位點(diǎn)特異性生物素標(biāo)記重組IgG親和肽及其在三維定向固定IgG抗體中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種位點(diǎn)特異性生物素標(biāo)記的IgG親和肽，是在IgG親和肽的羧基端以生物方式連接生物素構(gòu)建而成，該位點(diǎn)特異性生物素標(biāo)記的IgG親和肽一經(jīng)產(chǎn)生，無需體外標(biāo)記即可定向親和吸附于親和素或鏈霉親和素預(yù)包被的固相載體表面。本發(fā)明的位點(diǎn)特異性生物素標(biāo)記重組IgG親和肽，可用于將IgG抗體固定在固相載體表面，結(jié)合后，IgG抗體的Fab端可充分暴露，從而充分保持了抗體的抗原結(jié)合活性，進(jìn)而可有效提高固相免疫分析的靈敏性、特異性與穩(wěn)定性。本發(fā)明采用Avi-tag與IgG抗體親和肽構(gòu)建融合蛋白，解決了IgG抗體親和肽的定向親和固定，進(jìn)而獲得均一、Fab段充分暴露及保持高抗原結(jié)合活性的三維定向固相化IgG抗體。
【專利說明】位點(diǎn)特異性生物素標(biāo)記重組IgG親和肽及其在三維定向固定IgG抗體中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種位點(diǎn)特異性生物素標(biāo)記重組IgG親和肽，及其在三維定向固定IgG抗體中的應(yīng)用，屬于基因工程及免疫分析領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]固相免疫測(cè)定技術(shù)是臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)的重要組成部分，如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)及免疫傳感器、免疫診斷芯片等新技術(shù)，其應(yīng)用基礎(chǔ)是將抗原或抗體包被在固相載體上進(jìn)行免疫測(cè)定，一般包被抗體更為常用。如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzymelinkedimmunosorbentassay, ELISA)即是經(jīng)典的固相免疫測(cè)定技術(shù),具有靈敏、簡單、快速及易于自動(dòng)化操作等特點(diǎn)，在生物醫(yī)學(xué)、臨床診斷等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，國內(nèi)外普遍采用聚苯乙烯(Polystyrene, PS)微孔板/管/珠等為固相載體材料且96孔PS微孔板更為常用。目前抗體在PS固相載體表面固相化方法主要有物理吸附法、化學(xué)共價(jià)交聯(lián)法及捕獲間接包被法等方法。
[0003]物理吸附法是應(yīng)用較早的抗體固相化技術(shù)，目前仍有相當(dāng)普遍的應(yīng)用。該法原理是通過蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的疏水基團(tuán)與固相載體表面疏水基團(tuán)通過物理吸附結(jié)合，這種吸附是非特異性的，存在蛋白吸附能力差及抗體活性低等問題。研究表明通過物理吸附作用直接固定在載體表面的多克隆抗體75%失去抗原結(jié)合活性，而單克隆抗體則90%沒有抗原結(jié)合活性(ButlerJE, etal.Mol Tmmunol.1993, 30:1165)。
