包含來自枯草芽孢桿菌的發(fā)酵產(chǎn)物的組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及抗污染組合物，所述抗污染組合物包含一種或多種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)菌株(如，選自：22C-P1、15A-P4、3A-P4、LSSA01、ABP278、BS 2084和BS18)的無細胞發(fā)酵產(chǎn)物；其中所述發(fā)酵產(chǎn)物包含選自如下的一種或多種化合物：脂肽、聚酮化合物、嗜鐵素、桿菌溶素、抗莢膜菌素、plantazolicin、LCI、plantazolicin的同源物和LCI的同源物。此外，本發(fā)明還涉及制備所述組合物的方法、使用所述組合物的方法、包含所述組合物的產(chǎn)品及其用途。
NRRL B-50633
2012.01.09

NRRL B-50013
2007.03.08

NRRL B-50104
2008.01.22

NRRL B-50634
2012.01.09

PTA-6506
2005.01.12

PTA-6507
2005.01.12

PTA-6508
2005.01.12

PTA-6509
2005.01.12
【專利說明】包含來自枯草芽孢桿菌的發(fā)酵產(chǎn)物的組合物
[0001] 優(yōu)先權(quán)聲明
[0002] 本申請要求2012年2月21日提交的美國專利申請No. 61/601，154的優(yōu)先權(quán)，所 述美國專利申請全文以引用方式并入。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003] 本發(fā)明涉及抗污染組合物、制備其的方法及其防止諸如食品、表面涂層材料和農(nóng) 產(chǎn)品的產(chǎn)品的微生物污染的用途。具體地講，本發(fā)明涉及抗污染組合物，所述抗污染組合 物包含枯草芽孢桿菌（B. subtilis)菌株例如 22C-P1、15A-P4、3A-P4、LSSA01、ABP278、BS 2084和BS18的發(fā)酵產(chǎn)物。

【背景技術(shù)】
[0004] 產(chǎn)品的微生物污染是多個行業(yè)的問題。
[0005] 例如，在涂料行業(yè)中，水基涂料在濕潤狀態(tài)下易受到微生物污染（如，腐?。４祟?污染可導(dǎo)致涂料中的變色、析氣、惡臭、粘度損失、粘絲（即粘液）和相分離。
[0006] 在食物、飼料和農(nóng)業(yè)行業(yè)中，由于其組成的原因，食物、飼料、作物和種子易充當(dāng)微 生物的培養(yǎng)基，這構(gòu)成了對人和/或動物健康的可能風(fēng)險。因此，此類產(chǎn)品需要針對微生物 污染進行保護。
[0007] 通常在儲存或操作過程因受外部環(huán)境影響而發(fā)生微生物污染。
[0008] 防止此種情況的一種常規(guī)方法是使用外部屏障。這些屏障是物理的，并且在一些 情況下，是化學(xué)的。
[0009] 在物理屏障中，除了包裝外，還使用了塑料聚合物和共聚物涂層，例如聚乙烯、聚 丙烯酸酯、聚酯、聚酰胺和聚醚涂層、天然和合成彈性體及橡膠涂層、蠟質(zhì)涂層、纖維素涂層 和水膠體聚合物涂層，例如藻酸鹽、卡拉膠、黃原膠/刺槐豆膠混合物、瓊脂、明膠和果膠。
[0010] 然而，許多產(chǎn)品（如食品）在儲存過程中需要與環(huán)境進行濕度或味道交換，例如在 一些肉和奶酪產(chǎn)品中。對于此類產(chǎn)品，使用無孔物理屏障是不適當(dāng)?shù)?。然而，?dāng)使用多孔屏 障時，微生物可穿越屏障并增殖。
[0011] 此外，在使用中，在產(chǎn)品完全消費或應(yīng)用之前可能打開和/或移除了包裝較長的 一段時間。例如，在一些干燥產(chǎn)品中，如干燥食品（例如寵物食物）中，使用者首次打開產(chǎn) 品與最終消費之間的時間段可能延長，從而使微生物污染產(chǎn)品。
[0012] 已將用于保護此類產(chǎn)品的化學(xué)屏障施加于產(chǎn)品自身的表面上，其與其他組分例如 顏料、抗氧化劑、增稠劑、油、凝膠劑、增溶劑、乳化劑、風(fēng)味劑或乳濁劑一起分散在溶液中或 包含于涂層聚合物懸浮液、溶液或熔化混合物中。通常使涂層干燥或固化以便固定。用于化 學(xué)屏障的化學(xué)化合物中的一些為山梨酸鹽、苯甲酸鹽、硫衍生的化合物、亞硝酸鹽、硝酸鹽、 丙酸鹽、乳酸鹽、醋酸鹽、硼酸鹽和對羥基苯甲酸酯。
[0013] 然而，需要使用更多天然化合物防止產(chǎn)品例如農(nóng)產(chǎn)品、食品、表面涂層材料和乳液 的污染和/或腐敗。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014] 圖1示出了 pH和不同熱處理對DCS 1579 (枯草芽孢桿菌菌株22C-P1)的無細胞 發(fā)酵物抗大腸桿菌（E.coli)的活性的效應(yīng)。
[0015] 圖2示出了 pH和不同熱處理對DCS 1580 (枯草芽孢桿菌菌株15A-P4)的無細胞 發(fā)酵物抗大腸桿菌的活性的效應(yīng)。
[0016] 圖3示出了 pH和不同熱處理對DCS 1581(枯草芽孢桿菌菌株3A-P4)的無細胞發(fā) 酵物抗大腸桿菌的活性的效應(yīng)。
[0017] 圖4示出了 pH和不同熱處理對DCS 1582(枯草芽孢桿菌菌株LSSA01)的無細胞 發(fā)酵物抗大腸桿菌的活性的效應(yīng)。
[0018] 圖5示出了 pH和不同熱處理對DCS 1583(枯草芽孢桿菌菌株ABP278)的無細胞 發(fā)酵物抗大腸桿菌的活性的效應(yīng)。
[0019] 圖6示出了 pH和不同熱處理對DCS 1584(枯草芽孢桿菌菌株BS18)的無細胞發(fā) 酵物抗大腸桿菌的活性的效應(yīng)。
[0020] 圖7示出了 pH和不同熱處理對DCS 1579 (枯草芽孢桿菌菌株22C-P1)的無細胞 發(fā)酵物抗單核細胞增多性李斯特菌（L. monocytogenes)的活性的效應(yīng)。
[0021] 圖8示出了 pH和不同熱處理對DCS 1580 (枯草芽孢桿菌菌株15A-P4)的無細胞 發(fā)酵物抗單核細胞增多性李斯特菌的活性的效應(yīng)。
[0022] 圖9示出了 pH和不同熱處理對DCS 1581(枯草芽孢桿菌菌株3A-P4)的無細胞發(fā) 酵物抗單核細胞增多性李斯特菌的活性的效應(yīng)。
[0023] 圖10示出了 pH和不同熱處理對DCS 1582(枯草芽孢桿菌菌株LSSA01)的無細胞 發(fā)酵物抗單核細胞增多性李斯特菌的活性的效應(yīng)。
[0024] 圖11示出了 pH和不同熱處理對DCS 1583(枯草芽孢桿菌菌株ABP278)的無細胞 發(fā)酵物抗單核細胞增多性李斯特菌的活性的效應(yīng)。
[0025] 圖12示出了 pH和不同熱處理對DCS 1584(枯草芽孢桿菌菌株BS18)的無細胞發(fā) 酵物抗單核細胞增多性李斯特菌的活性的效應(yīng)。
[0026] 圖13示出了發(fā)酵物與各種酶一起溫育對抗大腸桿菌DCS 229的活性的效應(yīng)，表示 為與未處理樣品相比的殘余活性（％)。
[0027] 圖14示出了發(fā)酵物與各種酶一起溫育對抗單核細胞增多性李斯特菌DCS 1081的 活性的效應(yīng)，表示為與未處理樣品相比的殘余活性（％ )。
[0028] 圖15示出了來自枯草芽孢桿菌菌株858、15八-?4、22(：-?1、34?-4和852084的基因 組草圖的基因組相似性。
[0029] 圖16示出了平均光密度（扣除陰性對照）相對于30°C下的溫育時間的圖。
[0030] 圖17示出了對于每條曲線而言與y = 0. 1相對應(yīng)的X值的外推以及推導(dǎo)的X值 的自然對數(shù)（lm)相對于每條曲線代表的樣品濃度作圖。
[0031] 圖18示出了 In(達到(λ 1的0D的時間）與樣品濃度的線性相關(guān)性。
[0032] 圖19示出了用于分析不同發(fā)酵物制劑的方法的示意圖。
[0033] 圖20示出了來自菌株芽孢桿菌DCS 1580的發(fā)酵物抗若干目標(biāo)微生物的平均活 性。數(shù)據(jù)源自發(fā)酵物制備的三個生物學(xué)平行樣。誤差條顯示±1SD。
[0034] 圖21示出了來自菌株芽孢桿菌DCS 1581的發(fā)酵物抗若干目標(biāo)微生物的平均活 性。數(shù)據(jù)源自發(fā)酵物制備的三個生物學(xué)平行樣。誤差條顯示±1SD。
[0035] 圖22示出了來自菌株芽孢桿菌DCS 1582的發(fā)酵物抗若干目標(biāo)微生物的平均活 性。數(shù)據(jù)源自發(fā)酵物制備的三個生物學(xué)平行樣。誤差條顯示±1SD。
[0036] 圖23示出了來自菌株芽孢桿菌DCS 1584的發(fā)酵物抗若干目標(biāo)微生物的平均活 性。數(shù)據(jù)源自發(fā)酵物制備的三個生物學(xué)平行樣。誤差條顯示±1SD。
[0037] 圖24示出了在_20°C下儲存14天后不同液體發(fā)酵物制劑的平均活性。
[0038] 圖25示出了在4°C下儲存21天后不同凍干發(fā)酵物制劑的平均活性。
[0039] 圖26示出了與未處理對照樣品相比，來自芽孢桿菌DCS 1580 (F 1580)的發(fā)酵物 抗超高溫滅菌乳中的大腸桿菌庫的抗微生物活性。誤差條指示±1SD。
[0040] 圖27示出了來自芽孢桿菌DCS 1580(F 1580)的發(fā)酵物抗超高溫滅菌乳中的沙門 氏菌菌種（Salmonella spp.)庫的抗微生物活性。誤差條指示與未處理對照樣品相比的 ±1SD。
[0041] 圖28示出了與未處理對照樣品相比，來自芽孢桿菌DCS 1581 (F 1581)的發(fā)酵物 抗超高溫滅菌乳中的大腸桿菌庫的抗微生物活性。誤差條指示±1SD。
[0042] 圖29示出了與未處理對照樣品相比，來自芽孢桿菌DCS 1581 (F 1581)的發(fā)酵物 抗超高溫滅菌乳中的沙門氏菌菌種庫的抗微生物活性。誤差條指示±1SD。
[0043] 圖30示出了與未處理對照樣品相比，來自芽孢桿菌DCS 1582 (F 1582)的發(fā)酵物 抗超高溫滅菌乳中的大腸桿菌庫的抗微生物活性。誤差條指示±1SD。
[0044] 圖31示出了與未處理對照樣品相比，來自芽孢桿菌DCS 1582 (F 1582)的發(fā)酵物 抗超高溫滅菌乳中的沙門氏菌菌種庫的抗微生物活性。誤差條指示±1SD。
[0045] 圖32示出了與未處理對照樣品和凍干CAS0添加劑相比，來自芽孢桿菌DCS 1584(F 1584)的發(fā)酵物抗超高溫滅菌乳中的大腸桿菌庫的抗微生物活性。誤差條指示 ±1SD。
[0046] 圖33示出了與未處理對照樣品和凍干CAS0添加劑相比，來自芽孢桿菌DCS 1584(F 1584)的發(fā)酵物抗超高溫滅菌乳中的沙門氏菌菌種庫的抗微生物活性。誤差條指示 ±1SD。
[0047] 圖34示出了從寵物食物設(shè)施分離的腸道沙門氏菌腸道亞種（Salmonella enterica subsp.enterica)菌株的系統(tǒng)樹圖。
[0048] 圖35示出了當(dāng)在抑制肉湯測定法中測試時來自BS18和15AP4的發(fā)酵物對從寵物 食物設(shè)施分離的腸道沙門氏菌腸道亞種菌株的效應(yīng)。數(shù)據(jù)是針對10 %體積比和50 %體積 比的發(fā)酵物與目標(biāo)生物體培養(yǎng)物示出的。結(jié)果示出為相對于陰性對照（無發(fā)酵物）所計算 的百分比抑制值。
[0049] 圖36示出了當(dāng)在抑制肉湯測定法中測試時來自BS18和15AP4的發(fā)酵物對涉及多 種寵物食物的中毒/召回的已表征的腸道沙門氏菌腸道亞種菌株的效應(yīng)。數(shù)據(jù)是針對10 % 體積比和50%體積比的發(fā)酵物與目標(biāo)生物體培養(yǎng)物示出的。結(jié)果示出為相對于陰性對照 (無發(fā)酵物）所計算的百分比抑制值。
