轉(zhuǎn)化羧酸酯的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及利用一種細(xì)胞轉(zhuǎn)化分子式為(I)的羧酸酯的方法，及其合適的細(xì)胞及其應(yīng)用，R1-A-COOR2(I)，其中R1選自包括下列的組：氫、-CH2OH、-CHO、-COOR3、-CH2SH、-CH2OR3和-CH2NH2，其中R2選自包括烷基的組，優(yōu)選選自甲基、乙基和丙基，其中R3選自包括氫和烷基的組，優(yōu)選選自甲基、乙基和丙基，并且其中A是具有至少4個、優(yōu)選具有6個、更優(yōu)選具有8個碳原子的取代、非取代、直鏈、支鏈和／或環(huán)狀的亞烷基基團(tuán)、亞烯基基團(tuán)、亞芳基基團(tuán)或者亞芳烷基基團(tuán)，其包括以下步驟：a)使細(xì)胞在水溶液中與羧酸酯接觸，其中所述細(xì)胞是重組細(xì)胞，其中含有SEQ?ID?NO2或者其變體的多肽的活性與該細(xì)胞的野生型相比有所減小。
【專利說明】轉(zhuǎn)化羧酸酯的方法
[0001]本發(fā)明涉及利用細(xì)胞轉(zhuǎn)化分子式為(I)的羧酸酯的方法，，及其合適的細(xì)胞，及其應(yīng)用。
[0002]R1-A-COOR2 (I)，
[0003]其中R1 選自包括下列的組:氫、-CH20H、-CH0, -COOR3, -CH2SH, -CH2OR3 和-CH2NH2,
[0004]其中R2選自包括下列的組:氫和烷基，優(yōu)選選自甲基、乙基和丙基，
[0005]其中R3選自包括下列的組:氫和烷基，優(yōu)選選自甲基、乙基和丙基，
[0006]并且其中A是一種具有至少4個、優(yōu)選具有6個、更優(yōu)選具有8個碳原子的取代、非取代、直鏈、支鏈和/或環(huán)狀的亞烷基基團(tuán)、亞烯基基團(tuán)、亞芳基基團(tuán)或者亞芳烷基基團(tuán)，
[0007]包括以下步驟
[0008]a)使細(xì)胞在水溶液中與羧酸酯接觸，
[0009]其中所述細(xì)胞是重組細(xì)胞，其含有SEQ ID N02或者其變體的多肽的活性與該細(xì)胞的野生型相比有所減小。
[0010]生物技術(shù)致力 于使用具有所需合成能力的各種生物來生產(chǎn)尤其是精細(xì)化工產(chǎn)品。與傳統(tǒng)化學(xué)方法相比，生物技術(shù)方法具有一系列優(yōu)點(diǎn)。首先它們通常完全不必使用有害健康的物質(zhì)(例如基于重金屬的催化劑)以及具有極端pH值、壓力和溫度值的反應(yīng)條件。此外還能以更少的投資和安全措施來建造生物技術(shù)方法所需的基礎(chǔ)設(shè)施。生物【技術(shù)領(lǐng)域】所用相關(guān)酶的選擇性和特異性通常大大超過化學(xué)催化劑，從而可以減少形成并非所需并且通常難以與產(chǎn)物分離的副產(chǎn)物，這些副產(chǎn)物在有機(jī)合成方法進(jìn)行合成時必然會產(chǎn)生。最后，生物【技術(shù)領(lǐng)域】用作起始原料的相關(guān)生物在許多情況下接受例如可以從再生原料獲取的復(fù)雜碳?xì)浠衔?。因此，生產(chǎn)企業(yè)可以減小其對化石原料(例如石油和天然氣)的依賴性。
[0011]但是生物技術(shù)方法的創(chuàng)立仍然面臨重重困難，導(dǎo)致當(dāng)今只能使用生物技術(shù)以工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)極少的物質(zhì)。主要問題在于:具有某種所需合成活性的細(xì)胞并非僅僅具有負(fù)責(zé)該合成活性的這一種酶，而是有上千種酶共存于同一個細(xì)胞之中，并且相互爭奪底物，或者甚至催化完全相反的反應(yīng)。因此單純在大腸桿菌的基因組中就已對利用生物信息方法鑒定為水解酶的大約80種多肽進(jìn)行了編碼，即，酶可以裂解特定鍵同時耗用水分子。細(xì)胞生產(chǎn)酶所處的條件，和所述酶催化的反應(yīng)，以及參與所述反應(yīng)的底物，實(shí)際上僅在很少情況下能夠搞清楚。因此很多情況下無法有針對性地選擇用來催化特定反應(yīng)的酶。
