一種流感病毒分離檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本實用新型公開了一種流感病毒分離檢測試劑盒，包括試劑盒本體，試劑盒本體內(nèi)放置小瓶離心法試劑瓶、平衡鹽溶液洗液瓶、病毒維持液溶液瓶和小瓶離心法流感病毒陽性樣品瓶。小瓶離心法試劑瓶為含200μL細胞休眠液的狗腎細胞的小瓶離心法試劑瓶。平衡鹽溶液洗液瓶為含質(zhì)量體積比為0.0625%的胰蛋白酶的平衡鹽溶液洗液瓶。病毒維持液溶液瓶為含甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮處理的胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素、兩性霉素-B的MEM病毒維持液溶液瓶。本實用新型的試劑盒與現(xiàn)有技術低溫保存相比較，細胞復蘇率高，操作簡單；保存無需程序降溫儀和液氮；運輸安全方便。
【專利說明】一種流感病毒分離檢測試劑盒
【技術領域】
[0001]本實用新型涉及低溫生物學、病毒檢測領域，具體涉及一種可低溫保存及長途運輸?shù)男∑侩x心法流感病毒分離檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002]病毒檢測方法包括病毒分離、病毒抗原、核酸和抗體檢測。病毒分離為實驗室檢測的“金標準”;病毒的抗原和核酸檢測可以用于早期診斷；抗體檢測可以用于回顧性分析。近年來研發(fā)機構(gòu)集中精力在免疫學和分子診斷技術方面開展了卓有成效的工作，無疑這些都是有益的。但是，作為“金標準”的病毒分離培養(yǎng)卻由于要求投入比較高、技術較為復雜、見效比較慢而沒有受到同等的重視。利用細胞進行病毒分離培養(yǎng)是唯一能夠獲得活病毒的方法，這對相關病毒的后續(xù)研究如病毒的遺傳與變異的研究、致病機理的探索、藥物敏感性的檢測、相應疫苗的研制等等都是不可缺少的前提條件。同時也應該是上述免疫學和分子診斷技術方法賴以比較的基礎。但是細胞培養(yǎng)是一個耗時的過程，其步驟需要完成復蘇、傳代、接種、孵育、分離。該技術無法滿足病毒樣品快速分離檢測的需求，從而影響病毒分離檢測的效率。適合臨床實驗室的敏感和穩(wěn)定的細胞產(chǎn)品供應是保證醫(yī)療機構(gòu)臨床實驗室開展常規(guī)化病毒檢測的關鍵，但是目前市面上十分缺乏一種有效期長、可用于產(chǎn)業(yè)化的預制備細胞產(chǎn)品(低溫保存的單層貼壁細胞產(chǎn)品)，所以研發(fā)一種單層貼壁培養(yǎng)細胞預制備低溫保存方法是十分必要。
[0003]單層貼壁細胞預制備技術又叫單層貼壁細胞低溫休眠技術，其目的是利用低溫低代謝或零代謝技術，讓單層貼壁細胞處于靜止狀態(tài)，需要使用時能立即復蘇，無需接種和傳代，可運用于臨床病毒檢測分離、抗病毒藥物篩選、微量中和試驗等等。
[0004]要做到單層貼壁細胞低溫休眠，目前現(xiàn)有的方法主要有超低溫細胞休眠及非冷凍液態(tài)低溫休眠。
[0005]超低溫細胞休眠是指利用低溫冷凍技術將細胞保存在_80°C或_80°C以下，其方法主要包括程控降溫法和玻璃化法。
[0006]程控降溫法:利用程序降溫儀程序控制降溫使細胞處于超低溫冷凍休眠狀態(tài)。其原理是從室溫以-1°C /min降至-10°c，之后在以_10°C /min速度降至_80°C。程控降溫采用慢速冷凍，讓細胞有充足時間脫去水分，避免胞內(nèi)冰晶形成，從而保護細胞。程控降溫還需使用冷凍保護劑共同保護細胞，主要包括乙二醇(EG)、丙二醇(PG)、甘油(G)、二甲基亞砜(DMSO)等，作用原理是利用保護劑的超強滲透性，使細胞內(nèi)外滲透壓保持平衡，當胞外冰晶形成后，胞外溶液隨著冰晶的形成，溶劑相對減少，而溶質(zhì)濃度相對增大，胞內(nèi)溶劑隨滲透壓流出胞外，細胞進一步脫水，保護細胞免受冰晶刺破等物理損傷。
