在此使用的， 在優(yōu)選實施方案中，術語"培育混合物…至少X分鐘"表示反應物分子，例如氫氣分子在容 器中或規(guī)定的條件下消耗的平均時間為X分鐘。例如，如果氣密容器包含10升氫氣，以每 分鐘1升的流速添加氫氣，以及容器構造使得氫氣分子可以被認為按照進入的順序離開該 容器，則消耗的平均時間，即容器中設定條件下培育的氫氣分子消耗的時間為10分鐘。
[0045] 如果設想大規(guī)模方法，可能有利的是以連續(xù)方式進行本發(fā)明的教導。在優(yōu)選實施 方案中，如在此使用的，術語"連續(xù)方式"表示包含將底物連續(xù)進料到生物反應器中和從生 物反應器中移出包含產(chǎn)物的介質的方法。連續(xù)方式可以另外包含恒定進料營養(yǎng)物。細胞在 生物反應器中可以生長，可選地，可以限制營養(yǎng)物以使細胞達到靜止期，即通過營養(yǎng)物缺乏 來限制生長，但是細胞保留代謝活性并持續(xù)轉化底物，例如合成氣。在優(yōu)選實施方案中，如 在此使用的，術語"靜止期"表示經(jīng)歷這種階段的細胞是代謝活性的，基本上不增殖。
[0046] 本發(fā)明可以使用允許保持厭氧條件的任何種類的容器來進行。如果以小規(guī)模進 行，可以使用提供低氧或無氧的氣密套（glove)。在大規(guī)模下，大容積合成氣發(fā)酵器呈現(xiàn)更 多的實用性。在優(yōu)選實施方案中，反應混合物經(jīng)歷恒定攪拌，以確定細胞、營養(yǎng)物、底物和產(chǎn) 物均勻地分布在整個含水培養(yǎng)基中。
[0047] 現(xiàn)有技術分析工具，例如通過定期從反應混合物中取樣并對其進行HPLC分析，允 許恒定監(jiān)測生物反應器中的許多化合物。如果需要，可以在線調(diào)節(jié)關鍵的參數(shù)，例如pH和 底物和產(chǎn)物的濃度。在優(yōu)選實施方案中，將恒定監(jiān)測下的乙醇和丁醇的至少一種的濃度和 水平調(diào)節(jié)至與使用的產(chǎn)乙酸細菌細胞的生長和催化活性相容的濃度。
[0048] 本發(fā)明進一步通過以下附圖和非限制實施例來說明，由所述附圖和非限制實施例 可以獲得本發(fā)明的其它特征、實施方案、方面和優(yōu)點。
[0049] 圖1顯示就實施例1中獲得的碳含量而言，培養(yǎng)開始和結束時的產(chǎn)物濃度之間的 差異。單位"mm〇lC/l"表示每升中的以mmol計的碳量。
[0050] 圖2顯示就實施例2中獲得的碳含量而言，培養(yǎng)開始和結束時的產(chǎn)物濃度之間的 差異。單位"mm〇lC/l"表示每升中的以mmol計的碳量。
[0051] 圖3顯示就使用株系的實施例3中獲得的碳含量而言，培養(yǎng) 開始和結束時的產(chǎn)物量。
[0052] 圖4顯示就使用株系揚氏梭菌的實施例3中獲得的碳含量而言，培養(yǎng)開始和結束 時的產(chǎn)物濃度之間的差異。
[0053] 實施例1 :在沒有或存在乙醇下生產(chǎn)丁酸 使CZo1SiricarAiorit/iraraas DSMZ 15243預培養(yǎng)物在使用丁基隔膜密封的I L厭 氧瓶中生長，所述瓶中包含200 mL的根據(jù)Hurst,K. M.和Lewis, R. (2010)，Biochemical Engineering Journal 2010，48，159-165 的改性PETC，由 I g 的酵母提取物，19 g 的MES， 30 mL的無機鹽溶液，10 mL的微量元素溶液和10 mL的維生素溶液組成。