[0050] 圖37示出了當(dāng)在抑制肉湯測定法中測試時來自22CP1、LSSA01、3AP4和BS2084的 發(fā)酵物對從寵物食物設(shè)施分離的腸道沙門氏菌腸道亞種菌株的效應(yīng)。數(shù)據(jù)是針對10%體積 比和50%體積比的發(fā)酵物與目標(biāo)生物體培養(yǎng)物示出的。結(jié)果示出為相對于陰性對照（無發(fā) 酵物）所計算的百分比抑制值。
[0051] 圖38示出了當(dāng)在抑制肉湯測定法中測試時來自22CP1、LSSA01、3AP4和BS2084的 發(fā)酵物對涉及多種寵物食物的中毒/召回的已表征的腸道沙門氏菌腸道亞種菌株的效應(yīng)。 數(shù)據(jù)是針對10%體積比和50%體積比的發(fā)酵物與目標(biāo)生物體培養(yǎng)物示出的。結(jié)果示出為 相對于陰性對照（無發(fā)酵物）所計算的百分比抑制值。
[0052] 圖39示出了當(dāng)在抑制肉湯測定法中測試時來自ABP278的發(fā)酵物對從寵物食物設(shè) 施分離的腸道沙門氏菌腸道亞種菌株的效應(yīng)。數(shù)據(jù)是針對10%體積比和50%體積比的發(fā) 酵物與目標(biāo)生物體培養(yǎng)物示出的。結(jié)果示出為相對于陰性對照（無發(fā)酵物）所計算的百分 比抑制值。
[0053] 圖40示出了當(dāng)在抑制肉湯測定法中測試時來自ABP278的發(fā)酵物對涉及多種寵物 食物的中毒/召回的已表征的腸道沙門氏菌腸道亞種菌株的效應(yīng)。數(shù)據(jù)是針對10%體積比 和50%體積比的發(fā)酵物與目標(biāo)生物體培養(yǎng)物示出的。結(jié)果示出為相對于陰性對照（無發(fā)酵 物）所計算的百分比抑制值。
[0054] 圖41示出了涂布在狗糧上的4種不同凍干枯草芽孢桿菌發(fā)酵物（15A-P4(DCS 1580)、3A-P4(DCS 1581)、LSSA01(DCS 1582)和 BS18(DCS 1584))抗沙門氏菌屬庫的抗微 生物活性。這與陰性對照進行比較，在陰性對照中，狗糧未涂布有發(fā)酵物。顯示了隨時間推 移（天），沙門氏菌菌種的Log 1(l (CFU/g)減少。誤差條指示± 1SD。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0055] 本發(fā)明的根本發(fā)現(xiàn)在于枯草芽孢桿菌菌株的無細胞發(fā)酵產(chǎn)物具有防止污染物和/ 或微生物污染的示例性效用。
[0056] 本發(fā)明人首次表明，通過培養(yǎng)枯草芽孢桿菌菌株22C-P1、15A-P4、3A-P4、LSSA01、 ABP278、BS 2084和BS18中任一種或其組合獲得的無細胞發(fā)酵物具有抗革蘭氏陽性細菌、 革蘭氏陰性細菌和真菌的廣譜活性。
[0057] 本發(fā)明的另一個驚奇發(fā)現(xiàn)是發(fā)酵物中的化合物可在儲存過程中保持處于代謝活 性狀態(tài)。
[0058] 本發(fā)明基于該驚奇發(fā)現(xiàn)，預(yù)測可使此類無細胞發(fā)酵物（即從活細菌分離）儲存穩(wěn) 定并具有在廣泛應(yīng)用中作為抗污染組合物的效用。
[0059] 基于這些發(fā)現(xiàn)，我們提供具有下列優(yōu)點中的一者或多者的抗污染組合物：其是天 然抗污染組合物；其易于制備；其生產(chǎn)具有成本效益；和/或其具有廣譜的抗污染活性。
[0060] 發(fā)明陳沭
[0061] 在第一方面，本發(fā)明提供抗污染組合物，所述抗污染組合物包含選自如下的一種 或多種枯草芽孢桿菌菌株的無細胞發(fā)酵產(chǎn)物：22C-P1、15A-P4、3A-P4、LSSA01、ABP278、BS 2084 和 BS18。
[0062] 在第一方面，本發(fā)明提供抗污染組合物，所述抗污染組合物包含選自如下的一 種或多種枯草芽孢桿菌菌株的無細胞發(fā)酵產(chǎn)物：22C-P1、15A-P4、3A-P4、LSSA01、ABP278、 BS2084和BS18 ;其中所述發(fā)酵產(chǎn)物包含選自如下的一種或多種化合物：脂肽、聚酮化合物、 嗜鐵素（bacillibactin)、桿菌溶素、抗莢膜菌素、plantazolicin、LCI、plantazolicin 的 同源物和LCI的同源物。
[0063] 有利地，已發(fā)現(xiàn)此類組合物可能具有抗污染微生物的廣譜抑制活性。
[0064] 此外，此類組合物在多種行業(yè)中可能是高度期望的，所述行業(yè)例如為食物行業(yè)，在 食物行業(yè)中，消費者要求使用更多天然防腐劑。
[0065] 在另一個方面，本發(fā)明的抗污染組合物還包含一種或多種附加組分，例如載體、輔 助劑、增溶劑、懸浮劑、稀釋劑、氧氣清除劑、抗氧化劑或食物材料。適當(dāng)?shù)兀环N附加組分可 為氧氣清除劑和/或抗氧化劑。
[0066] 有利地，氧氣清除劑和/或抗氧化劑的使用可增加本發(fā)明的抗污染組合物的儲存 穩(wěn)定性和/或可延長施加抗污染組合物的產(chǎn)品的貨架期。
[0067] 在一個方面，本發(fā)明的抗污染組合物包含選自如下的多種化合物：脂肽、聚酮化合 物、嗜鐵素、桿菌溶素、抗莢膜菌素、plantazolicin、LCI、plantazolicin的同源物和LCI的 同源物。
[0068] 在一個方面，本發(fā)明的抗污染組合物包含選自如下的一種或多種部分分離的化合 物：脂肽、聚酮化合物、嗜鐵素、桿菌溶素、抗莢膜菌素、plantazolicin、LCI、plantazolicin 的同源物和LCI的同源物。
[0069] 在另一個方面，本發(fā)明的無細胞發(fā)酵產(chǎn)物或抗污染組合物可為無細胞發(fā)酵物。有 利地，該方面可提供制備抗污染組合物的成本效益和/或簡便性。另外或在替代形式中，該 方面可提供抗污染微生物的廣譜抑制活性。
[0070] 在一個方面，本發(fā)明的無細胞發(fā)酵產(chǎn)物或抗污染組合物可包含一種或多種附加抗 污染劑。
[0071] 在一個方面，本發(fā)明的組合物可有效抵抗革蘭氏陰性細菌、革蘭氏陽性細菌或真 菌中的一種或多種。優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物可有效抵抗多種微生物，如選自如下的微生 物：革蘭氏陰性細菌、革蘭氏陽性細菌和真菌。
[0072] 在一個方面，本發(fā)明的組合物有效抵抗來自選自如下的屬的一種或多種革蘭氏 陰性細菌：沙門氏菌屬；埃希氏菌屬（Escherichia);哈夫尼菌屬（Hafnia);克雷伯氏 菌屬（Klebsiella);假單胞菌屬（Pseudomonas);志賀菌屬（Shigella)和耶爾森菌屬 (Yersinia)〇
[0073] 在一個方面，本發(fā)明的組合物有效抵抗如下一種或多種：腸道沙門氏菌 (Salmonella enterica);大腸桿菌（Escherichia coli);蜂房哈夫尼菌（Hafnia alvei)； 產(chǎn)酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca);突光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens);惡 臭假單胞菌（Pseudomonas putida);鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium);福氏 志賀菌（Shigella flexneri);宋內(nèi)志賀菌（Shigella sonnei)和小腸結(jié)腸炎耶爾森菌 (Yersinia enterocolitica)〇
[0074] 在一個方面，本發(fā)明的組合物有效抵抗腸道沙門氏菌菌株。
[0075] 適當(dāng)?shù)兀景l(fā)明的組合物可有效抵抗如下一種或多種：腸道沙門氏菌鴨血清 型（Salmonella enterica ser.Anatum);腸道沙門氏菌布靈得盧柏血清型（Salmonella enterica ser.Braenderup);腸道沙門氏菌德爾卑血清型（Salmonella enterica ser. Derby);腸道沙門氏菌腸炎血清型（Salmonella enterica ser.Enteritidis);腸道 沙門氏菌哈達爾血清型（Salmonella enterica ser. Hadar);腸道沙門氏菌嬰兒血清 型（Salmonella enterica ser.Infantis);腸道沙門氏菌凱道古血清型（Salmonella enterica ser.Kedougou);腸道沙門氏菌姆班達卡血清型（Salmonella enterica ser. Mbandaka);腸道沙門氏菌蒙得維的亞血清型（Salmonella enterica ser. Montevideo); 腸道沙門氏菌諾伊斯特爾血清型（Salmonella enterica ser. Neumuenster);腸道沙門 氏菌新港血清型（Salmonella enterica ser. Newport);腸道沙門氏菌俄亥俄血清型 (Salmonella enterica ser. Ohio);腸道沙門氏菌史華氏血清型（Salmonella enterica ser. Schwarzengrund);腸道沙門氏菌桑夫頓堡血清型（Salmonella enterica ser. Senftenberg);腸道沙門氏菌田納西血清型（Salmonella enterica ser. Tennessee);腸道 沙門氏菌湯普森氏血清型（Salmonella enterica ser. Thompson)以及腸道沙門氏菌鼠傷 寒血清型（Salmonella enterica ser. Typhimurium) 〇
[0076] 適當(dāng)?shù)?，本發(fā)明的組合物可有效抵抗埃希氏菌（如，大腸桿菌（Escherichia coli))〇
[0077] 適當(dāng)?shù)?，本發(fā)明的組合物可有效抵抗如下一種或多種：大腸桿菌DCS15(如，大腸 桿菌0157 :H7)、大腸桿菌DCS 492、大腸桿菌DCS 493、大腸桿菌DCS 494、大腸桿菌DCS 495、大腸桿菌DCS 496、大腸桿菌DCS 497、大腸桿菌DCS 546、大腸桿菌DCS 558、大腸桿菌 DCS 1336以及大腸桿菌DCS 1396。
[0078] 在一個方面，本發(fā)明的組合物有效抵抗來自選自如下的屬的一種或多種革蘭氏陽 性細菌：李斯特菌屬（Listeria);芽孢桿菌屬（Bacillus);環(huán)絲菌屬（Brochothrix);梭 菌屬（Clostridium);腸球菌屬（Enterococcus);乳桿菌屬（Lactobacillus);明串珠菌屬 (Leuconostoc)以及葡萄球菌（Staphylococcus)。
[0079] 在一個方面，本發(fā)明的組合物有效抵抗如下一種或多種：單核細胞增多性李斯 特菌（Listeria monocytogenes);凝結(jié)芽抱桿菌（Bacillus coagulans)抱子；地衣芽抱 桿菌（Bacillus licheniformis);地衣芽孢桿菌孢子；枯草芽孢桿菌孢子；熱殺索絲菌 (Brochothrix thermosphacta);產(chǎn)氣莢膜梭狀芽抱桿菌（Clostridium perfrmgens);生 抱梭菌（Clostridium sporogenes)抱子；幾腸球菌（Enterococcus faecalis) 雞腸 球菌（Enterococcus gall inarum);香腸乳桿菌（Lactobacillus farciminis);發(fā)酵乳 桿菌（Lactobacillus fermentum);植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum);清酒乳桿 菌（Lactobacillus sakei);腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides);無害李斯特 菌（Listeria innocua);金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)以及表皮葡萄球菌 (Staphylococcus epidermidis)〇
