貝酵母耐硫雜交育種后代的鑒定方法
【專利摘要】貝酵母耐硫雜交育種后代的鑒定方法，屬于酵母育種新菌株的鑒定方法。本發(fā)明包括：貝酵母雜交；貝酵母菌株耐硫性測(cè)定；提取和純化貝酵母DNA：以FZF1為引物的PCR反應(yīng)體系及程序；PCR產(chǎn)物測(cè)序及鑒定等；此后進(jìn)一步對(duì)耐硫雜交后代ISSR分析。實(shí)施例從3個(gè)雜交組合獲得18個(gè)疑似雜交后代。PCR分析是18個(gè)疑似雜交后代中有5個(gè)菌株只含非耐硫親本的特征條帶，2個(gè)含耐硫親本的特征條帶，其余11個(gè)則含有雙親的特征帶。對(duì)8個(gè)耐硫雜交后代ISSR分析表明：有兩個(gè)單菌落的指紋圖譜完全一致為同一菌株。本發(fā)明以DNA序列及ISSR圖譜為依據(jù)加上耐硫表型篩選獲得6種耐硫貝酵母雜交后代菌株，顯著提高了雜交后代菌株鑒定的準(zhǔn)確率。
【專利說明】貝酵母耐硫雜交育種后代的鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于酵母菌育種及鑒定方法。
【背景技術(shù)】
[0002]酵母選育是高品質(zhì)果酒釀造的核心技術(shù)之一，對(duì)果酒的香味、品質(zhì)等具有決定性的影響。目前我國(guó)果酒釀造用的酵母基本都是進(jìn)口的，果酒質(zhì)量同質(zhì)化日趨嚴(yán)重，制約了我國(guó)新品質(zhì)果酒發(fā)展和竟?fàn)幜?，也威脅我國(guó)野生酵母菌資源。釀酒酵母iSaccharomycesscerevisiae)是各種類型的酒生產(chǎn)中所通常米用的酵母，但以釀酒酵母作為發(fā)酵菌種釀造的酒風(fēng)味平淡，而廣義釀酒酵母組{Saccharomycessensulato)已擴(kuò)展到其它酵母的選育，如貝酵母iSaccharomycGS bay anus) ^奇異酵母{Saccharomycesparadoxus )等酵母。
[0003]另一方面，硫是酵母代謝過程中的一個(gè)常見產(chǎn)物，具有抗菌和抗氧化兩重功能，作為果酒生產(chǎn)的原材料的果汁以硫作防腐劑，其原因是:硫通過鈍化磷酸-3-甘油醛脫氫酶和乙醇脫氫酶的作用，導(dǎo)致細(xì)菌和真菌的ATP損耗，抑制其生長(zhǎng)發(fā)育最終使其死亡而達(dá)到抗菌防腐的作用。但硫?qū)τ诮湍副旧硪彩且环N潛在的毒素，它會(huì)隨著發(fā)酵的進(jìn)程而不斷的積累，當(dāng)硫的濃度積累達(dá)到一定量時(shí)將影響酵母的生長(zhǎng)、存活及發(fā)酵能力，進(jìn)而限制乙醇濃度的提高，中斷發(fā)酵過程。換言之，高硫環(huán)境對(duì)釀酒過程中的酵母而言是一種常見逆境。
[0004]貝酵母是眾多有 發(fā)掘前景的酵母之一，除了可產(chǎn)生特殊風(fēng)味，還表現(xiàn)出了其它的優(yōu)良性狀，如對(duì)低溫的耐受性比釀酒酵母更強(qiáng)等(Naumov等,2002 ；Nguyen等,2011),已在目前果酒生產(chǎn)中占有一定的地位，并有良好的市場(chǎng)開發(fā)前景，對(duì)它的深入研究將使其在未來的果酒生產(chǎn)中扮演重要角色。然而，目前有關(guān)酵母耐硫機(jī)理的研究基本都集中于釀酒酵母，貝酵母與釀酒酵母在物種水平上相比，基因組間存在很大差異，而貝酵母的耐硫能力很差，硫耐受機(jī)理的較大差異是后期影響發(fā)酵的主要因素之一(Bashtannaya，1970)，如果能在果酒發(fā)酵后期在酒精濃度較高的脅迫下當(dāng)其它酵母失去發(fā)酵功能后繼續(xù)把果汁中的糖轉(zhuǎn)化為酒精，就意味著貝酵母必須能耐受高濃度的硫，但對(duì)耐硫機(jī)理的研究，國(guó)內(nèi)外均無報(bào)道。因此，開展貝酵母耐硫菌株選育和培育，提高其硫耐受性是果酒釀造所用酵母選育研究勢(shì)在必行的重要目標(biāo)。
[0005]酵母菌的繁殖方式分有性繁殖和無性繁殖兩種，以無性繁殖為主。很多酵母菌的二倍體細(xì)胞可以進(jìn)行多代的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)繁殖，因而，在酵母菌生活周期中，存在著單倍體細(xì)胞和二倍體細(xì)胞兩種類型，都可以獨(dú)立生活。二倍體酵母菌細(xì)胞個(gè)大，生活力強(qiáng)，故發(fā)酵工業(yè)常利用二倍體酵母菌進(jìn)行生產(chǎn)。傳統(tǒng)的鑒定方法是通過形態(tài)學(xué)、生理生化性狀等對(duì)釀酒酵母進(jìn)行鑒定，將實(shí)驗(yàn)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)系統(tǒng)進(jìn)行對(duì)比得出鑒定結(jié)論。而酵母屬菌種顯微形態(tài)主要以單細(xì)胞形式存在，顯微觀察結(jié)果表明各種內(nèi)菌株間的細(xì)胞性狀很接近，準(zhǔn)確率較低，幾乎觀察不到差異，無法準(zhǔn)確地將雜交后代與雜交親本區(qū)分開來。(劉小珍、張漢堯，“昆明葡萄酒相關(guān)酵母菌的分離與鑒定”，西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版，已接收)，2014)。