無機鹽溶液每升 包含80 g的NaCl，100 g的氯化銨，10 g的氯化鉀，10 g的單磷酸鉀，20 g的硫酸鎂和4 g的氯化鈣。維生素溶液由每升0.01 g的吡哆素，0.005 g的硫胺素，0.005 g的核黃素， 0. 005 g的泛酸鈣，0.005 g的硫辛酸（thioctacid)，0.005 g的對氨基苯甲酸，0.005 g的煙 酸，0.005 g的維生素B12,0.002 g的葉酸和0.01 g的MESNA組成。微量元素溶液由每升 2 g的次氮基乙酸，I g的MnSO4,0.8 g的硫酸鐵銨，0.2 g的氯化鈷，0.2 g的硫酸鋅，0.02 g的氯化銅（II)，0. 02 g的氯化鎳，0. 02 g的鑰酸鈉，0. 02 g的Na2SeO4,0. 02的Na2WO4組 成。將pH調(diào)節(jié)至5. 9。
[0054] 在接種之前，將介質煮沸20分鐘，隨后用純氮氣沖洗20分鐘。隨后在121°C熱壓 處理20分鐘，隨后冷卻，然后以I bar表壓，使用包含50%的C0,45%的H2和5%的CO2的工 藝氣體充滿。隨后，將壓力調(diào)節(jié)至0.8 bar表壓。
[0055] 同樣，在接種之前，在無菌厭氧條件下添加包含各4%的硫酸鈉和半胱氨酸鹽酸鹽 的1.5 mL溶液作為還原劑。
[0056] 培養(yǎng)物在37°C和100 rpm下生長。每72小時將培養(yǎng)物轉移至新鮮培養(yǎng)基。
[0057] 為了實驗，使用包含95%的CO和5%的CO2的工藝氣體以同樣的方式制備培養(yǎng)基。 另外，在無菌厭氧條件下添加每升0. 6 g的乙醇至燒瓶的一半。
[0058] 使用來自48小時培養(yǎng)物的10體積％接種物，在無菌厭氧條件下接種該溶液。在 37°C以100 rpm搖振燒瓶160小時。在實驗開始和結尾時測定干燥生物質和產(chǎn)品濃度。
[0059] 使用HPLC測定乙酸，乙醇，丁酸和丁醇的濃度。Aminex HPX-87H塔用作固定相。 以0.6 mL/min的恒定流速將5 mM硫酸用作洗脫劑。塔的溫度為40°C。使用折射率測試儀 檢測乙醇和丁醇。在210 nm波長下使用二極管陣列測試儀，檢測乙酸和丁酸。使用限定濃 度下的各個化合物的校準曲線圖，通過峰的積分計算化合物的濃度。
[0060] 圖1顯示就碳含量而言，培養(yǎng)開始和結尾時的產(chǎn)物濃度之間的差值。
[0061] 與在沒有乙醇存在下形成97. 17 mmolC/L乙酸相比，在乙醇存在下，形成105 nmolC/L的乙酸。當使用相同量的干燥生物質，更具體地為480 mg/L的生物質時，與在沒有 乙醇存在下，形成13. 57 mmolC/L 丁酸相比，在乙醇存在下形成22.06 mmolC/L 丁酸。
[0062] 總之，添加乙醇導致形成的丁酸量顯著增加。
[0063] 實施例2 :在沒有或存在乙酸下生產(chǎn)丁酸 如實施例1所述進行實驗規(guī)程，除了將2 g/L乙酸加入到燒瓶的一半，代替0.6 g/L的 乙醇，以及使用的合成氣批料包含50%的一氧化碳和50%的氫氣。
[0064] 圖2顯示就碳含量而言，培養(yǎng)開始和結尾時的產(chǎn)物濃度之間的差值。與在沒有乙 酸存在下形成26, 43 mmolC/L的丁酸相比，在乙酸存在下形成42, 13 nmolC/L的丁酸。
[0065] 總之，添加乙酸也導致形成的丁酸量增加。
[0066] 實施例3 :使用替代的株系和氣體混合物，在乙酸或乙醇存在下生產(chǎn)丁酸 使用的培養(yǎng)基和溶液： 改良的ATCC 1754 (PETC最低限度培養(yǎng)基）
【權利要求】