[0080] 在一個方面，本發(fā)明的組合物有效抵抗來自選自如下的屬的一種或多種真菌： 曲霉屬（Aspergillus);假絲酵母屬（Candida);德巴利酵母屬（Debaryomyces);克魯 維酵母屬（Kluyveromyces);青霉屬（Penicillium);畢赤酵母屬（Pichia);紅酵母屬 (Rhodotorula);酵母屬（Saccharomyces)以及接合酵母屬（Zygosaccharomyces)。
[0081] 在一個方面，本發(fā)明的組合物有效抵抗如下一種或多種：寄生曲霉 (Aspergillus parasiticus);雜色曲霉（Aspergillus versicolor);近平滑假絲酵 母（Candida parapsilosis);熱帶假絲酵母（Candida tropicalis);弗氏梓樣酸桿菌 (Citrobacter freundii);漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii);馬克斯克魯維酵 母（Kluyveromyces marxianus);團青霉（Penicillium commune);異常畢赤酵母（Pichia anomala);粘紅酵母（Rhodotorula glutinis);膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa); 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)以及拜氏接合酵母（Zygosaccharomyces bailii)。
[0082] 在一個方面，本發(fā)明的組合物為固體、半固體、液體或凝膠形式，例如片劑、丸劑、 膠囊劑、粉末、液體、懸浮液、分散劑或乳液。
[0083] 在一個方面，本發(fā)明的組合物被密封。
[0084] 在一個方面，本發(fā)明的組合物被氣密封。
[0085] 在另一個方面，本發(fā)明提供制備抗污染組合物的方法，該方法包括：
[0086] a)將包含選自如下的至少一種枯草芽孢桿菌菌株的一種或多種細菌：22C_P1、 15A-P4、3A-P4、LSSA01、ABP278、BS 2084和BS18培養(yǎng)在底物之上或之中，以產(chǎn)生包含至少 一種抗污染化合物的發(fā)酵物，所述至少一種抗污染化合物例如為選自脂肽、聚酮化合物、嗜 鐵素、桿菌溶素、抗莢膜菌素、plantazolicin、LCI、plantazolicin的同源物和LCI的同源 物的化合物；和
[0087] b)使活細胞分離和/或失活。
[0088] 適當(dāng)?shù)?，也可將細菌孢子從發(fā)酵物分離和/或使之失活。
[0089] 適當(dāng)?shù)?，根?jù)本發(fā)明的枯草芽孢桿菌菌株的培養(yǎng)可在5至9的pH范圍內(nèi)的pH下 進行。
[0090] 此外或在替代形式中，可將發(fā)酵產(chǎn)物的pH調(diào)節(jié)到pH 6至10的范圍內(nèi)的pH。
[0091] 令人驚奇的是，已發(fā)現(xiàn)在中性和/或堿性pH下培養(yǎng)或儲存本發(fā)明的抗污染組合物 增加了抗污染組合物的儲存穩(wěn)定性和/或使組合物的抗污染活性穩(wěn)定。
[0092] 在一個方面，發(fā)酵物可進行一個或多個（另外的）分離和/或離析步驟以產(chǎn)生發(fā) 酵物的上清液或其級分或組分。適當(dāng)?shù)?，其級分或組分可包含選自如下的至少一種化合物： 脂肽、聚酮化合物、嗜鐵素、桿菌溶素、抗莢膜菌素、plantazolicin、LCI、plantazolicin的 同源物和LCI的同源物。
[0093] 在另一個方面，選自如下的至少一種化合物被分離和/或純化：脂肽、聚酮化合 物、嗜鐵素、桿菌溶素、抗莢膜菌素、plantazolicin、LCI、plantazolicin的同源物和LCI的 同源物。適當(dāng)?shù)?，多種化合物可被分離和/或純化。
[0094] 適當(dāng)?shù)兀景l(fā)明的組合物可包含化合物脂肽、聚酮化合物、嗜鐵素、桿菌溶素、抗莢 膜菌素、plantazolicin、LCI、plantazolicin的同源物和LCI的同源物中的2種或更多種、 適當(dāng)?shù)?種或更多種、適當(dāng)?shù)?種或更多種。
[0095] 在一個方面，培養(yǎng)步驟處于約10至約55°C溫度范圍內(nèi)的溫度下。
[0096] 在一個方面，培養(yǎng)物的底物包含允許細菌生長的任何合適營養(yǎng)培養(yǎng)基。例如，底物 可包含脫脂干奶粉、蔬菜（如，玉米、馬鈴薯、卷心菜）、淀粉、谷粒（如，水稻、小麥、大麥、蛇 麻子）、水果（如，葡萄、蘋果、橙子）、糖、甘蔗、肉（如，牛肉、家禽肉、豬肉、臘腸）、心浸液、 培養(yǎng)的右旋糖、其組合、以及含有最適生長所需的蛋白質(zhì)、碳水化合物和礦物的培養(yǎng)基。 [0097] 在另一個方面，培養(yǎng)物的底物可包含下列的任何一種：碳水化合物、蛋白胨、磷酸 鹽、鹽、緩沖鹽或其組合。
[0098] 僅以舉例的方式，培養(yǎng)物的底物可包含TSB或CAS0培養(yǎng)基（如，CAS0肉湯）或其 組合。
[0099] 在一個實施例中，培養(yǎng)物的底物為CAS0培養(yǎng)基、適當(dāng)?shù)谻AS0肉湯。
[0100] 在一個方面，底物可包括淀粉、大豆、酵母提取物和鹽中的一種或多種。
[0101] 在一個方面，使用選自如下的多種枯草芽孢桿菌菌株進行培養(yǎng)：22C-P1、15A-P4、 3A-P4、LSSA01、ABP278、BS 2084 和 BS18。
[0102] 在一個方面，培養(yǎng)物可包含一種或多種附加細菌。
[0103] 在一個方面，培養(yǎng)步驟進行約1至約48小時。
[0104] 在一個方面，用于制備根據(jù)本發(fā)明的抗污染組合物的方法包括添加氧氣清除劑和 /或抗氧化劑。
[0105] 抗氧化劑的例子包括：抗壞血酸、多酚、維生素 Ε、β -胡蘿卜素、迷迭香提取物、甘 露醇和ΒΗΑ。
[0106] 在一個方面，用于制備本發(fā)明的抗污染組合物的方法包括如在容器例如包裝中密 封（優(yōu)選地氣密封）發(fā)酵物或上清液、其級分或組分的步驟。容器（如包裝）也可包含清 除氧氣的化合物。
[0107] 在一個方面，本發(fā)明涉及由本發(fā)明的方法制備的抗污染組合物。
[0108] 在另一個方面，本發(fā)明涉及防止和/或減少產(chǎn)品的微生物污染的方法，所述方法 包括使產(chǎn)品的至少一種組成組分、產(chǎn)品本身和/或產(chǎn)品的包裝與根據(jù)本發(fā)明的或通過根據(jù) 本發(fā)明的方法制備的抗污染組合物接觸的步驟。
[0109] 本文所用的術(shù)語"產(chǎn)品"包括：食品（例如肉制品、動物飼料和寵物食物）；表面涂 層材料（例如涂料）和農(nóng)產(chǎn)品（例如作物和種子）。
[0110] 在一個方面，將產(chǎn)品的組成組分或產(chǎn)品本身與本發(fā)明的抗污染組合物混合。
[0111] 在另一個方面，將本發(fā)明的抗污染組合物施加于產(chǎn)品、其組成組分和/或產(chǎn)品包 裝的表面。
[0112] 在一個方面，防止和/或減少本發(fā)明的產(chǎn)品的微生物污染的方法使得革蘭氏陽性 細菌、革蘭氏陰性細菌或真菌中的一種或多種所致的微生物污染得以防止和/或減少。
[0113] 在一個方面，防止和/或減少本發(fā)明的產(chǎn)品的微生物污染的方法使得至少一種革 蘭氏陽性細菌、至少一種革蘭氏陰性細菌和至少一種真菌所致的微生物污染得以防止和/ 或減少。
[0114] 在另一個方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的抗污染組合物的產(chǎn)品或根據(jù)本發(fā)明制備 的產(chǎn)品和/或因進行本發(fā)明的方法而導(dǎo)致具有減少的微生物污染的產(chǎn)品。
[0115] 在一個方面，根據(jù)本發(fā)明的抗污染組合物為作物保護劑或被配制為作物保護劑， 如殺真菌劑或殺細菌劑。
[0116] 在另一個方面，本發(fā)明涉及使用根據(jù)本發(fā)明的抗污染組合物防止產(chǎn)品的微生物污 染。適當(dāng)?shù)?，產(chǎn)品為下列的任何一種：本文所用的術(shù)語"產(chǎn)品"包括：食品（例如肉制品、動 物飼料和寵物食物）；表面涂層材料（例如涂料）和農(nóng)產(chǎn)品（例如作物、種子等等）。
[0117] 在又一個方面，本發(fā)明涉及用于篩選有效抵抗一種或多種目標(biāo)污染微生物的抗污 染組合物的方法，所述方法包括：
[0118] a)將包含選自如下的至少一種枯草芽孢桿菌菌株的一種或多種細菌：22C_P1、 15A-P4、3A-P4、LSSA01、ABP278、BS 2084和BS18培養(yǎng)在底物之上或之中，以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物；
[0119] b)使活細胞分離和/或失活，并且任選地，使孢子分離和/或失活；
[0120] c)測試發(fā)酵產(chǎn)物抗目標(biāo)污染微生物的抗微生物活性；和
[0121] d)選擇具有抗目標(biāo)污染微生物的抗微生物活性的發(fā)酵產(chǎn)物；
[0122] 其中步驟b)可在步驟c)和d)之前、期間和/或之后進行。
[0123] 此類方法也可包括一個或多個（另外的）分離和/或離析步驟。
[0124] 在一個方面，如果按照本文教導(dǎo)的"平板擴散測定法"方案觀察到至少2mm的抑菌 區(qū)/圈，則認(rèn)為抗污染組合物或發(fā)酵產(chǎn)物或無細胞發(fā)酵產(chǎn)物能有效抵抗污染微生物（一種 或多種）。
[0125] 在另一個方面，如果在本文教導(dǎo)的"抑制肉湯測定法"中具有至少約20%抑制，則 認(rèn)為抗污染組合物或發(fā)酵產(chǎn)物或無細胞發(fā)酵產(chǎn)物能有效抵抗污染微生物（一種或多種）。
[0126] 在另一個方面，如果在通過本文教導(dǎo)的"有效濃度測定法"測量時具有至少約 100% (體積比）的有效濃度，則認(rèn)為抗污染組合物或發(fā)酵產(chǎn)物或無細胞發(fā)酵產(chǎn)物能有效抵 抗污染微生物（一種或多種）。
[0127] 在另一個方面，如果具有不止一種、優(yōu)選地所有三種下列活性，則認(rèn)為抗污染組合 物或發(fā)酵產(chǎn)物或無細胞發(fā)酵產(chǎn)物能有效抵抗微生物：如果按照"平板擴散測定法"方案觀察 到至少2_的抑菌區(qū)；"抑制肉湯測定法"中的至少約20%抑制；通過"有效濃度測定法"測 得的至少約100% (體積比）的有效濃度。
[0128] 在一個實施例中，本發(fā)明的發(fā)酵產(chǎn)物可包含選自如下的一種或多種化合物的類似 物：脂肽、聚酮化合物、嗜鐵素、桿菌溶素、抗莢膜菌素、plantazolicin和LCI。
[0129] 適當(dāng)?shù)?，所述類似物可為選自如下的一種或多種化合物的類似物：脂肽、聚酮化合 物、嗜鐵素、桿菌溶素、抗莢膜菌素。
[0130] 在一個實施例中，本發(fā)明的發(fā)酵產(chǎn)物可包含選自如下的一種或多種化合物的同源 物：脂肽、聚酮化合物、嗜鐵素、桿菌溶素、抗莢膜菌素、plantazolicin和LCI。
[0131] 適當(dāng)?shù)?，所述同源物可為選自如下的一種或多種化合物的同源物： plantazolicin(小菌素）和 LCI。