[0004]化學(xué)共價(jià)交聯(lián)法主要是通過在載體表面的改性或修飾，引入雙功能偶聯(lián)劑、-NH2等活性基團(tuán)，使生物分子吸附到PS表面過程由被動(dòng)的物理吸附變成了共價(jià)偶聯(lián)。共價(jià)鍵依靠不同分子間活性基團(tuán)的化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的強(qiáng)相互作用力，如丹麥NUNC公司的氨基化PS微孔板及美國康寧公司的琥珀酰亞胺脂活化酶標(biāo)板，有效提高了固相抗體(抗原)的結(jié)合量。目前認(rèn)為化學(xué)共價(jià)法是提高固相材料抗體結(jié)合數(shù)量相對(duì)有效的方法，理論上只要帶有合適活性基團(tuán)的生物活性分子都能通過共價(jià)鍵牢固地結(jié)合在固相表面，研究者在載體表面引入不同的活性基團(tuán)，與蛋白質(zhì)分子內(nèi)天然氨基酸殘基，或經(jīng)“ClickChemistry”修飾的某些氨基酸殘基共價(jià)結(jié)合完成抗體的固定。盡管該模式是可控的固定方式，但存在的問題是:參與共價(jià)化學(xué)鍵的活性基團(tuán)在蛋白質(zhì)分子內(nèi)的位置有不確定性和不唯一性，不能有效保證抗體定向固定及高免疫學(xué)活性。Peter對(duì)NUNC公司的高吸附酶標(biāo)板(MaxiSorp-650)研究發(fā)現(xiàn)，盡管抗體包被量達(dá)到650ng/cm2,但僅僅只有5~10%的包被抗體具有抗原捕捉能力。
[0005]利用抗原-抗體反應(yīng)捕獲待包被抗體，在一定程度上可實(shí)現(xiàn)被捕獲抗體的定向固定。即將抗-抗體的包被抗體先進(jìn)行固定；也可采用IgG親和蛋白如SpA，該蛋白為金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁的單鏈多肽，分子量為42kD，能通過疏水作用結(jié)合人、兔等多種動(dòng)物IgG的Fe段，且這種結(jié)合不影響IgG的Fab段與抗原特異性結(jié)合的免疫活性。在IgG抗體固定化時(shí)，SpA可作為受體蛋白先吸附在PS板后，再結(jié)合IgG抗體Fe段實(shí)現(xiàn)捕獲法固定IgG。采用間接包被方式能暴露抗體的抗原結(jié)合部位，有利于捕捉體系中的抗原，在一定程度上提高了免疫檢測(cè)的特異性與靈敏度，但第一抗體或受體蛋白仍采用物理吸附法或化學(xué)共價(jià)偶聯(lián)，仍不能有效實(shí)現(xiàn)第一抗體或受體蛋白的定向包被固定。
[0006]間接包被技術(shù)中也可利用生物素-親和素系統(tǒng)(biotin-avidinsystem, BAS)固定生物素化抗體，該技術(shù)以化學(xué)共價(jià)偶聯(lián)標(biāo)記抗體分子內(nèi)-NH2、-CHO或-SH等活性位點(diǎn)通過化學(xué)法與活化生物素共價(jià)偶聯(lián)得到生物素化抗體，與已包被在聚苯乙烯等固相載體表面的親和素或鏈霉親和素，以生物素-親和素具有的獨(dú)特結(jié)合特性介導(dǎo)生物素化抗體的固相化。一個(gè)抗體分子內(nèi)存在多個(gè)偶聯(lián)位點(diǎn)，故一個(gè)抗體分子可偶聯(lián)上3~5個(gè)生物素分子；盡管親和素或鏈霉親和素的包被方式不是定向固定，然而一個(gè)親和素或鏈霉親和素具有4個(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn)，因而其生物素結(jié)合位點(diǎn)不易全被掩蓋，所以該技術(shù)可有效提高抗體的包被量。然而，生物素與抗體分子內(nèi)的活性基團(tuán)是一種隨機(jī)結(jié)合方式，當(dāng)反應(yīng)基團(tuán)的氨基酸殘基位于抗體Fab或附近時(shí)，導(dǎo)致固相化的生物素化抗體的Fe端向外而掩蓋Fab段，這樣的固相抗體就失去了抗原結(jié)合能力(如圖1所示)。
