一種hbv的ymdd熒光pcr檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種HBV的YMDD熒光PCR檢測試劑盒，包括兩種PCR反應(yīng)液和含磁珠的DNA提取溶液，其中一種PCR反應(yīng)液中含YIDD上游引物、YIDD下游引物和YIDD探針，另一種PCR反應(yīng)液中含YVDD上游引物、YVDD下游引物和YVDD探針。本發(fā)明提供的HBV?YMDD熒光PCR檢測試劑盒操作快速、方法簡便、檢測靈敏度高、檢測范圍寬。應(yīng)用該試劑盒，可以對臨床HBV血清等樣本中的HBV?YMDD?DNA進(jìn)行快速檢測，為診斷HBV?YMDD突變提供可靠的實驗依據(jù)。
【專利說明】—種HBV的YMDD熒光PCR檢測試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種HBV耐藥突變的檢測試劑盒，更具體涉及一種HBV的YMDD熒光PCR檢測試劑盒；其目的是診斷含HBV的樣本是否已經(jīng)產(chǎn)生YMDD突變，且進(jìn)一步的，還可定量檢測已產(chǎn)生YMDD突變的HBV病毒比例。
【背景技術(shù)】
[0002]乙型肝炎病毒(HBV )簡稱乙肝病毒，是一種DNA病毒，屬于嗜肝DNA病毒科(hepadnavividae)。據(jù)估計，目前全球共有4億慢性乙型肝炎病毒感染患者，我國是乙型肝炎的高發(fā)區(qū)，既往的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，我國HBV的感染率為57.63%，乙肝表面抗原(HBsAg)攜帶率為9.75%，我國主要存在的HBV基因型為B型和C型。盡管HBV疫苗的廣泛應(yīng)用和嬰幼兒計劃免疫項目的推廣對乙肝的預(yù)防起到了積極的作用，但HBV的治療仍然是公眾關(guān)注的棘手問題。
[0003]目前，治療慢性乙型肝炎(CHB)主要是以干擾素和核苷(酸)類似物(NA)等藥物進(jìn)行抗病毒治療，進(jìn)而改善肝臟組織學(xué)病變?，F(xiàn)在臨床應(yīng)用的主要有拉米夫定(LAM)等核苷類似物治療CHB，類似物治療的主要原理是其作用于HBV-DNA cccDNA的復(fù)制期，抑制前基因組RNA逆轉(zhuǎn)錄為HBV-DNA的負(fù)鏈以及正鏈的合成。由于不能直接作用于感染細(xì)胞的病毒cccDNA，所以需要長期用藥來控制病毒復(fù)制。但是，長期使用核苷(酸)類似物治療CHB可引起HBV聚合酶基因rt保守區(qū)發(fā)生點突變，并導(dǎo)致臨床耐藥。HBVYMDD突變的方式主要有兩種AIDD突變和YVDD突變，即酪氨酸一甲硫氨酸一天冬氨酸一天冬氨酸(YMDD)中的甲硫氨酸密碼子(M)突變?yōu)楫惲涟彼?I)和纈氨酸(V)。
`[0004]隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，越來越多的分子生物學(xué)方法應(yīng)用于檢測HBV耐藥突變，主要包括測序、基因芯片、探針雜交技術(shù)等。而隨著FQ-PCR技術(shù)的發(fā)展，其在HBV突變診斷領(lǐng)域的應(yīng)用已越來越廣泛，也越來越為人所重視，HBV YMDD突變的實驗診斷中，實時熒光PCR技術(shù)憑借著快速、敏感、特異等優(yōu)點顯示出了其臨床診斷的優(yōu)越性。
[0005]運用熒光PCR技術(shù)檢測HBV YMDD突變主要包括HBV核酸提取和核酸PCR擴(kuò)增兩方面。
[0006]目前國外臨床上主要采用DNA提取試劑盒來提取HBV核酸，提取效果較好，但是由于價格昂貴，難以在國內(nèi)應(yīng)用。