[0132] 在一個實施例中，本發(fā)明所用的枯草芽孢桿菌菌株為22C-P1。因此適當(dāng)?shù)?，抗污?組合物可包含枯草芽孢桿菌22C-P1的無細胞發(fā)酵產(chǎn)物?？莶菅挎邨U菌22C-P1的無細胞發(fā) 酵產(chǎn)物可包含選自如下的一種或多種化合物：脂肽、聚酮化合物、嗜鐵素、桿菌溶素、抗莢膜 菌素、plantazolicin、LCI、plantazolicin 的同源物和 LCI 的同源物。
[0133] 在一個實施例中，本發(fā)明所用的枯草芽孢桿菌菌株為15A-P4。因此適當(dāng)?shù)?，抗污?組合物可包含枯草芽孢桿菌15A-P4的無細胞發(fā)酵產(chǎn)物?？莶菅挎邨U菌15A-P4的無細胞發(fā) 酵產(chǎn)物可包含選自如下的一種或多種化合物：脂肽、聚酮化合物、嗜鐵素、桿菌溶素、抗莢膜 菌素、plantazolicin、LCI、plantazolicin 的同源物和 LCI 的同源物。
[0134] 在一個實施例中，本發(fā)明所用的枯草芽孢桿菌菌株為3A-P4。因此適當(dāng)?shù)兀刮廴?組合物可包含枯草芽孢桿菌3A-P4的無細胞發(fā)酵產(chǎn)物?？莶菅挎邨U菌3A-P4的無細胞發(fā)酵 產(chǎn)物可包含選自如下的一種或多種化合物：脂肽、聚酮化合物、嗜鐵素、桿菌溶素、抗莢膜菌 素、plantazolicin、LCI、plantazolicin 的同源物和 LCI 的同源物。
[0135] 在一個實施例中，本發(fā)明所用的枯草芽孢桿菌菌株為LSSA01。因此適當(dāng)?shù)?，抗污?組合物可包含枯草芽孢桿菌LSSA01的無細胞發(fā)酵產(chǎn)物?？莶菅挎邨U菌LSSA01的無細胞發(fā) 酵產(chǎn)物可包含選自如下的一種或多種化合物：脂肽、聚酮化合物、嗜鐵素、桿菌溶素、抗莢膜 菌素、plantazolicin、LCI、plantazolicin 的同源物和 LCI 的同源物。
[0136] 在一個實施例中，本發(fā)明所用的枯草芽孢桿菌菌株為ABP278。因此適當(dāng)?shù)兀刮廴?組合物可包含枯草芽孢桿菌ABP278的無細胞發(fā)酵產(chǎn)物?？莶菅挎邨U菌ABP278的無細胞發(fā) 酵產(chǎn)物可包含選自如下的一種或多種化合物：脂肽、聚酮化合物、嗜鐵素、桿菌溶素、抗莢膜 菌素、plantazolicin、LCI、plantazolicin 的同源物和 LCI 的同源物。
[0137] 在一個實施例中，本發(fā)明所用的枯草芽孢桿菌菌株為BS2084。因此適當(dāng)?shù)?，抗污?組合物可包含枯草芽孢桿菌BS2084的無細胞發(fā)酵產(chǎn)物?？莶菅挎邨U菌BS2084的無細胞發(fā) 酵產(chǎn)物可包含選自如下的一種或多種化合物：脂肽、聚酮化合物、嗜鐵素、桿菌溶素、抗莢膜 菌素、plantazolicin、LCI、plantazolicin 的同源物和 LCI 的同源物。
[0138] 在一個實施例中，本發(fā)明所用的枯草芽孢桿菌菌株為BS18。因此適當(dāng)?shù)?，抗污染組 合物可包含枯草芽孢桿菌BS18的無細胞發(fā)酵產(chǎn)物?？莶菅挎邨U菌BS18的無細胞發(fā)酵產(chǎn)物 可包含選自如下的一種或多種化合物：脂肽、聚酮化合物、嗜鐵素、桿菌溶素、抗莢膜菌素、 plantazolicin、LCI、plantazolicin 的同源物和 LCI 的同源物。
[0139] 在一個實施例中，發(fā)酵產(chǎn)物包含脂肽（如，表面活性素、芽孢菌霉素（如，芽孢菌霉 素 D)、豐原素或其組合）。
[0140] 在一個實施例中，發(fā)酵產(chǎn)物包含聚酮化合物（如，地非西丁、大環(huán)內(nèi)酰亞胺、 Bacillaene或其組合）。
[0141] 在一個實施例中，發(fā)酵產(chǎn)物包含嗜鐵素。
[0142] 在一個實施例中，發(fā)酵產(chǎn)物包含桿菌溶素。
[0143] 在一個實施例中，發(fā)酵產(chǎn)物包含抗莢膜菌素。
[0144] 在一個實施例中，發(fā)酵產(chǎn)物包含plantazolicin。
[0145] 在一個實施例中，發(fā)酵產(chǎn)物包含LCI。
[0146] 在一個實施例中，發(fā)酵產(chǎn)物包含plantazolicin的同源物。
[0147] 在一個實施例中，發(fā)酵產(chǎn)物包含LCI的同源物。
[0148] 在一個實施例中，本發(fā)明提供抗污染組合物，所述抗污染組合物包含選自如下的 一種或多種枯草芽孢桿菌菌株的無細胞發(fā)酵產(chǎn)物：LSSA01、ABP278、BS2084和BS18 ;其中所 述發(fā)酵產(chǎn)物包含選自如下的一種或多種化合物：脂肽、聚酮化合物、嗜鐵素、桿菌溶素、抗莢 膜菌素、plantazolicin、LCI、plantazolicin的同源物和LCI的同源物。
[0149] 在一個實施例中，本發(fā)明的脂肽選自：表面活性素、芽孢菌霉素（如，芽孢菌霉素 D)、豐原素或其組合。
[0150] 在另一個實施例中，本發(fā)明的聚酮化合物選自：地非西丁、大環(huán)內(nèi)酰亞胺、 bacillaene或其組合。

【具體實施方式】
[0151] 除非另有定義，否則本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都具有本公開文本所屬技術(shù) 領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。Singleton，et al.，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BI0L0GY，20ED·， John Wiley and Sons， New York(1994)(Singleton 等 人，《微生物學(xué)和分子生物學(xué)詞典》，第20版，約翰威利父子出版公司，紐約，1994年）以及 Hale&Marham,THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY,Harper Perennial,NY(1991) (Marham，《哈珀柯林斯生物學(xué)詞典》，哈珀永久出版社，紐約，1991年）為技術(shù)人員提供本公 開所使用的許多術(shù)語的通用詞典。
[0152] 本公開文本并不受本文公開的示例性方法和材料的限制，任何與本文所述的那些 方法和材料相似或等同的方法和材料都可用于本公開文本的實施方案的實施或試驗。數(shù)值 范圍包括限定該范圍的數(shù)字。
[0153] 本文提供的標(biāo)題并非對本公開文本的各個方面或?qū)嵤┓桨傅南拗?，這些方面或?qū)?施方案可通過將說明書作為一個整體來參考而得到。相應(yīng)地，下面就要定義的術(shù)語通過將 說明書作為一個整體來參考會得到更完全的定義。
[0154] 術(shù)語的其他定義可在整個本說明書中出現(xiàn)。在更詳細地描述示例性的實施方案之 前，應(yīng)理解本公開并不限于所描述的具體實施方案，因為這些實施方案當(dāng)然是可變的。還應(yīng) 理解，本文所用的術(shù)語僅出于描述具體的實施方案的目的，并不意在具有限制意義，因為本 發(fā)明的范圍將僅受所附權(quán)利要求的限定。
[0155] 在提供數(shù)值范圍的情況中，應(yīng)理解，該范圍的上限和下限之間的每個中間數(shù)值 (至下限的個位的十分之一，除非上下文另有清楚規(guī)定）也被具體公開。規(guī)定的范圍中的任 何規(guī)定值或中間值與該規(guī)定的范圍中的任何其他規(guī)定值或中間值之間的每個較小范圍，被 涵蓋在本公開文本內(nèi)。這些較小范圍的上限和下限可獨立地被包括或排除在該范圍中，而 且其中任一個、沒有一個或兩個界限被包括在較小范圍中的每個范圍也被涵蓋在本公開文 本中，但依據(jù)該規(guī)定的范圍中的任何被具體排除的界限而定。在規(guī)定的范圍包括界限中的 一個或兩個的情況中，排除這些被包括的界限中的任一個或兩個的范圍，也被包括在本公 開文本中。
[0156] 必須指出，本文和所附權(quán)利要求書中用到的名詞既有單數(shù)含義也有復(fù)數(shù)含義，除 非上下文另有清楚規(guī)定。因此，例如，提到"發(fā)酵產(chǎn)物"則包括多個這種候選劑，而提到"飼 料"則包括提到一種或多種飼料以及本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的它們的等同物，以此類推。
[0157] 本文述及的出版物只是為了它們在本申請的提交日之前的公開內(nèi)容而提供。本文 的任何內(nèi)容都不能被解釋為承認(rèn)這些出版物構(gòu)成本文所附權(quán)利要求的現(xiàn)有技術(shù)。
[0158] 本文所用的術(shù)語"無細胞發(fā)酵產(chǎn)物"是指在細菌細胞（包括優(yōu)選地孢子）中的一 些或所有已移除和/或失活后在合適培養(yǎng)基中培養(yǎng)（如，發(fā)酵）枯草芽孢桿菌菌株22C-P1、 15A-P4、3A-P4、LSSA01、ABP278、BS2084和BS18中的一種或多種所得的組合物；或其上清 液或級分或組分。在一個方面，無細胞發(fā)酵產(chǎn)物包含選自脂肽、聚酮化合物、嗜鐵素、桿菌溶 素、抗莢膜菌素、plantazolicin、LCI、plantazolicin的同源物和LCI的同源物的至少一種 或多種代謝物。適當(dāng)?shù)?，化合物（一種或多種）是正培養(yǎng)（如，發(fā)酵）的細菌的代謝物（一 種或多種）。
[0159] 在一個實施例中，抗污染組合物是無細胞發(fā)酵產(chǎn)物。例如，本發(fā)明的抗污染組合物 可僅是這樣的發(fā)酵物，其已被修飾來移除和/或失活細菌細胞以提供無細胞發(fā)酵物。
[0160] 如本文所用，術(shù)語"發(fā)酵物"是指在培養(yǎng)枯草芽孢桿菌菌株22C-P1、15A-P4、3A-P4、 LSSA01、ABP278、BS 2084和BS18中的一種或多種后（如，在培養(yǎng)結(jié)束時）存在的組成 組分的混合物。因此，本文所用的術(shù)語"發(fā)酵物"可包括一種或多種抗污染化合物（例如 脂肽（如，表面活性素、芽孢菌霉素（如，芽孢菌霉素 D)、豐原素或其組合）、聚酮化合物 (如，地非西丁、大環(huán)內(nèi)酰亞胺、bacillaene或其組合）、嗜鐵素、桿菌溶素、抗莢膜菌素、 plantazolicin、LCI、plantazolicin的同源物以及LCI的同源物）以及其他組分例如培養(yǎng) 過程中未利用的顆粒物、固體、底物，碎片、培養(yǎng)基、細胞廢物等。在一個方面，將細菌細胞 (和優(yōu)選地，孢子）從發(fā)酵物移除和/或失活以提供無細胞發(fā)酵物。
[0161] 本文所用的術(shù)語"無細胞"是指發(fā)酵產(chǎn)物（優(yōu)選發(fā)酵物）基本上不含活的細菌細 胞，通常包含小于約1〇 5個活的細菌細胞/毫升發(fā)酵產(chǎn)物，小于約1〇4個活的細菌細胞/毫 升發(fā)酵產(chǎn)物，小于約1〇 3個活的細菌細胞/毫升發(fā)酵產(chǎn)物，小于約1〇2個活的細菌細胞/毫 升發(fā)酵產(chǎn)物，或小于約10個活的細菌細胞/毫升發(fā)酵產(chǎn)物。優(yōu)選地，發(fā)酵產(chǎn)物基本上不含 細胞，通常包含小于約1〇 5個細胞/毫升發(fā)酵產(chǎn)物，小于約1〇4個細胞/毫升發(fā)酵產(chǎn)物，小于 約1〇3個細胞/毫升發(fā)酵產(chǎn)物，小于約1〇 2個細胞/毫升發(fā)酵產(chǎn)物，或小于約10個細胞/毫 升發(fā)酵產(chǎn)物。
[0162] 適當(dāng)?shù)?，發(fā)酵產(chǎn)物（優(yōu)選發(fā)酵物）可基本上不含活的細菌細胞，通常包含小于約 1〇2個活細胞/毫升發(fā)酵產(chǎn)物。