[0012]因此，當(dāng)使用細(xì)胞作為生物催化劑替代化學(xué)催化劑或者分離出的生物催化劑，也始終存在另一種酶將具有某種所需活性的酶所制備的產(chǎn)物、中間產(chǎn)物或者原來的起始原料轉(zhuǎn)變成并非所需的副產(chǎn)物的危險(xiǎn)。盡管生物信息領(lǐng)域的技術(shù)日益進(jìn)步，仍然無法預(yù)見是否會發(fā)生這種情況，也無法預(yù)見眾多酶中的哪一種酶在這種情況下具有所述非所需的活性。
[0013]如果是工業(yè)上作為反應(yīng)性反應(yīng)物用來生產(chǎn)更復(fù)雜產(chǎn)物的化學(xué)反應(yīng)性物質(zhì)，則很有可能所述物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)部與生物的必不可少的成分發(fā)生反應(yīng)并且從而有毒性作用。如果是這種情況，生物的生長與合成能力就會遭到損害，并且最終細(xì)胞死亡，而開發(fā)人員無法立即識別所述毒性。同樣也無法預(yù)見哪一種生物能夠耐受化學(xué)反應(yīng)性物質(zhì)，以及后者的耐受濃度。[0014]在涉及每種情況下分別由一種酶催化的多個反應(yīng)的方法，系統(tǒng)的復(fù)雜性使得更難以找出限制收率或純度的因素。如果產(chǎn)物的收率太低，則對于此的原因可以是其中一種酶的濃度太低，盡管從可能的酶中并不知道該酶，這就是說，由于合成能力不夠充分，無法通過競爭的酶在規(guī)定的時間范圍內(nèi)或者在降解之前將反應(yīng)物轉(zhuǎn)化?；蛘?，非常有可能，某一種酶雖然可以檢測到以多肽形式存在于細(xì)胞中，但是恰恰在該細(xì)胞中不具有對于活性而言必不可少的折疊，或者缺少某種至今未知、但是對于活性而言必不可少的輔因子。同樣，如前所述，細(xì)胞的代謝產(chǎn)物同樣可能對細(xì)胞是有毒的，或者可以降解。
[0015]想要創(chuàng)立或者改善一種生物技術(shù)方法的專業(yè)人士面對如此多的著眼點(diǎn)，但是多數(shù)情況下無法從現(xiàn)有技術(shù)獲得必需從哪里下手才能實(shí)現(xiàn)目標(biāo)的具體可行指示。
[0016]羧酸酯是一類工業(yè)需求量很大的化合物，要么本身直接應(yīng)用，或者通過加工成產(chǎn)品用作藥物、化妝品、塑料等。
[0017]但是通常在加工時不僅需要首先引入到前體之中的酯官能團(tuán)，而且必需通過酯繼續(xù)進(jìn)行衍生反應(yīng)，酯官能團(tuán)在方法中或者此后不水解。后者無法以尋常方式實(shí)現(xiàn)，因?yàn)橛绕湓谒芤褐胁⑶耶?dāng)PH值大大偏離中性點(diǎn)時，即使沒有催化此類反應(yīng)的酶存在，很多羧酸酯也有水解傾向。
[0018]一種使羧酸酯繼續(xù)進(jìn)行衍生反應(yīng)的重要的可能性是氧化其中所含的烷基鏈。這首先產(chǎn)生一種醇，可以要么將其作為醇使用，或者將其進(jìn)一步氧化成醛或者酮。要么可以使醛或者酮進(jìn)行還原胺化反應(yīng)，或者將其繼續(xù)氧化成羧酸，如有需要，隨后可以使羧酸重新進(jìn)行酯化反應(yīng)。
[0019]這些可能反應(yīng)是多種多樣，內(nèi)源酶(也就是生物內(nèi)部自然存在的酶)可催化其中的許多反應(yīng)，這表明在利 用生物技術(shù)方法轉(zhuǎn)化羧酸酯時的副產(chǎn)物形成或者代謝失控問題特
別嚴(yán)重。
[0020]一種通常以石油中所含烴類為基礎(chǔ)制成的工業(yè)需求很大的羧酸酯例如就是12-氨基月桂酸甲酯(ALSME)。ALSME是制備聚合物的一種重要初始材料，例如可用于生產(chǎn)基于尼龍的管道系統(tǒng)。直到現(xiàn)在還是以收率很低的工藝從化石原料制備ALSME。
[0021]W02009 / 077461描述了一種以生物技術(shù)制備ALS或ALSME的有希望的新途徑。這涉及月桂酸甲酯在第一個步驟中被一種單加氧酶氧化，然后通過轉(zhuǎn)氨酶將所產(chǎn)生的醛轉(zhuǎn)化成ALSME。該方法的缺點(diǎn)在于，會產(chǎn)生很難與所需產(chǎn)物ALSME分離的副產(chǎn)物，例如二羧酸。這會使得收率減小，并且使疏水性溶劑以及PCT / EP2011 / 071491所述可以用于從含水反應(yīng)混合物中分離出產(chǎn)物的疏水性液體陽離子交換劑的回收更加困難，資源利用效率很差。