[0007]玻璃化休眠:通過高濃度非滲透性溶質(zhì)(蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮PVP等)及高濃度滲透性保護液，讓細胞迅速脫水，之后直接投入液氮中，使之快速冷凍，在I分鐘(-2500°c /min)之內(nèi)，達到冷凍保存液的玻璃轉(zhuǎn)化溫度(Tg)，最后整個溶液體系形成透明的玻璃態(tài)，無冰晶存在，繼而保護了細胞。[0008]非冷凍液態(tài)低溫休眠:一般臨床學術認為在冰點之上，將哺乳動物細胞的溫度控制在細胞冰晶形成溫度之上至細胞休眠的溫度之下范圍內(nèi)(學術屆認為_5°C以上，27°C以下)。不同的動物、不同的器官、不同的細胞類型，其最佳休眠溫度也不同，所以筆者認為只要掌握冰晶形成溫度之上選擇一個適合的休眠溫度，就可以讓多種類的細胞休眠起來。如腫瘤細胞及神經(jīng)細胞難以忍受10°C以下的低溫，而在20°C卻不容易出現(xiàn)細胞損傷。絕大多數(shù)細胞(上皮細胞、成纖維細胞等)能長時間承受15°C的低溫壓力，所以選擇一個大眾低溫休眠溫度，能有效的抑制多種細胞增值，使之處于休眠狀態(tài)。
[0009]程控降溫法缺陷:當在慢速降溫時，細胞雖能脫水避免胞內(nèi)冰晶損傷，對懸浮細胞來說能起到很好的保護作用，但對單層貼壁細胞，其細胞間質(zhì)(貼壁細胞及組織細胞的間隙仍然存在著組織液)一樣會形成冰晶，刺破細胞膜，所以使用程序降溫法對單層貼壁細胞來說，存在著諸多的不確定性，還有程控降溫儀成本昂貴，冷凍量不多(一次冷凍兩三塊96孔板)，且相當耗時。所以對單層貼壁細胞預制備的推廣得不到有效的幫助，研發(fā)意義不大。
[0010]玻璃化休眠缺陷，主要有四點:
[0011]1、當單層貼壁細胞在高濃度溶質(zhì)的冷凍保護液中，因極度脫水而收縮，這使單層貼壁細胞非常容易脫落。
[0012]2、玻璃化冷凍保護液的毒性也很高，通常玻璃化冷凍使用20%的DMSO保護液，DMSO本身有毒，能破壞細胞骨架。
[0013]3、玻璃化冷凍還存在反玻璃化現(xiàn)象，如當溫度高于玻璃化轉(zhuǎn)化溫度Tg時候，會出現(xiàn)大量的冰晶，導致細胞損傷。也意味著玻璃化法必須長期保存在液氮中。產(chǎn)品運輸無法得到安全保證。
[0014]4、玻璃化冷凍操作危險，我們制備單層貼壁細胞通常使用多孔培養(yǎng)板和玻璃小瓶。溫差巨大的情況下，這些器皿容易爆裂，可能傷害到實驗操作者。
[0015]非冷凍液態(tài)低溫休眠缺陷:保存期受到限制(無保護液情況下，最長2周)。主要原因細胞在非冷凍液態(tài)低溫休眠過程中，仍然有少量的代謝，其代謝產(chǎn)物主要有氧自由基等過氧化物，這些物質(zhì)長期存在細胞內(nèi)能使細胞膜、線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜等發(fā)生脂質(zhì)過氧化，同時這些過氧化物還能破壞DNA、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)等。其次，細胞長期處于低溫液體體系中，Na+-K+-ATP酶活性受到影響，Ca2+離子內(nèi)流等，這些都會引起高濃度溶質(zhì)損傷。此外，低溫效應也延遲粘附分子L-選擇素(L-selectin)、β 2-整合素(β 2-1ntegrin)等的表達。
實用新型內(nèi)容
[0016]針對上述現(xiàn)有技術的缺點，本發(fā)明的目的在于利用細胞休眠保護液及非冷凍間斷性低溫休眠保護方法共同結(jié)合，有效抑制非冷凍低溫損傷，提供一種可低溫保存且長途運輸?shù)男∑侩x心法流感病毒分離檢測試劑盒，使小瓶離心法技術產(chǎn)品化，并在有效期內(nèi)能立即運用于臨床病毒分離檢測，無需傳代，無需接種細胞，有效提高臨床病毒分離檢測速率。