[0006]近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，由于分子標(biāo)記技術(shù)能在DNA水平上迅速、有效的鑒定體細(xì)胞雜種，并且能在苗期進(jìn)行，節(jié)省大量的時(shí)間和精力。因此，分子標(biāo)記技術(shù)被廣泛應(yīng)用于雜種的鑒定。目前，分子標(biāo)記的方法主要有RFLP、RAPD、ISSR和AFLP等(Zietkiewicz 等，1994 ;Liu 等，2009 ;Zhang 等，2009)。由于 ISSR 標(biāo)記使用比 RAPD 引物更長(zhǎng)的引物，克服了 RAPD標(biāo)記穩(wěn)定性和重復(fù)性差等缺點(diǎn)，操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，多態(tài)性高，而且不需知道被檢測(cè)物種任何基因組的信息(Zietkiewicz等，1994)，已用于黑木耳(汪思迪等，2009)等遺傳多樣性的檢測(cè)分析。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明旨在以耐硫貝酵母菌株為耐硫親本與其它貝酵母菌株進(jìn)行雜交培育貝酵母耐硫新菌株，并提供一種貝酵母耐硫雜交后代的鑒定方法，為此而提出一種快速有效地培育貝酵母耐硫新菌株及有效篩選雜交后代的鑒定方法。
[0008]本發(fā)明貝酵母耐硫雜交育種的后代鑒定方法，包括以下步驟:
Cl)貝酵母雜交:參照Codon等(1995)的方法進(jìn)行；
(2)貝酵母菌株耐硫性測(cè)定:
將不同菌株接種于新鮮的含15 mg/L亞硫酸鈉的YPD(pH 3.5，含琥珀酸鹽)上，能長(zhǎng)起來的為耐硫菌株，不能長(zhǎng)起來的為非耐硫菌株；
(3)提取和純化貝酵母DNA:
將菌種采用劃線法接種 到新的培養(yǎng)基上，獲得單菌落。接種單菌落酵母到IOmL酵母試管培養(yǎng)基中(YPD培養(yǎng)基)，28°C，培養(yǎng)18h ;取1.5mL酵母培養(yǎng)液，12000r/min離心Imin收集菌體，加入 600 μ L 山梨醇 buffer, 5 μ LlOU/ μ L 溶菌酶(Lyticase), 30°C處理 30min。4000r/min離心lOmin,沉淀中加入200 μ L緩沖液GA重懸，加入20 yL蛋白酶K混勻，加入4 μ L RNaseA (100mg/mL)，室溫放置5min。加入220 μ L緩沖液GB,顛倒混勻，70。。放置lOmin，加220 μ L無水乙醇充分顛倒混勻，所得溶液和沉淀都加入吸附柱中，12000r/min離心30s，向吸附管中加入500 μ L緩沖液⑶，12000r/min離心30s，向吸附柱中加入500 μ L漂洗液PW洗兩次，最后加入30 μ LddH2O洗脫柱子上的酵母基因組DNA。
[0009](4)組成PCR反應(yīng)體系配方:
2.5微升 IOXPCR buffer (包含 Mg2+)，
I微升的10 mM前導(dǎo)鏈引物 I微升的10 mM后導(dǎo)鏈引物 0.5 微升的 10 mM of each dNTP 0.2微升的5U/y L Taq DNA聚合酶 2微升模板DNA 17.8 微升 dH20
上述PCR反應(yīng)體系以為基因擴(kuò)增引物:L1: TAC GGG TTG ACC ACT CCA AT ；R1:CAC CGC GTT CAT ATC ATC AG。
[0010](5)PCR 反應(yīng)程序:① 95°C 5 分鐘；(D 95°C解鏈 30 鈔；(D 60°C退火 30 秒；(D 72°C延伸60秒?’⑤②-④35個(gè)循環(huán)逾72°C延伸7分鐘。
[0011](6)PCR產(chǎn)物用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果:經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，該瓊脂糖凝膠含0.5 μ g.ml/1的溴化乙錠，電壓為3~5 V/cm,照像記錄。[0012](7)PCR產(chǎn)物測(cè)序:獲得的序列用Vector NTI軟件轉(zhuǎn)化成FASTA格式，并用BLAST與NBCI數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)，鑒定結(jié)果:耐硫親本只產(chǎn)生一條大小為1020bp的條帶；而非耐硫親本為一條700bp的條帶。