[0022]在這種背景下，本發(fā)明的目標(biāo)在于提供一種從收率、碳平衡和/或氮平衡和/或純度方面來看效率盡可能高的轉(zhuǎn)化羧酸酯的生物技術(shù)方法，
[0023]本發(fā)明的另一目標(biāo)在于提供一種從收率、碳平衡和/或氮平衡、所用制劑的可復(fù)用性和/或產(chǎn)物的純度方面來看效率盡可能高的將羧酸酯轉(zhuǎn)化成胺化羧酸酯的生物技術(shù)方法。就此而言，所謂高效的碳平衡和/或氮平衡優(yōu)選指的是:用于羧酸酯轉(zhuǎn)化以對細(xì)胞的合適底物形式補(bǔ)料碳和/或氮在所需的最終產(chǎn)物中的含量盡可能高，而不是例如轉(zhuǎn)化成并非所需的其它產(chǎn)物。
[0024]本發(fā)明的另一目標(biāo)在于，改善羧酸酯轉(zhuǎn)化過程中的多相反應(yīng)混合物的可復(fù)原的能力，尤其是關(guān)于可以重新用于復(fù)原所用的疏水性溶劑和液體陽離子交換劑的可再用性，以及關(guān)于兩相體系的相形成和相分離，所述兩相體系包括一個在其中進(jìn)行羧酸酯轉(zhuǎn)化的水相，以及一個包含有機(jī)溶劑和/或液體陽離子交換劑的有機(jī)相。
[0025]可通過本申請的主題并且尤其也可通過獨(dú)立權(quán)利要求的主題實(shí)現(xiàn)這些和進(jìn)一步的目標(biāo)，從屬權(quán)利要求所述均為相關(guān)實(shí)施方式。
[0026]在第一方面通過利用細(xì)胞轉(zhuǎn)化分子式為(I)的羧酸酯的方法來解決本發(fā)明涉及的問題
[0027]R1-A-COOR2 (I)，
[0028]其中R1 選自包括下列的組:氫、_CH20H、-CH0, -COOR3, -CH2SH, -CH2OR3 和-CH2NH2,
[0029] 其中R2選自包括下列的組:氫和烷基，優(yōu)選選自甲基、乙基和丙基，
[0030]其中R3選自包括下列的組:氫和烷基，優(yōu)選選自甲基、乙基和丙基，
[0031]并且其中A是一種具有至少4個、優(yōu)選具有6個、更優(yōu)選具有8個碳原子的取代、非取代、直鏈、支鏈和/或環(huán)狀的亞烷基基團(tuán)、亞烯基基團(tuán)、亞芳基基團(tuán)或者亞芳烷基基團(tuán)，
[0032]包括以下步驟
[0033]a)使細(xì)胞在水溶液中與羧酸酯接觸，
[0034]所述細(xì)胞涉及一種重組細(xì)胞，其中含有SEQ ID N02或者其變體的多肽的活性與該細(xì)胞的野生型相比有所減小。
[0035]在第一方面的第一個實(shí)施方式中，通過一種還包括以下步驟的方法來解決問題
[0036]b)使水溶液與包括一種陽離子交換劑的疏水性有機(jī)溶液接觸
[0037]在第二方面使用以下方式解決本發(fā)明涉及的問題:相對于細(xì)胞的相應(yīng)野生型將包含SEQ ID N02或者其變體的多肽的一種編碼基因敲除，作為重組細(xì)胞的基因組成部分，用以提高分子式為(I)的羧酸酯產(chǎn)量
[0038]R1-A-COOR2 (I)，
[0039]其中R1 選自包括下列的組:氫、_CH20H、-CH0, -COOR3, -CH2SH, -CH2OR3 和-CH2NH2,
[0040]其中R2選自包括下列的組:烷基，優(yōu)選選自甲基、乙基和丙基，
[0041]其中R3選自包括下列的組:氫和烷基，優(yōu)選選自甲基、乙基和丙基，
[0042]并且其中A是一種具有至少4個、優(yōu)選具有6個、更優(yōu)選具有8個碳原子的取代、非取代、直鏈、支鏈和/或環(huán)狀的亞烷基基團(tuán)、亞烯基基團(tuán)、亞芳基基團(tuán)或者亞芳烷基基團(tuán)，尤其是具有至少四個、優(yōu)選具有6個、更優(yōu)選具有8個碳原子的亞烷基基團(tuán)。
[0043]在第三方面通過以下方式解決本發(fā)明涉及的問題:使用重組細(xì)胞來轉(zhuǎn)化分子式為(I)的羧酸酯，所述重組細(xì)胞中包含SEQ ID N02或者其變體的多肽的活性與該細(xì)胞的野生型相比有所減小
[0044]R1-A-COOR2 (I)，
[0045]其中R1 選自包括下列的組:氫、_CH20H、-CH0, -COOR3, -CH2SH, -CH2OR3 和-CH2NH2,
[0046]其中R2選自包括下列的組:氫和烷基，優(yōu)選選自甲基、乙基和丙基，