[0007]抗體在載體表面固定后的空間構(gòu)型、數(shù)量及免疫學(xué)活性是影響固相免疫測(cè)定技術(shù)穩(wěn)定性、靈敏度和選擇性的關(guān)鍵因素，建立一種抗體固定化技術(shù)，將抗體的Fe段固定在載體表面，使得Fab端從載體的表面充分向空間展示且抗原結(jié)合活性得以完好保持，對(duì)于提高固相免疫分析的靈敏性、特異性與穩(wěn)定性具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的在于提供一種實(shí)現(xiàn)IgG抗體的特異性三維定向固定的“生物橋梁”——位點(diǎn)特異性生物素標(biāo)記重組IgG親和肽，本發(fā)明的位點(diǎn)特異性生物素標(biāo)記重組IgG親和肽，一經(jīng)產(chǎn)生，無需體外標(biāo)記即可介導(dǎo)IgG親和肽定向親和吸附于親和素或鏈霉親和素預(yù)包被的固相載體表面。利用生物親和方式將本發(fā)明的位點(diǎn)特異性生物素標(biāo)記重組IgG親和肽與預(yù)包被親和素或鏈霉親和素的聚苯乙烯載體特異性結(jié)合，再利用生物親和方式將本發(fā)明的位點(diǎn)特異性生物素標(biāo)記重組IgG親和肽與IgG抗體結(jié)合，即可得到三維固相化IgG抗體，該三維固相化IgG抗體的Fab端可充分暴露，從而充分保持抗體的抗原結(jié)合活性，進(jìn)而可有效提高固相免疫分析的靈敏性、特異性與穩(wěn)定性。
[0009]本發(fā)明是通過以 下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0010]一種位點(diǎn)特異性生物素標(biāo)記的IgG親和肽，是在IgG親和肽的羧基端連接生物素構(gòu)建而成，該位點(diǎn)特異性生物素標(biāo)記的IgG親和肽一經(jīng)產(chǎn)生，無需體外標(biāo)記即可定向親和吸附于親和素或鏈霉親和素預(yù)包被的固相載體表面。
[0011]所述位點(diǎn)特異性生物素標(biāo)記的IgG親和肽的制備方法如下:
[0012](I)根據(jù)(Gly4-Ser)3及Avi基因序列，化學(xué)合成(Gly4-Ser)3-Avi的基因片段，重組至pUC18載體，獲得中間質(zhì)粒載體(這個(gè)過程是常規(guī)技術(shù)手段就可以實(shí)現(xiàn)的，所提及的PUC18載體是所屬領(lǐng)域的常規(guī)載體)；
[0013](2)設(shè)計(jì)引物以PCR方式獲得IgG親和肽(ZZ親和肽)基因，重組至上述中間質(zhì)粒載體，獲得原核表達(dá)載體；
[0014](3)原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21 (DE3)，獲得基因工程菌；
[0015](4)培養(yǎng)基因工程菌，培養(yǎng)基中含有終濃度為50 μ M的生物素，依菌體內(nèi)BirA酶同步催化，在所表達(dá)的目的蛋白的Avi序列的賴氨酸位點(diǎn)結(jié)合生物素；[0016](5)純化目的蛋白，獲得生物素定點(diǎn)定量連接的IgG親和肽:ZZ-Biotin。
[0017]進(jìn)一步地，制備方法具體如下:
[0018](I)根據(jù)Av1-tag氨基酸序列，化學(xué)合成其基因序列:
[0019]5' -GGTCTGAACGATATCTTCGAAGCTCAGAAAATCGAATGGCACGAA-3'(如 SEQIDN0.1 所示)；
[0020]并在其5 '端置入柔性蛋白Linker: (Gly4-Ser)3的基因序列，得(Gly4-Ser)3-Av1-tag基因序列，并分別在該重組基因片段上下游置入Pst1、HindIII酶切位點(diǎn)，酶切插入PUC18載體，得中間質(zhì)粒載體；
[0021](2)表達(dá)載體及基因工程菌的構(gòu)建:
[0022]①設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增ZZ親和肽基因，并插入到上述中間質(zhì)粒載體的EcoR1、PstI位點(diǎn)，構(gòu)建得到重組表達(dá)載體pUCZZ- (Gly4-Ser) 3_Avi_tag,該重組表達(dá)載體表達(dá)得到的重組蛋白是羧基端帶柔性蛋白Linker及Av1-tag的ZZ親和肽；