[0013]所述的鑒定方法進(jìn)一步以為基因擴(kuò)增引物PCR分析篩選雜交后代，結(jié)果所篩選雜交后代特征突出，均表現(xiàn)為兩條帶。
[0014]所述的鑒定方法進(jìn)一步是用ISSR區(qū)分屬于不同菌株的耐硫雜交后代:
(1)組成PCR反應(yīng)體系配方:
2.5μ L 10XPCR buffer (包含 Mg2+)，
2μ L的10 mM引物，
0.5 μ L 的 10 mM dN
0.2 μ L 的 5U/ μ L Taq DNA 聚合酶，
2μ L 模板 DNA,
12.8μ L ddH20。
[0015]ISSR引物如下:
(2)
【權(quán)利要求】
1.貝酵母耐硫雜交育種后代的鑒定方法，包括以下步驟: (1)貝酵母雜交:參照Codon等(1995)的方法進(jìn)行； (2)貝酵母菌株耐硫性測(cè)定: 將不同菌株接種于新鮮的含15 mg/L亞硫酸鈉的YPD(pH 3.5，含琥珀酸鹽)上，能長(zhǎng)起來的為耐硫菌株，不能長(zhǎng)起來的為非耐硫菌株； (3)提取和純化貝酵母DNA: 將菌種采用劃線法接種到新的培養(yǎng)基上，獲得單菌落；接種單菌落酵母到IOmL酵母試管培養(yǎng)基中(YPD培養(yǎng)基)，28°C，培養(yǎng)18h ;取1.5mL酵母培養(yǎng)液，12000r/min離心Imin收集菌體，加入 600 μ L 山梨醇 buffer, 5 μ LlOU/ μ L 溶菌酶(Lyticase), 30 °C 處理 30min ；4000r/min離心lOmin，沉淀中加入200 μ L緩沖液GA重懸，加入20 μ L蛋白酶K混勻，加入4yL RNaseA(100mg/mL),室溫放置5min ;加入220 μ L緩沖液GB，顛倒混勻，70°C放置lOmin，加220 μ L無水乙醇充分顛倒混勻，所得溶液和沉淀都加入吸附柱中，12000r/min離心30s，向吸附管中加入500 μ L緩沖液⑶，12000r/min離心30s，向吸附柱中加入500 μ L漂洗液PW洗兩次，最后加入30 μ LddH2O洗脫柱子上的酵母基因組DNA ； (4)組成PCR反應(yīng)體系(單位:微升)配方: .2.5微升 IOXPCR buffer (包含 Mg2+)， 1微升的10 mM前導(dǎo)鏈引物 1微升的10 mM后導(dǎo)鏈引物 . 0.5 微升的 10 mM of each dNTP . 0.2微升的5U/uL Taq DNA聚合酶 2微升模板DNA .17.8 微升 dH20 上述PCR反應(yīng)體系以為基因擴(kuò)增引物:L1: TAC GGG TTG ACC ACT CCA AT ；R1:CAC CGC GTT CAT ATC ATC AG ； (5)PCR反應(yīng)程序:①95°C5分鐘；(D 95°C解鏈30鈔；(D 60°C退火30秒；(D 72°C延伸60秒逾②-④35個(gè)循環(huán)；? 72°C延伸7分鐘； (6)PCR產(chǎn)物用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果:經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，該瓊脂糖凝膠含0.5μ g.mL—1的溴化乙錠，電壓為3~5 V/cm,照像記錄；
(7)PCR產(chǎn)物測(cè)序:獲得的序列用Vector NTI軟件轉(zhuǎn)化成FASTA格式，并用BLAST與NBCI數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)，鑒定結(jié)果:耐硫親本只產(chǎn)生一條大小為1020bp的條帶；而非耐硫親本為一條700bp的條帶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定方法，其特征是進(jìn)一步以為基因擴(kuò)增引物PCR分析篩選雜交后代，結(jié)果所篩選雜交后代特征突出，均表現(xiàn)為兩條帶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的鑒定方法，其特征是進(jìn)一步用ISSR區(qū)分屬于不同菌株的耐硫雜交后代: (1)組成PCR反應(yīng)體系配方: .2.5μ L 10XPCR buffer (包含 Mg2+)， 2μ L的10 mM引物， . 0.5μ L 的 10 mM dNTP,.0.2 μ L 的 5U/ μ L Taq DNA 聚合酶，
2μ L 模板 DNA,
. 12.8μ L ddH20 ； ISSR引物如下:
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103740821SQ201310738413
【公開日】2014年4月23日 申請(qǐng)日期:2013年12月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月30日
【發(fā)明者】劉小珍, 張漢堯 申請(qǐng)人:西南林業(yè)大學(xué)