[0047]其中R3選自包括下列的組:氫和烷基，優(yōu)選選自甲基、乙基和丙基，
[0048]并且其中A是具有至少4個、優(yōu)選具有6個、更優(yōu)選具有8個碳原子的取代、非取代、直鏈、支鏈和/或環(huán)狀的亞烷基基團(tuán)、亞烯基基團(tuán)、亞芳基基團(tuán)或者亞芳烷基基團(tuán)，優(yōu)選是具有至少八個碳原子的亞烷基基團(tuán)。[0049]在第一、第二或者第三方面的另一個實(shí)施方式中，通過方法或者用途來解決問題，其中A是一個飽和亞烷基基團(tuán)，優(yōu)選是分子式為-(CH2)n的亞烷基基團(tuán)，其中的η至少為4。
[0050]在第一方面的另一個實(shí)施方式中，通過方法解決問題，其中R1選自包括下列的組:氫、-CH20H、-CHO 和-CH2NH2O
[0051]在第四方面通過細(xì)胞解決本發(fā)明涉及的問題，所述細(xì)胞表達(dá)重組烷烴羥化酶，其中包含SEQ ID N02或者其變體的多肽的活性與該細(xì)胞的野生型相比有所減小。
[0052]在第四方面的優(yōu)選實(shí)施方式中，通過細(xì)胞解決問題，所述細(xì)胞中的烷烴羥化酶是選自包括下列的組:CYP153家族的AlkB單加氧酶和細(xì)胞色素P450單加氧酶。
[0053]在第五方面通過一種反應(yīng)混合物以及一種分子式為(I)的羧酸酯來解決本發(fā)明涉及的問題，所述反應(yīng)混合物包括水溶液中的根據(jù)第四方面或者其實(shí)施方式中任一種所述的細(xì)胞
[0054]R1-A-COOR2 (I)，
[0055]其中R1 選自包括下列的組:氫、_CH20H、-CH0, -COOR3, -CH2SH, -CH2OR3 和-CH2NH2,
[0056]其中R2選自包括下列的組:烷基，優(yōu)選選自甲基、乙基和丙基，
[0057]其中R3選自包括下列的組:氫和烷基，優(yōu)選選自甲基、乙基和丙基，
[0058]其中A是一種具有至少4個、優(yōu)選具有6個、更優(yōu)選具有8個碳原子的取代、非取代、直鏈、支鏈和/或環(huán)狀的亞烷基基團(tuán)、亞烯基基團(tuán)、亞芳基基團(tuán)或者亞芳烷基基團(tuán)。
[0059]在第五方面的另一個實(shí)施方式中，通過反應(yīng)混合物解決問題，
[0060]其中的A是具有至少四個碳原子的亞烷基基團(tuán)，尤其是飽和亞烷基基團(tuán)，優(yōu)選是分子式為-(CH2)n-的亞烷基基團(tuán)，其中的η至少為4，
[0061 ] 其中的R1優(yōu)選選自包括下列的組:氫、-CH2OH, -CHO和_CH2NH2。
[0062]在第五方面的一個實(shí)施方式中，通過一種反應(yīng)混合物解決問題，所述反應(yīng)混合物還包括含有陽離子交換劑的疏水性有機(jī)溶液。
[0063]在第一至第五方面的一個優(yōu)選實(shí)施方式中，通過一種方法、一種細(xì)胞或者一種用途來解決問題，其中所述細(xì)胞還表達(dá)一種轉(zhuǎn)氨酶。
[0064]在第一至第五方面的一個優(yōu)選實(shí)施方式中，通過一種方法、一種細(xì)胞或者一種用途來解決問題，其中所述細(xì)胞還表達(dá)一種丙氨酸脫氫酶。
[0065]在第一至第五方面的一個優(yōu)選實(shí)施方式中，通過一種方法、一種細(xì)胞或者一種用途來解決問題，其中所述細(xì)胞還具有AlkL家族中的一種蛋白。
[0066]在第一至第五方面的一個優(yōu)選實(shí)施方式中，通過一種方法、一種細(xì)胞或者一種用途來解決問題，其中所述細(xì)胞中催化脂肪酸β_氧化反應(yīng)之一的至少一種酶的活性與其野生型相比有所降低，其中所述的酶優(yōu)選是選自包括下列的組:脂肪酸CoA連接酶、?；鵆oA脫氫酶、2，4- 二烯酰基-CoA-還原酶、烯?；?CoA-水合酶和3-酮?；?CoA-硫解酶、脂肪酸內(nèi)運(yùn)子或者其變體的一種酶，尤其優(yōu)選是FadL或者其變體。
[0067]在第一至第五方面的一個優(yōu)選實(shí)施方式中，通過一種方法、一種細(xì)胞或者一種用途來解決問題，其中所述細(xì)胞具有和/或過表達(dá)選自包括下列的組:烷烴羥化酶、醇脫氫酶、轉(zhuǎn)氨酶、丙氨酸脫氫酶的至少一種重組酶以及選自AlkL家族的重組蛋白。