[0163] 適當(dāng)?shù)?，發(fā)酵產(chǎn)物（優(yōu)選發(fā)酵物）可基本上不含活的細菌細胞，通常包含小于約10 個活細胞/毫升發(fā)酵產(chǎn)物。
[0164] 適當(dāng)?shù)兀l(fā)酵產(chǎn)物（優(yōu)選發(fā)酵物）可基本上不含活的細菌細胞，通常包含零個（或 基本上零個）活細胞/毫升發(fā)酵產(chǎn)物。
[0165] 在一些方面，術(shù)語"無細胞"是指發(fā)酵產(chǎn)物基本上不含活孢子以及活細胞，通常包 含小于約10 5個活孢子/毫升發(fā)酵產(chǎn)物，小于約104個活孢子/毫升發(fā)酵產(chǎn)物，小于約103個 活孢子/毫升發(fā)酵產(chǎn)物，小于約1〇 2個活孢子/毫升發(fā)酵產(chǎn)物，或小于約10個活孢子/毫 升發(fā)酵產(chǎn)物。優(yōu)選地，發(fā)酵產(chǎn)物基本上不含孢子，通常包含小于約1〇 5個孢子/毫升發(fā)酵產(chǎn) 物，小于約1〇4個孢子/毫升發(fā)酵產(chǎn)物，小于約1〇3個孢子/毫升發(fā)酵產(chǎn)物，小于約1〇 2個孢 子/毫升發(fā)酵產(chǎn)物，或小于約10個孢子/毫升發(fā)酵產(chǎn)物。
[0166] 適當(dāng)?shù)?，發(fā)酵產(chǎn)物（優(yōu)選發(fā)酵物）可基本上不含活孢子，通常包含小于約102個活 孢子/毫升發(fā)酵產(chǎn)物。
[0167] 適當(dāng)?shù)?，發(fā)酵產(chǎn)物（優(yōu)選發(fā)酵物）可基本上不含活孢子，通常包含小于約10個活 孢子/暈升發(fā)酵產(chǎn)物。
[0168] 適當(dāng)?shù)?，發(fā)酵產(chǎn)物（優(yōu)選發(fā)酵物）可基本上不含活孢子，通常包含零個（或基本上 零個）活孢子/毫升發(fā)酵產(chǎn)物。
[0169] 在一個方面，本文所用的術(shù)語"無細胞"是指發(fā)酵產(chǎn)物（優(yōu)選發(fā)酵物）基本上不含 活的細菌細胞和活孢子，通常包含小于約1〇 5個活的細菌細胞和活孢子/毫升發(fā)酵產(chǎn)物，小 于約1〇4個活的細菌細胞和活孢子/毫升發(fā)酵產(chǎn)物，小于約1〇 3個活的細菌細胞和活孢子/ 毫升發(fā)酵產(chǎn)物，小于約1〇2個活的細菌細胞和活孢子/毫升發(fā)酵產(chǎn)物，或小于約10個活的 細菌細胞和活孢子/毫升發(fā)酵產(chǎn)物。優(yōu)選地，發(fā)酵產(chǎn)物基本上不含細胞和/或孢子，通常包 含小于約10 5個細胞和/或孢子/毫升發(fā)酵產(chǎn)物，小于約104個細胞和/或孢子/毫升發(fā)酵 產(chǎn)物，小于約1〇 3個細胞和/或孢子/毫升發(fā)酵產(chǎn)物，小于約1〇2個細胞和/或孢子/毫升 發(fā)酵產(chǎn)物，或小于約10個細胞和/或孢子/毫升發(fā)酵產(chǎn)物。
[0170] 適當(dāng)?shù)?，發(fā)酵產(chǎn)物（優(yōu)選發(fā)酵物）可基本上不含活的細菌細胞和活孢子，通常包含 小于約1〇 2個活細胞和/或活孢子/毫升發(fā)酵產(chǎn)物。
[0171] 適當(dāng)?shù)兀l(fā)酵產(chǎn)物（優(yōu)選發(fā)酵物）可基本上不含活的細菌細胞和活孢子，通常包含 小于約10個活細胞和/或活孢子/毫升發(fā)酵產(chǎn)物。
[0172] 適當(dāng)?shù)?，發(fā)酵產(chǎn)物（優(yōu)選發(fā)酵物）可基本上不含活的細菌細胞和活孢子，通常包含 零個（或基本上零個）活細胞和/或活孢子/毫升發(fā)酵產(chǎn)物。
[0173] 在一些方面，可對本發(fā)明的發(fā)酵產(chǎn)物（優(yōu)選地發(fā)酵物）進行處理（如，熱處理或輻 射），使得無細胞或孢子或其組合保持活性。
[0174] 本文所用的術(shù)語"活的"是指具有代謝活性或能夠分化的微生物細胞或孢子。因 此，當(dāng)孢子是休眠的并能夠萌發(fā)時，它們是"活的"。
[0175] 本文所用的術(shù)語"抗污染組合物"和"抗污染劑"是指在使用中可抵抗（即，反作 用于、妨礙、對抗、減少、防止或抑制）病原微生物的生長和/或在使用中可抵抗（如，減少 或防止或抑制）產(chǎn)品的腐?。▋?yōu)選地，微生物腐?。┑娜魏谓M合物/試劑。因此，"抗污染" 可為抗病原和/或抗腐敗的。在一些方面，"抗污染組合物"可為延長貨架期的組合物。
[0176] 本文所用的術(shù)語"污染物"是指任何微生物，例如病原微生物和腐敗微生物。在一 個方面，術(shù)語"污染物"是指病原微生物和/或腐敗微生物。
[0177] 術(shù)語"腐敗微生物"是指在外觀、味道、氣味和產(chǎn)品其他特性方面造成有害變化 (優(yōu)選地由微生物生長引起）的微生物。"腐敗微生物"可存在于產(chǎn)品使用期的任何時間點， 例如源自下列的一種或多種：從中獲得產(chǎn)品的環(huán)境和/或處于原料或未加工狀態(tài)（如，產(chǎn)品 天然狀態(tài)）的產(chǎn)品的微生物學(xué)特性和/或任何處理和/或加工步驟和/或包裝的有效性/ 無效性和/或產(chǎn)品的儲存條件。
[0178] 術(shù)語"病原微生物"是指能夠使人和/或動物發(fā)病的微生物。"病原微生物"可存 在于產(chǎn)品使用期的任何時間點，例如源自下列的一種或多種：從中獲得產(chǎn)品的環(huán)境和/或 處于原料或未加工狀態(tài)（如，產(chǎn)品天然狀態(tài)）的產(chǎn)品的微生物學(xué)特性和/或任何處理和/ 或加工步驟和/或包裝的有效性/無效性和/或產(chǎn)品的儲存條件。
[0179] 本文所用的術(shù)語"抑制"是指當(dāng)與不存在抗污染劑/組合物的情況下的污染微生 物的生長或存活相比時破壞、防止、控制、降低、減緩或以其它方式干擾污染微生物的生長 或存活。在一個方面，"抑制"是當(dāng)與不存在抗污染劑/組合物的情況下的污染微生物的生 長或存活相比時破壞、防止、控制、降低、減緩或以其它方式干擾污染微生物的生長或存活 至少約5%至至少約100%，或例如至少約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、或 100% 之間的任何值。 在另一個方面，"抑制"是當(dāng)與不存在抗污染劑/組合物的情況下的污染微生物的生長或存 活相比時破壞、防止、控制、降低、減緩或以其它方式干擾污染微生物的生長或存活至少約1 倍或更多，例如約1. 5倍至約100倍，或例如至少約2. 0、2. 5、3. 0、3. 5、4. 0、4. 5、5. 0、5. 5、 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、 85、90、95倍之間的任何值。
[0180] 本文所用的與微生物污染物相關(guān)的術(shù)語"減小"是指當(dāng)與未施加抗污染或抗微生 物劑的對照產(chǎn)品相比時微生物生長的水平和/或產(chǎn)品腐敗的速度減小。在一個方面，術(shù)語 "減小"和"減小的"可與術(shù)語"抑制"和"抑制的"互換使用。
[0181] 在一個方面，本文所用的術(shù)語"防止"是指包含本發(fā)明的抗污染組合物的產(chǎn)品或施 加本發(fā)明的抗污染組合物的產(chǎn)品受微生物污染時在存在特定量的污染物之前具有延長的 貨架期和/或增加的時間期限。在一個實施例中，當(dāng)與不具有所施加的抗污染組合物或抗 微生物劑的對照產(chǎn)品相比時貨架期和/或時間期限延長和/或增加。
[0182] 例如，當(dāng)污染物是病原微生物（如，病原細菌）時，"污染物的特定量"可以是例如 FDA認(rèn)為產(chǎn)品使用不安全的水平。在一些情況下，取決于病原微生物，污染物的特定量可以 是零。當(dāng)病原微生物是例如李斯特菌菌種時，這可能是如此。在其他情況下，污染物的特定 量可小于約l〇〇CFU/g或mL或者小于約10CFU/g或mL，例如當(dāng)病原細菌是例如大腸桿菌菌 種時。
[0183] 當(dāng)污染物是非病原腐敗細菌時，"特定量的污染物"可以是感官條件不再可接受的 水平或者消費者可見產(chǎn)品腐敗的水平。特定的量可取決于微生物。然而，在一些情況下，其 可為如10 3或104CFU/g或CFU/mL的存在量。
[0184] 菌株
[0185] 至少一種芽孢桿菌屬（如，枯草芽孢桿菌）菌株用來生成用于本文所公開的組 合物、方法和用途的發(fā)酵產(chǎn)物。適當(dāng)?shù)?，至少一種菌株可為選自如下的枯草芽孢桿菌菌 株：3A-P4(PTA-6506) ;15A-P4(PTA-6507) ;22C-Pl(PTA-6508) ;LSSA01(NRRL-B-50104); BS27(NRRL B-50105) ;BS 18(NRRL B-50633) ;BS 2084(NRRL B-500130)以及ABP 278(NRRL B-50634)。
[0186] 現(xiàn)有技術(shù)的一些建議是，可將枯草芽孢桿菌菌株3A-P4 (PTA-6506); 15A-P4(PTA-6507) ；22C-P1(PTA-6508) ；LSSA01 (NRRL-B-50104) ；BS27 (NRRL B-50105) ；BS 18 (NRRL B-50633) ;BS 2084 (NRRL B-500130)以及 ABP 278 (NRRL B-50634)重新分類為解 淀粉芽孢桿菌植物亞種（B.amyloliquefaciens subspecies plantarum)。為避免疑義，如 果這些菌株中的任何一種重新分類為解淀粉芽孢桿菌植物亞種（B. amyloliquefaciens)， 此類菌株（一種或多種）仍然被本發(fā)明涵蓋。
[0187] 菌株 3A-P4(PTA-6506)、15A-P4(PTA-6507)和 22C-P1 (PTA-6508)可從美國典型培 養(yǎng)物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC)公開獲得。
[0188] 菌株 2084(NRRL B-500130)和 LSSA01 (NRRL-B-50104)可從美國農(nóng)業(yè)研究菌種保 藏中心（Agricultural Research Service Culture Collection，NRRL)公開獲得。菌株枯 草芽孢桿菌LSSA01有時候稱為枯草芽孢桿菌8或BS8。
[0189] 這些菌株在US 7, 754, 469 B2中進行了教導(dǎo)。
[0190] 枯草芽孢桿菌BS 18和枯草芽孢桿菌BS 278分別以保藏號NRRL B-50633和 NRRL B-50634 由美國（W227 N752 Westmound Dr. Waukesha，WI 53186)的 Andy Madisen 或美國（W227 N752 Westmound Dr. Waukesha，WI 53186)的丹尼斯克美國公司（Danisco USA Inc.)于2012年1月9日按照布達佩斯條約（Budapest Treaty)保藏于美國 (1815North University Street，Peoria，Illinois 61604)的美國農(nóng)業(yè)研究菌種保藏中心 (Agricultural Research Service Culture Collection，NRRL)。菌株 BS 278 在本文也稱 為 ABP 278。
[0191] 美國（W227 N752 Westmound Dr. Waukesha，WI 53186)的 Andy Madisen 和美 國（W227 N752 Westmound Dr. Waukesha，WI 53186)的丹尼斯克美國公司授權(quán)丹麥的杜 邦營養(yǎng)生物科學(xué)公司（以前的丹尼斯克公司）（Langebrogade 1，P0 Box 17，DK-1001， Copenhagen K)在本專利申請中參考這些保藏的生物材料并且無保留地且不可撤銷地同意 將所述保藏材料成為可公共獲得的。