[0007]臨床上檢測HBV YMDD-DNA的方法目前主要是基于實時熒光定量PCR的技術(shù)及其改進(jìn)，實時熒光定量PCR技術(shù)是近年來發(fā)展迅速的一種核酸檢測技術(shù)，使用一種帶有熒光檢測裝置的PCR擴(kuò)增儀，熒光檢測裝置能夠按照一定的程序周期性地發(fā)出特定波長的激發(fā)光，收集檢測熒光信號，通過檢測熒光信號的動態(tài)變化實時反映PCR的每個循環(huán)的擴(kuò)增水平，試驗結(jié)束后可通過軟件自動分析獲得擴(kuò)增曲線，根據(jù)擴(kuò)增曲線與熒光閾值線的交點(即Ct值)以及擴(kuò)增曲線的形狀，可以判斷陰陽性結(jié)果；如果同一反應(yīng)中有已知濃度的定量參考品或標(biāo)準(zhǔn)品，則可以通過軟件自動分析獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，由此實現(xiàn)對未知樣本的定值(即定量檢測)。與傳統(tǒng)的PCR相對比，其在反應(yīng)體系中增加了一條兩端分別標(biāo)記熒光報告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的探針。探針結(jié)構(gòu)完整時，熒光報告基團(tuán)發(fā)出的熒光能量被淬滅基團(tuán)吸收，呈現(xiàn)淬滅效應(yīng)；如果擴(kuò)增過程中有靶序列的存在，隨著目標(biāo)片段的延伸，探針分子逐漸被Taq酶水解切斷，熒光報告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)相互解離，阻斷了二者間熒光能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)，熒光報告基團(tuán)發(fā)出的熒光信號被熒光檢測裝置收集。隨著擴(kuò)增的進(jìn)行，熒光信號隨著目的片段的擴(kuò)增而呈現(xiàn)線性增強(qiáng)。試驗結(jié)束后，可以通過熒光PCR儀自帶的軟件自動分析數(shù)據(jù)，可以獲得陰陽性結(jié)果和樣本濃度的定值結(jié)果，因此，該技術(shù)在靶多核苷酸樣品的檢測和定量分析中，已逐漸取代傳統(tǒng)的PCR方法，得到十分廣泛的應(yīng)用。
[0008]國內(nèi)已有多種基于實時熒光定量PCR技術(shù)檢測HBV YMDD DNA的試劑盒應(yīng)用于臨床檢測中。但這些試劑盒所提供的HBV DNA提取方法主要是煮沸法，其核酸提取過程較復(fù)雜，樣本處理耗時長，且在處理樣本時，樣本中的DNA存在損耗,尤其對于高濃度的樣本，裂解不充分、富集不完全，會造成DNA的大量丟失導(dǎo)致樣本定量偏低。且這些試劑盒的檢測靈敏度不高，約在500IU左右；還因沒有設(shè)置陽性內(nèi)對照(即內(nèi)標(biāo))，無法監(jiān)控假陰性；和一般沒有預(yù)防PCR產(chǎn)物污染的措施。另外，受限于其引物探針序列，本領(lǐng)域還需開發(fā)出一種檢測HBV YMDD DNA特異性好且綜合性能優(yōu)良的PCR檢測試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0009]本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有HBV YMDD核酸熒光PCR檢測試劑盒的缺陷，提供一種操作快速、方法簡便、檢測靈敏度高、檢測范圍寬的HBV YMDD熒光PCR檢測試劑盒。應(yīng)用該試劑盒，可以對臨床HBV血清等樣本中的HBV YMDD DNA進(jìn)行快速檢測，為診斷HBV YMDD突變提供可靠的實驗依據(jù)。
[0010]因此，本發(fā)明提供一種HBV的YMDD熒光PCR檢測試劑盒，包括兩種PCR反應(yīng)液和含磁珠的DNA提取溶液，其中一種PCR反應(yīng)液中含HDD上游引物、YIDD下游引物和HDD探針，另一種PCR反應(yīng)液中含YVDD上游引物、YVDD下游引物和YVDD探針，且所述引物和探針的序列為，
[0011]
【權(quán)利要求】