[0068]在第一至第五方面的一個優(yōu)選實(shí)施方式中，通過一種方法、一種細(xì)胞或者一種用途來解決問題，其中由于包含SEQ ID Ν02或者其變體的多肽的編碼基因敲除，使得包含SEQID N02或者其變體的多肽的活性與該細(xì)胞的野生型相比有所減小。
[0069]本發(fā)明基于發(fā)明人令人驚奇的發(fā)現(xiàn):尤其包括SEQ ID N02或者其變體的多肽的活性與該細(xì)胞的野生型相比有所減小的重組細(xì)胞，適合用來轉(zhuǎn)化羧酸酯，所產(chǎn)生的產(chǎn)物的收率、碳平衡和/或氮平衡以及純度均令人驚訝地高于包括SEQ ID N02的多肽的活性與野生型細(xì)胞相同的細(xì)胞。這涉及到例如使用至少一種烷烴羥化酶和任選其它的酶對羧酸酯進(jìn)行氧化的反應(yīng)。
[0070]本發(fā)明還基于發(fā)明人的另外令人驚奇的發(fā)現(xiàn):包括SEQ ID N02或者其變體的多肽的活性與該細(xì)胞的野生型相比有所減小的重組細(xì)胞適合于轉(zhuǎn)化羧酸酯，特別是能夠高效地和/或通常以為了從新使用的回收方式重新獲得用于復(fù)原羧酸酯轉(zhuǎn)化的反應(yīng)產(chǎn)物的有機(jī)溶劑和液體陽離子交換劑，并且改善含水反應(yīng)混合物從包含有機(jī)溶劑和/或液體陽離子交換劑的疏水性溶液中的去除。
[0071]本發(fā)明涉及利用細(xì)胞轉(zhuǎn)化羧酸酯的方法，所述轉(zhuǎn)化可以是任一種使用有用的羧酸酯作為反應(yīng)物的化學(xué)反應(yīng)，并且反應(yīng)過程中羧酸酯或從其衍生的化合物的水解或者預(yù)先水解可以影響待從其產(chǎn)生的產(chǎn)物的收率、碳平衡和/或氮平衡和/或純度。本發(fā)明所述的細(xì)胞和本發(fā)明所述的方法特別適合于其中不同化學(xué)官能團(tuán)而非羧酸酯基團(tuán)(例如端烷基)被轉(zhuǎn)化，并且其中目的是保持羧酸酯基團(tuán)的轉(zhuǎn)化反應(yīng)。但根據(jù)本發(fā)明也可以根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行反應(yīng)例如羧酸酯基團(tuán)的酯交換反應(yīng)，其中目的是避免羧酸酯基團(tuán)預(yù)先和非特異性的反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)也適合于那些其中一種含有羧酸酯基團(tuán)的化合物本身并非是待轉(zhuǎn)化的反應(yīng)物、而是僅僅在較長時間內(nèi)需要其存在和穩(wěn)定性的反應(yīng)，例如如果所述化合物是具有本方法必需的活性的某個酶的激活子和誘導(dǎo)子。
[0072]為了進(jìn)行本發(fā)明，必不可少的是:根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞或者根據(jù)本發(fā)明的方法中使用的細(xì)胞是一種重組細(xì)胞，其中包括SEQ ID N02或者其變體的多肽的活性與該細(xì)胞的野生型相比有所減小。所述序列編碼BioH，已知這種酶能夠作為生物素的生物合成反應(yīng)的一部分與另一種酶BioC —起將丙氨酸和/或醋酸酯/鹽轉(zhuǎn)變?yōu)楦?CoA (Barker，D.F.，和Campbell1A.M.(1980) J.Bactehol.143，789-800)。在大腸桿菌中由包括 SEQ ID NOl 的核苷酸序列對BioH編碼。在一個優(yōu)選實(shí)施方式中，由于敲除(例如部分缺失)或者其它用來將包括SEQ ID NOl或者其變體的核苷酸序列表達(dá)減小的措施，使得包括SEQ ID N02的多肽的活性有所減小。
[0073]隨著現(xiàn)代遺傳、微生物和分子生物方法的發(fā)展，有很多工具可供專業(yè)人士用來常規(guī)測量和影響存在于活細(xì)胞中的多肽的活性。為了確定以懸浮液、團(tuán)塊形式存在或者可以以經(jīng)過處理的形式從細(xì)胞培養(yǎng)提取的酶的活性，可以使用標(biāo)準(zhǔn)酶測試法進(jìn)行分析，如同教科書(例如 Cornish-Bowden, 1995)中所述的一樣。X.Xie 等人(2007)MetabolieEngineering9 ;379_386已描述了一種對包括SEQ ID NOl的多肽的活性進(jìn)行測定的方法。