[0017]本實用新型的一種流感病毒分離檢測試劑盒，包括試劑盒本體，在所述試劑盒本體內(nèi)放置小瓶離心法試劑瓶、平衡鹽溶液洗液瓶、病毒維持液溶液瓶和小瓶離心法流感病毒陽性樣品瓶。
[0018]所述小瓶離心法試劑瓶為含200 μ L細胞休眠保護液的單層貼壁狀態(tài)的狗腎細胞的小瓶離心法試劑瓶。[0019]所述小瓶離心法試劑瓶有40個。
[0020]所述平衡鹽溶液Hanks洗液瓶為含質(zhì)量體積比為0.0625%的胰蛋白酶的平衡鹽溶液洗液瓶。
[0021]所述病毒維持液溶液瓶為含5 μ g/ml的TPCK處理的胰蛋白酶、100U/ml青霉素、100 μ g/ml鏈霉素、10 μ g/ml兩性霉素-B的MEM病毒維持液溶液瓶。
[0022]所述小瓶離心法流感病毒陽性樣品瓶為經(jīng)多聚甲醛滅活處理的小瓶離心法流感病毒陽性樣品瓶。
[0023]本實用新型的試劑盒的使用方法如下:
[0024]含0.0625%胰蛋白酶洗液為A液，含5 μ g/ml的TPCK處理的胰蛋白酶、100U/ml青霉素、100 μ g/ml鏈霉素、10 μ g/ml兩性霉素B的MEM病毒維持液為B液。
[0025]1、將低溫保存的MDCK細胞小瓶離心法小瓶置37°C培養(yǎng)箱復溫30分鐘，除去細胞低溫休眠液，加A液靜置I分鐘。
[0026]2、B液與標本(床鼻、咽拭子)震蕩混合。去A液加含標本B液，之后，用離心機3000轉(zhuǎn)60分鐘離心小瓶離心法小瓶后(實驗條件限制可不離心)，至37°C恒溫培養(yǎng)箱。
[0027]使用離心技術，24小時內(nèi)可觀察細胞病變。并結(jié)合免疫熒光技術檢測病毒。
[0028]本實用新型的最大優(yōu)勢是可分離活的流感病毒。這是PCR和免疫熒光無法代替的。
[0029]本實用新型的小瓶離心法試劑瓶中的細胞休眠液配方是根據(jù)非冷凍低溫損傷機制的基礎上研制出來的，配方中分別含有80 μ M/L維生素Ε、3.7 μ M/L番茄紅素兩種抗氧化齊U，能有效抑制細胞膜脂質(zhì)過氧化，保護細胞膜不破損。以及含有30mM/L海藻糖，海藻糖能保護細胞膜上及膜內(nèi)蛋白與核酸的結(jié)構(gòu)，維持蛋白和核酸功能。配方中還含有1.5%明膠和
0.5%海藻酸，組成溫敏凝膠(低于15°C凝固，反之融化)，能使細胞在運輸途中得以固定，保證細胞及小瓶離心法小瓶內(nèi)的細胞載玻片不脫落。
[0030]非冷凍間斷性低溫休眠技術:黃鼠冬眠習性觀察得出，原理是讓小瓶離心法MDCK細胞處于4°C?10°C低溫保存7-10天，37°C復溫30分鐘再繼續(xù)處于4°C?10°C低溫保存7-10天再37°C復溫，組成的一個非冷凍間斷性低溫休眠模式，此法用于shell vial流感病毒分離試劑盒，能有效抑制MDCK細胞的細胞膜脂質(zhì)過氧化。有效延遲單層貼壁細胞的保存時間。保存有效期為I個月。
[0031]本實用新型的試劑盒與現(xiàn)有單層貼壁細胞低溫保存相比較，具有操作簡單，無需程序降溫儀，無需液氮，運輸方便。
[0032]操作方面，與現(xiàn)有程序降溫和玻璃化比較，這兩種現(xiàn)有低溫保存方法需要嚴格遵從低溫冷凍步驟，及快速復溫程序，而本實用新型復溫和冷凍速度沒有限制，適合廣大技術員操作。
[0033]運輸方面，與現(xiàn)有程序降溫和玻璃化比較，無需液氮與干冰，不會出現(xiàn)反玻璃化現(xiàn)象。本發(fā)明使用低溫水凝膠技術，能有效固定細胞在運輸過程不受振動而脫落。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1本實用新型流感病毒分離檢測試劑盒組成的一個優(yōu)選實施例?！揪唧w實施方式】