[0192] 在一個方面，多種枯草芽孢桿菌菌株用來生成用于本文所公開的組合物、方 法和用途的發(fā)酵產(chǎn)物。適當(dāng)?shù)?，所述多種枯草芽孢桿菌菌株可選自3A-P4(PTA-6506); 15A-P4(PTA-6507) ；22C-P1(PTA-6508) ；LSSA01(NRRL-B-50104) ；BS27(NRRL B-50105) ；BS 18(NRRL B-50633) ;BS 2084(NRRL B-500130)以及 ABP 278(NRRL B-50634)。
[0193] 適當(dāng)?shù)?，可使用兩種或更多種枯草芽孢桿菌菌株。適當(dāng)?shù)?，所使用的枯草芽孢桿菌 菌株中的至少兩種包括下表中詳述的組合的任何一種：
[0194]

【權(quán)利要求】
1. 一種抗污染組合物，所述抗污染組合物包含選自如下的一種或多種枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)菌株的無細胞發(fā)酵產(chǎn)物：22C-P1、15A-P4、3A-P4、LSSA01、ABP278、BS 2084和BS18 ;其中所述發(fā)酵產(chǎn)物包含選自如下的一種或多種化合物：脂肽、聚酮化合物、嗜 鐵素、桿菌溶素、抗莢膜菌素、plantazolicin、LCI、plantazolicin的同源物和LCI的同源 物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述脂肽選自：表面活性素、芽孢菌霉素（如， 芽孢菌霉素 D)、豐原素及其組合。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述聚酮化合物選自：地非西丁、 大環(huán)內(nèi)酰亞胺、bacillaene及其組合。
4. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的組合物，其中所述組合物還包含一種或多種附加 組分。
5. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的組合物，其中所述附加組分為載體、輔助劑、增溶 齊?、懸浮劑、稀釋劑、氧氣清除劑、抗氧化劑和/或食物材料。
6. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的組合物，其中所述組合物還包含氧氣清除劑和/ 或抗氧化劑。
7. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的組合物，其中所述組合物包含選自如下的 多種化合物：脂肽、聚酮化合物、嗜鐵素、桿菌溶素、抗莢膜菌素、plantazolicin、LCI、 plantazolicin的同源物和LCI的同源物。
8. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的組合物，其中所述脂肽選自：表面活性素、芽孢 菌霉素（如，芽孢菌霉素 D)、豐原素及其組合。
9. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的組合物，其中所述聚酮化合物選自：地非西丁、 大環(huán)內(nèi)酰亞胺、bacillaene及其組合。
10. 根據(jù)前述權(quán)利要求中一項所述的組合物，其中所述化合物被部分純化。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項所述的組合物，其中如果按照"平板擴散測定法"方 案觀察到至少2mm的抑菌區(qū)，則所述無細胞發(fā)酵產(chǎn)物能有效抵抗一種或多種污染微生物。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項所述的組合物，其中如果在"抑制肉湯測定法"中具 有至少約20%抑制，則所述無細胞發(fā)酵產(chǎn)物能有效抵抗一種或多種污染微生物。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項所述的組合物，其中如果具有通過"有效濃度測定 法"測得的至少約100% (體積比）的有效濃度，則所述無細胞發(fā)酵產(chǎn)物能有效抵抗一種或 多種污染微生物。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項所述的組合物，其中如果具有不止一種、優(yōu)選地所 有三種下列活性，則所述無細胞發(fā)酵產(chǎn)物能有效抵抗微生物：如果按照所述"平板擴散測定 法"方案觀察到至少2_的抑菌區(qū)；在所述"抑制肉湯測定法"中的至少約20%抑制；通過 所述"有效濃度測定法"測得的至少約100% (體積比）的有效濃度。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項所述的組合物，其中所述發(fā)酵產(chǎn)物為發(fā)酵物。
16. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的組合物，其中所述組合物還包含一種或多種附 加抗污染劑。
17. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的組合物，其能有效抵抗革蘭氏陰性細菌、革蘭氏 陽性細菌和真菌中的一種或多種。
18. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的組合物，其能有效抵抗選自如下的多種微生物： 革蘭氏陰性細菌、革蘭氏陽性細菌和真菌。
19. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的組合物，其能有效抵抗來自選自如下的屬的 一種或多種革蘭氏陰性細菌：埃希氏菌屬（Escherichia);哈夫尼菌屬（Hafnia);克雷伯 氏菌屬（Klebsiella);假單胞菌屬（Pseudomonas);沙門氏菌屬（Salmonella);志賀菌屬 (Shigella)和耶爾森菌屬（Yersinia)。
20. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的組合物，其能有效抵抗如下的一種或多種： 腸道沙門氏菌（Salmonella enterica);大腸桿菌（Escherichia coli);蜂房哈夫尼菌 (Hafnia alvei);產(chǎn)酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca);焚光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens);惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida);鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium);福氏志賀菌（Shigella flexneri);宋內(nèi)志賀菌（Shigella sonnei)和小腸 結(jié)腸炎耶爾森菌（Yersinia enterocolitica)。
21. 根據(jù)權(quán)利要求1至19中任一項所述的組合物，其能有效抵抗沙門氏菌屬 (Salmonella)〇
22. 根據(jù)權(quán)利要求19至21中任一項所述的組合物，其中所述沙門氏菌屬 (Salmonella)是腸道沙門氏菌（Salmonella enterica)。
23. 根據(jù)權(quán)利要求20或權(quán)利要求22中任一項所述的組合物，其中所述腸道沙門氏菌 (Salmonella enterica)菌種為如下的一種或多種：腸道沙門氏菌鴨血清型（Salmonella enterica ser.Anatum)、腸道沙門氏菌布靈得盧桕血清型（Salmonella enterica ser. Braenderup)、腸道沙門氏菌德爾卑血清型（Salmonella enterica ser. Derby)、腸道沙門 氏菌腸炎血清型（Salmonella enterica ser. Enteritidis)、腸道沙門氏菌哈達爾血清 型（Salmonella enterica ser. Hadar)、腸道沙門氏菌嬰兒血清型（Salmonella enterica ser. Infantis)、腸道沙門氏菌凱道古血清型（Salmonella enterica ser. Kedougou)、腸 道沙門氏菌姆班達卡血清型（Salmonella enterica ser. Mbandaka)、腸道沙門氏菌蒙得 維的亞血清型（Salmonella enterica ser. Montevideo)、腸道沙門氏菌諾伊斯特爾血清 型（Salmonella enterica ser. Neumuenster)、腸道沙門氏菌新港血清型（Salmonella enterica ser. Newport)、腸道沙門氏菌俄亥俄血清型（Salmonella enterica ser. Ohio)、 腸道沙門氏菌史華氏血清型（Salmonella enterica ser. Schwarzengrund)、腸道沙門氏 菌桑夫頓堡血清型（Salmonella enterica ser. Senftenberg)、腸道沙門氏菌田納西血清 型（Salmonella enterica ser. Tennessee)、腸道沙門氏菌湯普森氏血清型（Salmonella enterica ser. Thompson)以及腸道沙門氏菌鼠傷寒血清型（Salmonella enterica ser. Typhimurium)〇
24. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的組合物，其能有效抵抗來自選自如下的屬 的一種或多種革蘭氏陽性細菌：李斯特菌屬（Listeria);芽孢桿菌屬（Bacillus);環(huán) 絲菌屬（Brochothrix);梭菌屬（Clostridium);腸球菌屬（Enterococcus);乳桿菌屬 (Lactobacillus);明串珠菌屬（Leuconostoc)以及葡萄球菌（Staphylococcus)。
25. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的組合物，其能有效抵抗如下的一種或多 種：單核細胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes);凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans)抱子；地衣芽抱桿菌（Bacillus licheniformis);地衣芽抱桿菌（Bacillus licheniformis)孢子；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)孢子；熱殺索絲菌 (Brochothrix thermosphacta);產(chǎn)氣莢膜梭狀芽抱桿菌（Clostridium perfringens)； 生抱梭菌（Clostridium sporogenes)抱子；奠腸球菌（Enterococcus faecalis) ;_雞 腸球菌（Enterococcus gall inarum);香腸乳桿菌（Lactobacillus farciminis);發(fā)酵 乳桿菌（Lactobacillus fermentum);植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum);清酒乳 桿菌（Lactobacillus sakei);腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides);無害李斯 特菌（Listeria innocua);金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)和表皮葡萄球菌 (Staphylococcus epidermidis)〇
26. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的組合物，其能有效抵抗來自選自如下的 屬的一種或多種真菌：曲霉屬（Aspergillus);假絲酵母屬（Candida);德巴利酵母 屬（Debaryomyces);克魯維酵母屬（Kluyveromyces);青霉屬（Penicillium);畢赤酵 母屬（Pichia);紅酵母屬（Rhodotorula);酵母屬（Saccharomyces)以及接合酵母屬 (Zygosaccharomyces)〇
27. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的組合物，其能有效抵抗如下的一種或多種：寄 生曲霉（Aspergillus parasiticus);雜色曲霉（Aspergillus versicolor);近平滑假絲 酵母（Candida parapsilosis);熱帶假絲酵母（Candida tropicalis);弗氏朽1樣酸桿菌 (Citrobacter freundii);漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii);馬克斯克魯維酵 母（Kluyveromyces marxianus);團青霉（Penicillium commune);異常畢赤酵母（Pichia anomala);粘紅酵母（Rhodotorula glutinis);膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa); 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)以及拜氏接合酵母（Zygosaccharomyces bailii)。
28. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的組合物，其中所述組合物為固體、半固體、液體 或凝膠形式，例如片劑、丸劑、膠囊劑、粉末、液體、懸浮液、分散劑或乳液。
29. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的組合物，其中所述組合物被密封。
30. 根據(jù)權(quán)利要求29所述的組合物，其中所述組合物被氣密封。
31. -種制備抗污染組合物的方法，包括： a) 將包含選自如下的至少一種枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)菌株的一種或多 種細菌：22C-P1、15A-P4、3A-P4、LSSA01、ABP278、BS 2084 和 BS18 培養(yǎng)在任何一種或多種 底物之上或之中，以產(chǎn)生包含至少一種化合物的發(fā)酵物，所述至少一種化合物選自脂肽、聚 酮化合物、嗜鐵素、桿菌溶素、抗莢膜菌素、plantazolicin、LCI、plantazolicin的同源物和 LCI的同源物； b) 使活細胞分離和/或失活。
32. 根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述脂肽選自：表面活性素、芽孢菌霉素（如， 芽孢菌霉素 D)、豐原素及其組合。
33. 根據(jù)權(quán)利要求31或權(quán)利要求32所述的方法，其中所述聚酮化合物選自：地非西 丁、大環(huán)內(nèi)酰亞胺、bacillaene及其組合。
34. 根據(jù)權(quán)利要求31至33中任一項所述的方法，其中將細菌孢子與所述發(fā)酵物分離和 /或使細菌孢子失活。
35. 根據(jù)權(quán)利要求31或權(quán)利要求34所述的方法，其中步驟a)中的所述培養(yǎng)處于5至 9的pH范圍的pH。
36. 根據(jù)權(quán)利要求31至35中任一項所述的方法，其中所述方法包括： c)將所述pH調(diào)節(jié)至pH 6-10范圍內(nèi)的pH ; 其中步驟c在步驟b)之前、期間或之后進行。
37. 根據(jù)權(quán)利要求31至36中任一項所述的方法，其中所述方法包括一個或多個（另 外的）分離和/或離析步驟以產(chǎn)生包含選自如下的至少一種化合物的所述發(fā)酵物的上清液 或其級分或組分：脂肽、聚酮化合物、嗜鐵素、桿菌溶素、抗莢膜菌素、plantazolicin、LCI、 plantazolicin的同源物和LCI的同源物，其中一個或多個（另外的）分離和/或離析步 驟在步驟b)之前或之后進行；或者在c)存在時，在步驟b)和c)之前、期間、之間或之后進 行。
38. 根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中所述脂肽選自：表面活性素、芽孢菌霉素（如， 芽孢菌霉素 D)、豐原素及其組合。
39. 根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中所述聚酮化合物選自：地非西丁、大環(huán)內(nèi)酰亞 胺、bacillaene及其組合。
40. 根據(jù)權(quán)利要求37至39中任一項所述的方法，其中所述步驟d)包括分離所述化合 物中的一種或多種。
41. 根據(jù)權(quán)利要求37至40中任一項所述的方法，其中所述分離是多種所述化合物的分 離。
42. 根據(jù)權(quán)利要求31至41中任一項所述的方法，其中步驟a)中的所述培養(yǎng)處于約10 至約55°C的溫度范圍內(nèi)的溫度下。
43. 根據(jù)權(quán)利要求31至42中任一項所述的方法，其中步驟a)中的所述底物包含下列 的任何一種：碳水化合物和/或蛋白胨和/或磷酸鹽和/或鹽和/或緩沖鹽。
44. 根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中所述底物包含或為下列的任何一種：CAS0肉湯 或 TSB。
45. 根據(jù)權(quán)利要求31至44中任一項所述的方法，其中步驟a)中的所述培養(yǎng)采用選 自如下的多種枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)菌株：22C-P1、15A-P4、3A-P4、LSSA01、 ABP278、BS2084 和 BS18。
46. 根據(jù)權(quán)利要求31至45中任一項所述的方法，其中步驟a)中的所述培養(yǎng)包括一種 或多種附加細菌。
47. 根據(jù)權(quán)利要求31至46中任一項所述的方法，其中步驟a)中的所述培養(yǎng)進行約1 至約48小時。
48. 根據(jù)權(quán)利要求31至47中任一項所述的方法，其中進行步驟a)中的所述培養(yǎng)直到 所述抗污染組合物產(chǎn)生在通過所述"平板擴散測定法"測量時觀察到至少約2_的抑菌區(qū) /圈。
49. 根據(jù)權(quán)利要求31至48中任一項所述的方法，其中進行步驟a)中的所述培養(yǎng)直到 所述抗污染組合物在所述"抑制肉湯測定法"中具有至少約20%抑制。
50. 根據(jù)權(quán)利要求31至49中任一項所述的方法，其中進行步驟a)中的所述培養(yǎng)直到 所述抗污染組合物在通過所述"有效濃度測定法"測量時具有至少約100% (體積比）的有 效濃度。
51. 根據(jù)權(quán)利要求31至50中任一項所述的方法，其中進行步驟a)中的所述培養(yǎng)直到 觀察到下列中的不止一種（優(yōu)選地，所有三種）：所述抗污染組合物產(chǎn)生在通過所述"平板 擴散測定法"測量時觀察到至少約2mm的抑菌區(qū)/圈；所述抗污染組合物在所述"抑制肉湯 測定法"中具有至少約20%抑制；或所述抗污染組合物在通過所述"有效濃度測定法"測量 時具有至少約100% (體積比）的有效濃度。
52. 根據(jù)權(quán)利要求31至51中任一項所述的方法，其中所述方法包括氧氣清除劑的添 加。
53. 根據(jù)權(quán)利要求31至51中任一項所述的方法，其中所述方法包括抗氧化劑的添加。
54. 根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中所述抗氧化劑為由如下組成的組中的一種或多 種：抗壞血酸、多酚、維生素 Ε、β -胡蘿卜素、迷迭香提取物、甘露醇和BHA。
55. 根據(jù)權(quán)利要求31至52中任一項所述的方法，其中所述方法包括在容器中密封（優(yōu) 選地氣密封）所述發(fā)酵物或上清液、其級分或組分的附加步驟。
56. 根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，其中所述附加的密封步驟為氣密封。
57. 根據(jù)權(quán)利要求55或權(quán)利要求56所述的方法，其中所述容器包含清除氧氣的化合 物。
58. -種根據(jù)權(quán)利要求31至57中任一項所述的方法制備的抗污染組合物。
59. -種防止和/或減少產(chǎn)品的微生物污染的方法，包括使所述產(chǎn)品的組成組分、所述 產(chǎn)品本身和/或所述產(chǎn)品的包裝與根據(jù)權(quán)利要求1至26中任一項所述的或根據(jù)權(quán)利要求 31至57中任一項所述所制備的抗污染組合物接觸的步驟。
60. 根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，其中所述產(chǎn)品為下列的任何一種：食品（例如肉制 品、寵物食物或動物飼料）、表面涂層材料（例如涂料）、和農(nóng)產(chǎn)品（例如作物、種子或青貯 飼料）。
61. 根據(jù)權(quán)利要求60所述的方法，其中所述食品為人類食品。
62. 根據(jù)權(quán)利要求60所述的方法，其中所述食品為寵物食物。
63. 根據(jù)權(quán)利要求59至62中任一項所述的方法，其中所述接觸步驟包括將所述產(chǎn)品的 組成組分與所述抗污染組合物混合。
64. 根據(jù)權(quán)利要求59至63中任一項所述的方法，其中所述接觸步驟包括將所述抗污染 組合物施加至所述產(chǎn)品的表面、其組成組分和/或所述產(chǎn)品的包裝。
65. 根據(jù)權(quán)利要求59至64中任一項所述的方法，其中所述方法防止和/或減少革蘭氏 陽性細菌、革蘭氏陰性細菌或真菌中的一種或多種所致的微生物污染。
66. 根據(jù)權(quán)利要求59至65中任一項所述的方法，其中所述方法防止和/或減少至少一 種革蘭氏陽性細菌、至少一種革蘭氏陰性細菌和至少一種真菌所致的微生物污染。
67. 根據(jù)權(quán)利要求59至66中任一項所述的方法，其中所述方法防止和/或減少來自選 自如下的屬的一種或多種革蘭氏陰性細菌所致的微生物污染：埃希氏菌屬（Escherichia); 哈夫尼菌屬（Hafnia);克雷伯氏菌屬（Klebsiella);假單胞菌屬（Pseudomonas);沙門氏 菌屬（Salmonella);志賀菌屬（Shigella)和耶爾森菌屬（Yersinia)。
68. 根據(jù)權(quán)利要求59至67中任一項所述的方法，其中所述方法防止和/或減 少如下的一種或多種所致的微生物污染：腸道沙門氏菌（Salmonella enterica); 大腸桿菌（Escherichia coli);蜂房哈夫尼菌（Hafnia alvei);產(chǎn)酸克雷伯氏菌 (Klebsiella oxytoca);突光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens);惡臭假單胞 菌（Pseudomonas putida);鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium);福氏志賀菌 (Shigella flexneri);宋內(nèi)志賀菌（Shigella sonnei)和小腸結(jié)腸炎耶爾森菌（Yersinia enterocolitica)〇