[0074]現(xiàn)有技術(shù)也描述了常規(guī)可用于降低細(xì)胞內(nèi)某一酶的活性的方法，例如通過暴露在放射性福射下使得細(xì)胞隨機(jī)突變，隨后濃縮或者篩選突變體，通過定點(diǎn)引入點(diǎn)突變，或通過中斷閱讀框、或者將整合到細(xì)胞染色體之中的活性酶編碼基因的閱讀框的一部分缺失，例如可參閱Maniatis等人(1989)或者Fuchs&Schlegl (2007)，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員可以按常規(guī)執(zhí)行這些方法。也可以基于RNA-干擾(TUSchl，2001)或者使用特異性抑制劑來降低活性。在一個優(yōu)選實(shí)施方式中，如本文所用的表達(dá)方式“所述細(xì)胞中一種多肽的活性與其野生型相比有所降低”表示改變后的細(xì)胞中多肽的活性與野生型細(xì)胞中同一個酶的活性相比有所降低。在一個優(yōu)選實(shí)施方式中，以5、10、20、40、50、75、90、95、99%或更多百分比漸次增加的順序相對降低活性。在一個特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，相對于背景檢測不出酶的活性。
[0075]具體優(yōu)選的是通過敲除方式使得包括SEQ ID N02或者其變體的多肽的活性減小。在一個優(yōu)選實(shí)施方式中，如本文所用的術(shù)語“敲除”指的是尤其對于相應(yīng)細(xì)胞的后代而言將包括SEQ ID N02或者其變體的多肽的活性永久并且不可逆減小的任一種措施，優(yōu)選通過中斷SEQ ID N02或者其變體的編碼序列的閱讀框；通過將SEQ ID N02編碼序列或者其變體的至少一部分缺失，使得編碼多肽的酶活性喪失，但是不中斷閱讀框；或通過突變表達(dá)所必需的核苷酸序列，例如突變啟動子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)等。制備特異性多肽活性減小了的細(xì)胞的措施均為可供本領(lǐng)域技術(shù)人員使用的常規(guī)方法，并且現(xiàn)有技術(shù)對此已有充分描述，例如可參閱 Kamionka 等人(2005)AppI Environ Microbiol.2005February ；71 (2):728-733,Geng 等人(2009), Journal of Biomedicine and Biotechnology Volume2009, ArticleID646380,do1:10.1155 / 2009 / 646380，和 Murphy (2009)Methods Mol Biol.2011 ；765:27-42。使用可商購獲得的試劑盒也適合,例如Sigma Aldrich的TargeTron?基因敲除系統(tǒng)。
[0076]本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)化分子式為(I)的羧酸酯
[0077]R1-A-COOR2 (I)，
[0078]其中R1 選自包括下列的組:氫、_CH20H、-CH0, -COOR3, -CH2SH, -CH2OR3 和-CH2NH2,
[0079]其中R2選自 包括烷基的組，烷基，優(yōu)選選自甲基、乙基和丙基，
[0080]其中R3選自包括下列的組:氫和烷基，優(yōu)選選自甲基、乙基和丙基，
[0081]并且其中A是具有至少4個、優(yōu)選具有6個、更優(yōu)選具有8個碳原子的取代、非取代、直鏈、支鏈和/或環(huán)狀的亞烷基基團(tuán)、亞烯基基團(tuán)、亞芳基基團(tuán)或者亞芳烷基基團(tuán)。所述亞烷基基團(tuán)A在其包含至少四個碳原子的情況下可以是任意一種亞烷基基團(tuán)，尤其是直鏈、支鏈或者環(huán)狀亞烷基基團(tuán)。在一個特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，A是分子式為-(CH2)n-的亞烷基鏈，其中的11可以是4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或者30。在一個最優(yōu)選的實(shí)施方式中，A表示分子式為-(CH2)n-的亞烷基基團(tuán)，其中的η為4~24，比較優(yōu)選為4~22且最優(yōu)選為4~IOiR1是氫、-CH2OH、-CHO、或者-C00H，最優(yōu)選是氫，R2是甲基或乙基。