[0035]為使本實用新型更加容易理解，下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本實用新型。應理解，這些實施例僅用于說明本實用新型而不用于限制本實用新型的范圍，下列實施例中未提及的具體實驗方法，通常按照常規(guī)實驗方法進行。
[0036]實施例1:本實用新型的一個優(yōu)選實施例的流感病毒分離檢測試劑盒組成
[0037]該優(yōu)選實施例的試劑盒組成見圖1，由圖1可見，本優(yōu)選實施例的試劑盒含試劑盒本體1，在所述試劑盒本體I內(nèi)放置小瓶離心法試劑瓶2、平衡鹽溶液Hanks洗液瓶3、病毒維持液溶液瓶4和小瓶離心法陽性樣品瓶5。所述小瓶離心法試劑瓶2為含200 μ L細胞休眠液的狗腎細胞MDCK細胞的小瓶離心法試劑瓶。所述小瓶離心法試劑瓶2有40個。所述平衡鹽溶液HBSS洗液瓶3為含質(zhì)量體積比為0.0625%的胰蛋白酶的平衡鹽溶液HBSS洗液瓶。所述病毒維持液溶液瓶4為含5 μ g/ml的TPCK處理的胰蛋白酶、100U/ml青霉素、100 μ g/ml鏈霉素、10 μ g/ml兩性霉素-B的MEM病毒維持液溶液瓶。所述小瓶離心法流感病毒陽性樣品瓶5為經(jīng)多聚甲醛滅活處理的小瓶離心法流感病毒陽性樣品瓶。
[0038]實施例2:實施例1的試劑盒的使用方法
[0039]含0.0625%胰蛋白酶平衡鹽洗液為A液,含5 μ g/ml的甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮(TPCK)處理的胰蛋白酶及常用青霉素、鏈霉素、兩性霉素B的MEM病毒維持液為B液。
[0040]該試劑盒的使用方法如下:
[0041]1、將低溫保存的MDCK細胞小瓶離心法小瓶置37°C培養(yǎng)箱復溫30分鐘，除去細胞低溫休眠液，加A液靜置I分鐘后,再用A液洗一遍。
[0042]2、B液與 標 本(床鼻、咽拭子)震蕩混合。去A液加含標本B液，之后，離心機3000轉(zhuǎn)60分鐘離心小瓶離心法小瓶后(實驗條件限制可不離心)，至37°C恒溫培養(yǎng)箱。
[0043]使用離心技術，24小時內(nèi)可觀察細胞病變。并結(jié)合免疫熒光技術檢測病毒。
[0044]實施例3:使用實施例1的試劑盒的多種流感病毒檢測效果
[0045]接種滴度為1.0TCID5(i/0.1ml多種常見流感病毒，48小時觀察細胞病變(CPE)，比較低溫保存一個月的本實用新型與程控降溫法、玻璃化法的檢測效果，見表一。
[0046]表一
[0047]
【權利要求】
1.一種流感病毒分離檢測試劑盒，包括試劑盒本體，其特征在于，在所述試劑盒本體內(nèi)放置小瓶離心法試劑瓶、平衡鹽溶液洗液瓶、病毒維持液溶液瓶和小瓶離心法流感病毒陽性樣品瓶。
2.根據(jù)權利要求1所述的流感病毒分離檢測試劑盒，其特征在于，所述小瓶離心法試劑瓶為含200 μ L細胞休眠液的狗腎細胞的小瓶離心法試劑瓶。
3.根據(jù)權利要求2所述的流感病毒分離檢測試劑盒，其特征在于，所述小瓶離心法試劑瓶有40個。
4.根據(jù)權利要求1所述的流感病毒分離檢測試劑盒，其特征在于，所述小瓶離心法流感病毒陽性樣品瓶為經(jīng)多聚甲醛滅活處理流感病毒的小瓶離心法陽性樣品瓶。
【文檔編號】C12R1/93GK203474805SQ201320012548
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年1月10日 優(yōu)先權日:2013年1月10日
【發(fā)明者】楊子峰, 江海明, 伍時冠, 周榮 申請人:廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院, 廣州呼吸疾病研究所, 廣州呼研所醫(yī)藥科技有限公司