69. 根據(jù)權(quán)利要求59至68中任一項所述的方法，其中所述方法防止和/或減少沙門氏 菌屬（Salmonella)所致的微生物污染。
70. 根據(jù)權(quán)利要求67所述的方法，其中所述沙門氏菌屬（Salmonella)是腸道沙門氏菌 (Salmonella enterica)〇
71. 根據(jù)權(quán)利要求70所述的方法，其中所述腸道沙門氏菌菌種（Salmonella enterica spp)為下列的一種或多種：腸道沙門氏菌鴨血清型（Salmonella enterica ser. Anatum)、 腸道沙門氏菌布靈得盧柏血清型（Salmonella enterica ser.Braenderup)、腸道沙門氏菌 德爾卑血清型（Salmonella enterica ser. Derby)、腸道沙門氏菌腸炎血清型（Salmonella enterica ser. Enteritidis)、腸道沙門氏菌哈達爾血清型（Salmonella enterica ser. Hadar)、腸道沙門氏菌嬰兒血清型（Salmonella enterica ser. Infantis)、腸道沙門氏 菌凱道古血清型（Salmonella enterica ser. Kedougou)、腸道沙門氏菌姆班達卡血清型 (Salmonella enterica ser.Mbandaka)、腸道沙門氏菌蒙得維的亞血清型（Salmonella enterica ser.Montevideo)、腸道沙門氏菌諾伊斯特爾血清型（Salmonella enterica ser.Neumuenster)、腸道沙門氏菌新港血清型（Salmonella enterica ser.Newport)、 腸道沙門氏菌俄亥俄血清型（Salmonella enterica ser.Ohio)、腸道沙門氏菌史華氏 血清型（Salmonella enterica ser.Schwarzengrund)、腸道沙門氏菌桑夫頓堡血清型 (Salmonella enterica ser.Senftenberg)、腸道沙門氏菌田納西血清型（Salmonella enterica ser. Tennessee)、腸道沙門氏菌湯普森氏血清型（Salmonella enterica ser. Thompson)以及腸道沙門氏菌鼠傷寒血清型（Salmonella enterica ser. Typhimurium)。
72. -種包含根據(jù)權(quán)利要求1至30中任一項所述的抗污染組合物或包含根據(jù)權(quán)利要 求31至57中任一項所述的抗污染組合物的產(chǎn)品，或一種因進行根據(jù)權(quán)利要求59至66所 述的方法而具有減少和/或防止的微生物污染的產(chǎn)品。
73. 根據(jù)權(quán)利要求72所述的產(chǎn)品，其中所述產(chǎn)品為人類食品。
74. 根據(jù)權(quán)利要求72所述的產(chǎn)品，其中所述產(chǎn)品為寵物食物。
75. 根據(jù)權(quán)利要求1至30中任一項所述的或根據(jù)權(quán)利要求31至57中任一項制備的組 合物，其中所述組合物被配制為作物保護劑。
76. 根據(jù)權(quán)利要求1至30中任一項所述的或根據(jù)權(quán)利要求31至57中任一項制備的組 合物，其中所述組合物被配制為人類食品。
77. 根據(jù)權(quán)利要求1至30中任一項所述的或根據(jù)權(quán)利要求31至57中任一項制備的組 合物，其中所述組合物被配制為寵物食物。
78. 根據(jù)權(quán)利要求1至30和58中任一項所述的組合物防止產(chǎn)品的微生物污染的用途。
79. 根據(jù)權(quán)利要求78所述的用途，其中所述產(chǎn)品為下列的任何一種：食品（例如肉制 品、寵物食物或動物飼料）、表面涂層材料（例如涂料）、和農(nóng)產(chǎn)品（例如作物、種子或青貯 飼料）。
80. 根據(jù)權(quán)利要求79所述的用途，其中所述食品為人類食物。
81. 根據(jù)權(quán)利要求79所述的用途，其中所述食品為寵物食物。
82. 根據(jù)權(quán)利要求78至81中任一項所述的用途，其中所述用途防止和/或減少革蘭氏 陽性細菌、革蘭氏陰性細菌或真菌中的一種或多種所致的微生物污染。
83. 根據(jù)權(quán)利要求78至82中任一項所述的用途，其中所述用途防止和/或減少至少一 種革蘭氏陽性細菌、至少一種革蘭氏陰性細菌和至少一種真菌所致的微生物污染。
84. 根據(jù)權(quán)利要求78至83中任一項所述的用途，其中所述用途防止和/或減少來自選 自如下的屬的一種或多種革蘭氏陰性細菌所致的微生物污染：埃希氏菌屬（Escherichia); 哈夫尼菌屬（Hafnia);克雷伯氏菌屬（Klebsiella);假單胞菌屬（Pseudomonas);沙門氏 菌屬（Salmonella);志賀菌屬（Shigella)和耶爾森菌屬（Yersinia)。
85. 根據(jù)權(quán)利要求78至84中任一項所述的用途，其中所述方法防止和/或減 少如下的一種或多種所致的微生物污染：腸道沙門氏菌（Salmonella enterica); 大腸桿菌（Escherichia coli);蜂房哈夫尼菌（Hafnia alvei);產(chǎn)酸克雷伯氏菌 (Klebsiella oxytoca);焚光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens);惡臭假單胞 菌（Pseudomonas putida);鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium);福氏志賀菌 (Shigella flexneri);宋內(nèi)志賀菌（Shigella sonnei)和小腸結(jié)腸炎耶爾森菌（Yersinia enterocolitica)〇
86. 根據(jù)權(quán)利要求78至85中任一項所述的用途，其中所述用途防止和/或減少沙門氏 菌屬（Salmonella)所致的微生物污染。
87. 根據(jù)權(quán)利要求78至86中任一項所述的用途，其中所述沙門氏菌屬（Salmonella) 是腸道沙門氏菌（Salmonella enterica)。
88. 根據(jù)權(quán)利要求87所述的用途，其中所述腸道沙門氏菌菌種（Salmonella enterica spp)為下列的一種或多種：腸道沙門氏菌鴨血清型（Salmonella enterica ser.Anatum)、 腸道沙門氏菌布靈得盧桕血清型（Salmonella enterica ser.Braenderup)、腸道沙門氏菌 德爾卑血清型（Salmonella enterica ser. Derby)、腸道沙門氏菌腸炎血清型（Salmonella enterica ser.Enteritidis)、腸道沙門氏菌哈達爾血清型（Salmonella enterica ser. Hadar)、腸道沙門氏菌嬰兒血清型（Salmonella enterica ser. Infantis)、腸道沙門氏 菌凱道古血清型（Salmonella enterica ser. Kedougou)、腸道沙門氏菌姆班達卡血清型 (Salmonella enterica ser. Mbandaka)、腸道沙門氏菌蒙得維的亞血清型（Salmonella enterica ser. Montevideo)、腸道沙門氏菌諾伊斯特爾血清型（Salmonella enterica ser. Neumuenster)、腸道沙門氏菌新港血清型（Salmonella enterica ser. Newport)、 腸道沙門氏菌俄亥俄血清型（Salmonella enterica ser. Ohio)、腸道沙門氏菌史華氏 血清型（Salmonella enterica ser. Schwarzengrund)、腸道沙門氏菌桑夫頓堡血清型 (Salmonella enterica ser. Senftenberg)、腸道沙門氏菌田納西血清型（Salmonella enterica ser. Tennessee)、腸道沙門氏菌湯普森氏血清型（Salmonella enterica ser. Thompson)以及腸道沙門氏菌鼠傷寒血清型（Salmonella enterica ser. Typhimurium)。
89. -種制備人類食品或?qū)櫸锸澄锏姆椒?，包括將根?jù)權(quán)利要求1至26中任一項所述 的或根據(jù)權(quán)利要求31至57中任一項制備的抗污染組合物施加于人類食品或?qū)櫸锸澄?；?者人類食品或?qū)櫸锸澄锏囊环N或多種組成組分。
90. -種用于篩選有效抵抗一種或多種目標(biāo)污染微生物的抗污染組合物的方法，包 括： a) 將包含選自如下的至少一種枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)菌株的一種或多 種細菌：22C-P1、15A-P4、3A-P4、LSSA01、ABP278、BS2084 和 BS18 培養(yǎng)在任何一種或多種底 物之上或之中，以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物； b) 使活細胞分離和/或失活，并且任選地，使孢子分離和/或失活； c) 測試所述無細胞發(fā)酵產(chǎn)物抗目標(biāo)污染微生物的抗微生物活性；和 d) 選擇具有抗目標(biāo)污染微生物的抗微生物活性的發(fā)酵產(chǎn)物； 其中步驟b)可在步驟c)和d)之前、期間和/或之后進行。
91. 根據(jù)權(quán)利要求90所述的方法，還包括一個或多個（另外的）分離和/或離析步驟。
92. 根據(jù)權(quán)利要求90或權(quán)利要求91所述的方法，其中如果按照所述"平板擴散測定法" 方案觀察到至少2mm的抑菌區(qū)，則所述抗污染組合物或所述發(fā)酵產(chǎn)物能有效抵抗一種或多 種目標(biāo)污染微生物。
93. 根據(jù)權(quán)利要求90至92中任一項所述的方法，其中如果在所述"抑制肉湯測定法" 中具有至少約20%抑制，則所述抗污染組合物或所述發(fā)酵產(chǎn)物能有效抵抗一種或多種目標(biāo) 污染微生物。
94. 根據(jù)權(quán)利要求90至93中任一項所述的方法，其中如果具有通過所述"有效濃度測 定法"測得的至少約100% (體積比）的有效濃度，則所述抗污染組合物或所述發(fā)酵產(chǎn)物能 有效抵抗一種或多種目標(biāo)污染微生物。
95. 根據(jù)權(quán)利要求90至94中任一項所述的方法，其中如果具有不止一種、優(yōu)選地所有 三種下列活性，則抗污染組合物或所述發(fā)酵產(chǎn)物能有效抵抗一種或多種目標(biāo)污染微生物： 如果按照所述"平板擴散測定法"方案觀察到至少2mm的抑菌區(qū)；在所述"抑制肉湯測定法" 中的至少約20%抑制；通過所述"有效濃度測定法"測得的至少約100% (體積比）的有效 濃度。
96. -種如本文參照說明書和附圖基本上公開的組合物。
97. -種如本文參照說明書和附圖基本上公開的方法。
98. -種如本文參照說明書和附圖基本上公開的產(chǎn)品。
99. 一種如本文參照說明書和附圖基本上公開的用途。
【文檔編號】C12P1/04GK104245943SQ201380010373
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2013年2月20日 優(yōu)先權(quán)日:2012年2月21日
【發(fā)明者】H. 維伯 G., 麥金德 T., 本菲爾德 C., A. 海博德 A., J. 蘭德姆 R., 查諾斯 P., R. 斯拉古薩 G., J. 亨特 M. 申請人:杜邦營養(yǎng)生物科學(xué)有限公司