[0082]對于根據(jù)本發(fā)明轉(zhuǎn)化羧酸酯的反應(yīng)物以及這里描述的所有其它化合物，通過結(jié)構(gòu)特征表示的、例如以化學(xué)式表示的化合物同樣可表示質(zhì)子化化合物、去質(zhì)子化合物或者其它的解離化合物。例如術(shù)語“醋酸酯/鹽”同樣也可理解為質(zhì)子化形式，也就是醋酸；也可理解為解離形式，也就是CH3-COO'
[0083]根據(jù)本發(fā)明要使用的細(xì)胞優(yōu)選是代謝活性細(xì)胞形式的全細(xì)胞催化劑，該細(xì)胞具有轉(zhuǎn)化羧酸酯所需的酶活性，特別優(yōu)選通過重組酶的表達(dá)。在另一個優(yōu)選實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是細(xì)胞的裂解物、萃取物或者另一種制備物，其具有至少一種酶活性。
[0084]關(guān)于生物的選擇，根據(jù)本發(fā)明的可以使用的細(xì)胞沒有任何限制，只要其可以培養(yǎng)、穩(wěn)定、并且有減弱酶活性的方法(例如敲除)可供使用即可。因此，其同樣可以是原核細(xì)胞或者真核細(xì)胞。在真核細(xì)胞的情況下，則特別優(yōu)先選用單細(xì)胞真核生物，尤其是啤酒酵母、熱帶假絲酵母、白色假絲酵母和巴斯德畢赤酵母之類的酵母。在原核
【權(quán)利要求】
1.通過細(xì)胞轉(zhuǎn)化分子式為(I)的羧酸酯的方法 R1-A-COOR2 (I)，
其中 R1 選自氫、-CH2OH, -CHO, -COOR3, -CH2SH, -CH2OR3 和-CH2NH2, 其中R2選自烷基，優(yōu)選選自甲基、乙基和丙基， 其中R3選自氣和烷基，優(yōu)選選自甲基、乙基和丙基， 并且其中A是一種具有至少4個、優(yōu)選具有6個、更優(yōu)選具有8個碳原子的取代、非取代、直鏈、支鏈和/或環(huán)狀的亞烷基基團(tuán)、亞烯基基團(tuán)、亞芳基基團(tuán)或者亞芳烷基基團(tuán)，包括以下步驟 a)使細(xì)胞在水溶液中與羧酸酯接觸， 其中所述細(xì)胞是重組細(xì)胞，其中含有SEQ ID N02或者其變體的多肽的活性與該細(xì)胞的野生型相比有所減小。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，還包括以下步驟 b)使水溶液與包括一種陽離子交換劑的疏水性有機(jī)溶液接觸。
3.與所述細(xì)胞的野生型相比，包含SEQID N02或者其變體的多肽的編碼基因的敲除作為重組細(xì)胞的基因組成部分用以提高分子式(I)的羧酸酯產(chǎn)量的用途，
R1-A-COOR2 (I)，
其中 R1 選自包括下列的組:氫、_CH20H、-CH0, -COOR3, -CH2SH, -CH2OR3 和-CH2NH2, 其中R2選自包括烷基的組，優(yōu)選選自甲基、乙基和丙基， 其中R3選自包括氫和烷基的組，優(yōu)選選自甲基、乙基和丙基， 并且其中A是具有至少4個、優(yōu)選具有6個、更優(yōu)選具有8個碳原子的取代、非取代、直鏈、支鏈和/或環(huán)狀的亞烷基基團(tuán)、亞烯基基團(tuán)、亞芳基基團(tuán)或者亞芳烷基基團(tuán)。
4.重組細(xì)胞用于轉(zhuǎn)化分子式(I)的羧酸酯的用途，所述重組細(xì)胞中包含SEQID N02或者其變體的多肽的活性與該細(xì)胞的野生型相比有所減小
R1-A-COOR2 (I)， 其中 R1 選自包括下列的組:氫、_CH20H、-CH0, -COOR3, -CH2SH, -CH2OR3 和-CH2NH2, 其中R2選自包括氫和烷基的組，優(yōu)選選自甲基、乙基和丙基， 其中R3選自包括氫和烷基的組，優(yōu)選選自甲基、乙基和丙基， 并且其中A是具有至少4個、優(yōu)選具有6個、更優(yōu)選具有8個碳原子的取代、非取代、直鏈、支鏈和/或環(huán)狀的亞烷基基團(tuán)、亞烯基基團(tuán)、亞芳基基團(tuán)或者亞芳烷基基團(tuán)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1~4中任一項(xiàng)所述的方法或者用途，其中A是飽和亞烷基基團(tuán)，優(yōu)選是分子式為-(CH2)n-的亞烷基基團(tuán)，其中η至少為4。
