一種用于檢測豬流行性腹瀉病毒的方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的是提供一種豬流行性腹瀉病毒的RT-PCR引物及檢測方法，該方法通過設計豬流行性腹瀉病毒基因的特異引物，建立豬流行性腹瀉病毒的RT-PCR方法，為方便、快速、有效地檢測該病毒。本發(fā)明的引物特異性高，鑒定速度快，整個RT-PCR過程可以在2.5-3小時完成，不需要經過測序公司測序就能快速準確的鑒定PEDV，為臨床檢測節(jié)省大量時間。
【專利說明】一種用于檢測豬流行性腹瀉病毒的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種豬病毒的檢測方法，屬于生物【技術領域】，具體涉及豬流行性腹瀉病毒的PCR檢測引物及檢測方法。
【背景技術】
[0002]豬流行性腹瀉(PED)由豬流行性腹瀉病毒(PEDV)引起的以腹瀉、嘔吐和脫水為特征的豬腸道傳染病。該病多發(fā)生在冬春寒冷季節(jié)，哺乳仔豬、架子豬或育肥豬等各年齡段均可發(fā)病，但哺乳仔豬發(fā)病和死亡最為嚴重。20世紀80年代后該病在中國流行面逐漸擴大，并多與豬傳染性胃腸炎、輪狀病毒等其他腸道病原混合感染，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重經濟損失。
[0003]該病的流行特點、臨診癥狀和病理變化都與豬傳染性胃腸炎(TGE)非常相似，為了及時預防和治療該病毒導致的腹瀉，需要快速鑒別診斷豬流行性腹瀉病毒的特異方法，因此建立PEDV的RT-PCR檢測方法具有重要的意義。
【發(fā)明內容】
[0004]本發(fā)明的目的是提供一種豬流行性腹瀉病毒的RT-PCR引物及檢測方法，該方法通過設計豬流行性腹瀉病毒基因的特異引物，建立豬流行性腹瀉病毒的RT-PCR方法，為方便、快速、有效地檢測該病毒打下基礎。
[0005]1.一種用于檢測豬流行性腹瀉病毒的方法，包含RT-PCR的檢測PED病毒，其特征在于:所述RT-PCR引物:
[0006]PEDVF:AACGGTTCTATTCCCGTTGATG
[0007]PEDVR: TAAATGAAGCAC`TTTCTCACTATC
[0008]2.根據權利要求1所述的一種用于檢測豬流行性腹瀉病毒的方法，其特征在于:PED病毒RT-PCR的檢測方法首先提取待檢樣的RNA，通過反轉錄形成cDNA，然后以反轉錄的cDNA為模板，建立PEDV的RT-PCR檢測，RT-PCR的產物為663bp。
[0009]3.根據權利要求2所述的PEDV的RT-PCR檢測方法，其特征在于:所述的RT-PCR檢測方法具體包括以下步驟:
[0010](I)待檢樣RNA的提?。?br>
[0011](2)將提取的RNA通過反轉錄成cDNA，反應程序和反應體系如下:
[0012]取總RNA5.75ul、反向引物 RNAlulUOmmol / L dNTPs0.5ul、5XBuffer2ul、100U / ul反轉錄酶AMV0.5ul、RNA酶抑制劑0.25ul，總體積10ul，50°C反應lh，95°C滅活5min,即得 cDNA。
[0013](3)將獲得的反轉錄產物進行PCR擴增，反應體系和反應程序如下:
[0014]取RT產物lul，2XMixl2.5ul，正向引物和反向引物各Iul，高壓滅菌水9.5ul，總體積 25ul，置入 PCR 儀，反應條件:94°C 30second, 56°C 30second, 72°C 20second，35 個循環(huán)，即得擴增產物。
[0015](4) RT-PCR產物的檢測結果:根據瓊脂糖凝膠電泳檢測的DNA圖譜，若擴增出分子量為663bp的特異DNA條帶則標記為攜帶PED病毒，若未擴增出特異DNA條帶則表示未攜帶PED病毒。
[0016]與現有技術相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
[0017]本發(fā)明的引物特異性高，鑒定速度快，整個RT-PCR過程可以在2.5-3小時完成，不需要經過測序公司測序就能快速準確的鑒定PEDV，為臨床檢測節(jié)省大量時間。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]圖1PEDVPCR擴增電泳結果
[0019]圖2PEDV RT-PCR特異性電泳圖結果
[0020]圖3PEDVRT-PCR敏感性電泳圖結果
【具體實施方式】
[0021]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0022]實施例豬流行性腹瀉病毒RT-PCR檢測方法建立。
[0023]I引物設計:在GenBank中查找多個毒株,對其進行同源性分析,利用Primer5對上述保守區(qū)進行引物設計，對設計出來的病毒檢測引物進行引物二聚體分析，以避免引物之間形成穩(wěn)定的引物二聚體，從而確定該病毒的引物序列，見表1。
[0024]表1`[0025]
【權利要求】
1.一種用于檢測豬流行性腹瀉病毒的方法，包含RT-PCR的檢測PED病毒，其特征在于:所述RT-PCR引物:
PEDVF:AACGGTTCTATTCCCGTTGATG
PEDVR:TAAATGAAGCACTTTCTCACTATC。
2.根據權利要求1所述的一種用于檢測豬流行性腹瀉病毒的方法，其特征在于:PED病毒RT-PCR的檢測方法首先提取待檢樣的RNA，通過反轉錄形成cDNA，然后以反轉錄的cDNA為模板，建立PEDV的RT-PCR檢測，RT-PCR的產物為663bp。
3.根據權利要求2所述的PEDV的RT-PCR檢測方法，其特征在于:所述的RT-PCR檢測方法具體包括以下步驟: (1)待檢樣RNA的提??； (2)將提取的RNA通過反轉錄成cDNA,反應程序和反應體系如下: 取總 RNA5.75ul、反向引物 RNAlul、10mmol/L dNTPs0.5ul、5XBuffer2ul、100U/ul 反轉錄酶AMV0.5ul、RNA酶抑制劑0.25ul，總體積10ul，50°C反應lh，95°C滅活5min,即得cDNA。 (3)將獲得的反轉錄產物進行PCR擴增，反應體系和反應程序如下: 取RT產物lul，2XMixl2.5ul，正向引物和反向引物各Iul，高壓滅菌水9.5ul，總體積25ul，置入 PCR 儀，反 應條件:94°C 30second,56°C 30second, 72°C 20second，35 個循環(huán)，SP得擴增產物。 (4)RT-PCR產物的檢測結果:根據瓊脂糖凝膠電泳檢測的DNA圖譜，若擴增出分子量為663bp的特異DNA條帶則標記為攜帶PED病毒，若未擴增出特異DNA條帶則表示未攜帶PED病毒。
【文檔編號】C12R1/93GK103805712SQ201310737312
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2013年12月24日 優(yōu)先權日:2013年12月24日
【發(fā)明者】張志剛, 董劍輝, 張文利, 張曉杰, 李爽 申請人:北京偉嘉人生物技術有限公司, 沈陽偉嘉牧業(yè)有限公司