1. 一種生產(chǎn)C4體，優(yōu)選丁酸和/或丁醇的方法，包含以下步驟： a) 在厭氧條件和優(yōu)選在沒有碳水化合物存在下，使含水培養(yǎng)基中的產(chǎn)乙酸細菌細胞 與合成氣接觸， b) 將步驟a)中獲得的混合物在0至100°C之間的溫度下培育至少30分鐘， 其中在步驟b)中，所述含水培養(yǎng)基包含至少0.1 g Γ1的總組合濃度的乙醇和/或乙 酸。
2. 根據(jù)權利要求1的方法，其中所述乙醇和/或乙酸為外源性產(chǎn)生的乙醇和/或乙酸。
3. 根據(jù)權利要求1至2中任一項的方法，其中所述乙醇和/或乙酸的總組合濃度為0. 5 g 至 20 g I71。
4. 根據(jù)權利要求1至3中任一項的方法，其中所述合成氣包含40%至100%，優(yōu)選40% 至95%的CO。
5. 根據(jù)權利要求1至4中任一項的方法，其中所述合成氣包含小于10%的C02。
6. 根據(jù)權利要求1至4中任一項的方法，其中所述合成氣包含小于10%的CO。
7. 根據(jù)權利要求1至6中任一項的方法，其中所述方法包含以下步驟： c) 步驟b)之后從所述混合物中分離和任選再循環(huán)乙醇和/或乙酸。
8. 根據(jù)權利要求1至7中任一項的方法，其中所述產(chǎn)乙酸細菌細胞選自梭菌 (C/iosirii/itt?)，穆爾氏菌（M9〇re77a)和一氧化碳嗜熱菌（CkrAojyiAe/SMAs)，且優(yōu)選為 Cl os tri di um car box i di vorans 〇
9. 根據(jù)權利要求1至8中任一項的方法，其中步驟a)和b)中的pH保持在3至7之 間，優(yōu)選4至6,更優(yōu)選5至5. 5。
10. 根據(jù)權利要求1至9中任一項的方法，其中步驟b)在15°C至45°C之間的溫度，優(yōu) 選30°C至40°C下進行。
11. 根據(jù)權利要求1至10中任一項的方法，其中所述合成氣提供大于80%，優(yōu)選大于 90%的最初在步驟a)中存在的碳。
12. 根據(jù)權利要求1至11中任一項的方法，其中所述方法以連續(xù)方式進行。
13. 根據(jù)權利要求1至12中任一項的方法，其中步驟b)在沒有碳水化合物存在下進 行。
14. 乙醇和/或乙酸的用途，其用于增加由厭氧條件下含水培養(yǎng)基中的產(chǎn)乙酸細菌細 胞轉化的合成氣對C4體，優(yōu)選丁酸和/或丁醇的比例。
15. 根據(jù)權利要求14的用途，其中所述乙醇和/或乙酸是外源性產(chǎn)生的乙醇和/或乙 酸，并且優(yōu)選在聚集可檢測量的由所述細胞外源性產(chǎn)生的乙醇和/或乙酸之前，加入到含 水培養(yǎng)基中。
16. 根據(jù)權利要求14至15中任一項的用途，其中所述乙酸和/或乙醇以0.5至5 g Γ1 的總組合濃度存在于包含產(chǎn)乙酸細菌細胞的含水培養(yǎng)基中。
17. 根據(jù)權利要求14至16中任一項的用途，其中所述產(chǎn)乙酸細菌細胞選自梭菌，穆爾 氏菌和一氧化碳嗜熱菌，且優(yōu)選為carAiorii/irarafls。
【文檔編號】C12P7/16GK104302778SQ201380010630
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2013年2月22日 優(yōu)先權日:2012年2月22日
【發(fā)明者】Y.席曼, L.賴內(nèi)克, T.哈斯, D.沃伊斯特-博茨, H.克里斯平 申請人:贏創(chuàng)工業(yè)集團股份有限公司