6.根據(jù)權(quán)利要求1~2中任一項(xiàng)所述的方法，其中R1選自包括下列的組:氫、-CH20H、-CHO 和-CH2NH2O
7.根據(jù)權(quán)利要求1~6中任一項(xiàng)所述的方法，其中A是具有至少4個、優(yōu)選具有6個、更優(yōu)選具有8個碳原子的取代、非取代、直鏈、支鏈和/或環(huán)狀的亞烷基基團(tuán)、亞烯基基團(tuán)、亞芳基基團(tuán)或者亞芳烷基基團(tuán)。
8.表達(dá)重組烷烴羥化酶的細(xì)胞，其中包括SEQID N02或者其變體的多肽的活性與該細(xì)胞的野生型相比有所減小。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的細(xì)胞，所述烷烴羥化酶是選自包括AlkB單加氧酶和CYP153家族的細(xì)胞色素P450單加氧酶的組的烷烴羥化酶。
10.反應(yīng)混合物,其包括在水溶液中的權(quán)利要求8或9中任一項(xiàng)所述細(xì)胞以及分子式(1)的羧酸酯
R1-A-COOR2 (I)， 其中 R1 選自包括下列的組:氫、_CH20H、-CH0, -COOR3, -CH2SH, -CH2OR3 和-CH2NH2, 其中R2選自包括烷基的組，優(yōu)選選自甲基、乙基和丙基， 其中R3選自包括氫和烷基的組，優(yōu)選選自甲基、乙基和丙基， 并且其中A是具有至少4個、優(yōu)選具有6個、更優(yōu)選具有8個碳原子的取代、非取代、直鏈、支鏈和/或環(huán)狀的亞烷基基團(tuán)、亞烯基基團(tuán)、亞芳基基團(tuán)或者亞芳烷基基團(tuán)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的反應(yīng)混合物，還包括疏水性有機(jī)溶液與陽離子交換劑。
12.根據(jù)權(quán)利要求1~11中任一項(xiàng)所述的方法、細(xì)胞、反應(yīng)混合物或者用途，其中所述細(xì)胞還表達(dá)轉(zhuǎn)氨酶。
13.根據(jù)權(quán)利要求1~12中任一項(xiàng)所述的方法、細(xì)胞、反應(yīng)混合物或者用途，其中所述細(xì)胞還表達(dá)丙氨酸脫氫酶。
14.根據(jù)權(quán)利要求1~13中任一項(xiàng)所述的方法、細(xì)胞、反應(yīng)混合物或者用途，其中所述細(xì)胞還具有AlkL家族中的蛋白。
15.根據(jù)權(quán)利要求1~14中任一項(xiàng)所述的方法、細(xì)胞、反應(yīng)混合物或者用途，其中所述細(xì)胞具有的催化脂肪酸β-氧化反應(yīng)之一的至少一種酶的活性與其野生型相比有所降低，其中所述的酶優(yōu)選是選自包括下列的組的一種酶:脂肪酸CoA連接酶、酰基CoA脫氫酶、2，4- 二烯?；?CoA-還原酶、烯?；?CoA-水合酶和3-酮酰基-CoA-硫解酶、脂肪酸內(nèi)運(yùn)子或者其變體，尤其優(yōu)選是FadL或者其變體。
16.根據(jù)權(quán)利要求1~15中任一項(xiàng)所述的方法、細(xì)胞、反應(yīng)混合物或者用途，其中所述細(xì)胞具有和/或過表達(dá)以重組形式的選自包括烷烴羥化酶、醇脫氫酶、轉(zhuǎn)氨酶、丙氨酸脫氫酶以及AlkL家族的蛋白的組的至少一種酶。
17.根據(jù)權(quán)利要求1~16中任一項(xiàng)所述的方法、細(xì)胞、反應(yīng)混合物或者用途，其中由于包含SEQ ID Ν02或者其變體的多肽的編碼基因敲除，包含SEQ ID Ν02或者其變體的多肽的活性與該細(xì)胞的野生型相比有所減小。
【文檔編號】C12P7/64GK103898172SQ201310757512
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2013年11月12日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月12日
【發(fā)明者】S·沙費(fèi)爾, H·安德烈, M·維澤爾, H-G·亨內(nèi)曼, H·赫格 申請人:贏創(chuàng)工業(yè)集團(tuán)股份有限公司