1.一種HBV的YMDD熒光PCR檢測試劑盒，包括兩種PCR反應(yīng)液和含磁珠的DNA提取溶液，其中一種PCR反應(yīng)液中含HDD上游引物、YIDD下游引物和HDD探針，另一種PCR反應(yīng)液中含YVDD上游引物、YVDD下游引物和YVDD探針，且所述引物和探針的序列為，

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包含內(nèi)標(biāo)，且所述兩種PCR反應(yīng)液中均包含內(nèi)標(biāo)上游引物、內(nèi)標(biāo)下游引物和內(nèi)標(biāo)探針，所述內(nèi)標(biāo)序列及其引物和探針的序列為，
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，試劑盒中包括如下組分， ①DNA提取溶液1:包含十二烷基硫酸鈉、曲拉通和異硫氰酸胍； ②DNA提取溶液I1:含4-羥乙基哌嗪乙磺酸、氯化鈉和100~400 u g/ml的磁珠； ③DNA提取溶液II1:含曲拉通和氯化鈉； ④DNA提取溶液IV:含礦物油； ⑤DNA洗脫液:含Tris-HCl和EDTA； ⑥內(nèi)標(biāo)； ⑦PCR反應(yīng)液:包括所述的兩種PCR反應(yīng)液； ⑧酶混合液； ⑨HBVYMDD陽性對照； ⑩HBVYMDD陰性對照。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括組分(11)，即用于定量檢測YMDD突變的HBV YMDD定量參考品。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述PCR反應(yīng)液中還均包括PCR反應(yīng)緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸和/或核糖核苷三磷酸。
6.一種如權(quán)利要求5所述的試劑盒用于檢測HBV的YMDD突變的方法，包括: 步驟1，裂解病毒:向多個離心管均加入組分①，再在不同的離心管中分別加入組分⑨、⑩、(11)和待測樣本，離心； 步驟2，磁珠吸附核酸:向上述每個離心管中均加入組分②+⑥的混合液，并離心和用磁珠分離器進(jìn)行固液分離，此時離心管壁上的固體含磁珠和DNA ； 步驟3，洗滌:去除液體留下固體后，向每個離心管加入組分③和組分④，再經(jīng)離心和用磁珠分離器進(jìn)行固液分離，此時離心管壁上的固體含磁珠和DNA ；步驟4，DNA洗脫:去除液體留下固體后，向每個離心管加入組分⑤，將管壁的固體沖洗至管中，且使得磁珠和DNA在組分⑤的作用下洗脫分開，并再離心和用磁珠分離器進(jìn)行固液分離，此時離心管壁上的固體為磁珠，DNA進(jìn)入液體中； 步驟5，待熒光PCR分析:將上述離心管中的液體均各自轉(zhuǎn)移至一個新的離心管中待用；取一定數(shù)量的PCR反應(yīng)管，其中每管均加入組分⑦+⑧，再分別向不同的反應(yīng)管中加入上述待用的⑨、⑩、(11)和待測樣本；其中也可以先向PCR反應(yīng)管中加入待用的⑨、⑩、(11)和待測樣本，再向PCR反應(yīng)管中均加入組分⑦+⑧；蓋好管蓋，用于熒光PCR分析。
7.一種HBV的YMDD熒光PCR檢測試劑盒，包括兩種PCR反應(yīng)液，其中一種PCR反應(yīng)液中含HDD上游引物、YIDD下游引物和HDD探針，另一種PCR反應(yīng)液中含YVDD上游引物、YVDD下游引物和YVDD探針，且所述引物和探針的序列為，
8.一種磁珠法核酸提取純化方法在HBV的YMDD檢測中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/70GK103710466SQ201310744594
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月30日
【發(fā)明者】戴立忠, 吳康, 鄧中平, 王軍 申請人:湖南圣湘生物科技有限公司