[0023]②上述重組表達(dá)載體CaCl2轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21 (DE3)，氨芐LB抗性平板(即培養(yǎng)基中除常規(guī)LB培養(yǎng)基的成分外，還含氨芐100μ g/mL)篩選陽性克隆，獲得基因工程菌；
[0024](3)基因工程菌的培養(yǎng)及體內(nèi)生物素化:
[0025]①挑取單克隆菌落接種于5mL液體LB培養(yǎng)基(培養(yǎng)基中除常規(guī)LB培養(yǎng)基的成分外，還含氨芐100μ g/mL)，37°C過夜培養(yǎng)、活化；
[0026]②活化菌液按照2% (v/v)`的接種量轉(zhuǎn)接于新鮮的50mL液體LB培養(yǎng)基(培養(yǎng)基中除常規(guī)LB培養(yǎng)基的成分外，還含氨芐100μ g/mL)，37°C培養(yǎng)至0D_為0.3時(shí)，在培養(yǎng)基中加入終濃度為50 μ M的生物素，繼續(xù)培養(yǎng)16h，依大腸桿菌菌體內(nèi)BirA酶同步催化所表達(dá)的目的蛋白在Avi序列賴氨酸位點(diǎn)結(jié)合生物素；
[0027](4)融合蛋白的提取:
[0028]①經(jīng)上述培養(yǎng)的基因工程菌4°C，1000rpm離心lOmin，收集菌體；
[0029]②菌體以5mL0.1M的Tris緩沖液重懸，置入_80°C液氮中l(wèi)Omin，再迅速置入37°C的恒溫水浴中15min，如此反復(fù)凍融3次；
[0030]③上述反復(fù)凍融的菌液4°C，1200rpm離心lOmin，上清轉(zhuǎn)入一新離心管中；
[0031 ] (5)目的融合蛋白的純化:
[0032]①清洗柱子:用2柱體積的BufferA清洗Strep-Tactin柱；
[0033]②樣品上柱:取步驟(4)凍融的菌液上清5mL流通上柱結(jié)合目的蛋白；
[0034]③沖洗柱子:用5柱體積的BufferA洗柱，并收集每部分的洗脫液；
[0035]④目的蛋白的洗脫:以BufferB洗脫目的蛋白，收集每一部分并各取20 μ ISDS-PAGE 鑒定；
[0036]⑤目的蛋白的脫鹽與濃縮:使用Millipore超濾器,4°C, 4000rpm,離心30min濃縮，將濃縮液以0.01MTBS稀釋至合適體積，既得定點(diǎn)定量、生物學(xué)標(biāo)記的生物素化IgG抗體親和肽:ZZ_Biotin。
[0037]所述BufferA 的配方組成為:IOOmMTris.Cl, 150mMNaCl, ImMEDTA,余量為水，PH8.0 (為現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī)試劑)。
[0038]所述BufferB 的配方組成為:IOOmMTris.Cl，150mMNaCl，ImMEDTA，2.5mMdesthiobiotin, pH8.0 (為現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī)試劑)。
[0039]所述LB培養(yǎng)基的配方為:1L培養(yǎng)基中含5g酵母粉，IOg蛋白胨，5gNaCl，IOOmg氨芐青霉素，余量為水，PH7.2~7.4。
[0040]本發(fā)明的位點(diǎn)特異性生物素標(biāo)記重組IgG親和肽，可用于將IgG抗體固定在固相載體表面，利用本發(fā)明的位點(diǎn)特異性生物素標(biāo)記的IgG親和肽將IgG抗體固定在固相載體表面的方法為:(A)首先，將位點(diǎn)特異性生物素標(biāo)記的IgG親和肽(ZZ-Biotin)與預(yù)包被親和素或鏈霉親和素的聚苯乙烯載體以生物素-親和素結(jié)合特異性定向吸附固定；(B)然后再利用IgG親和肽與IgG抗體的特異性結(jié)合將IgG抗體結(jié)合到IgG親和肽上，結(jié)合后，IgG抗體的Fab端可充分暴露，從而充分保持了抗體的抗原結(jié)合活性，進(jìn)而可有效提高固相免疫分析的靈敏性、特異性與穩(wěn)定性。
[0041]一種結(jié)合有IgG親和肽的固相載體，其結(jié)構(gòu)為:在預(yù)包被親和素或鏈霉親和素的聚苯乙烯載體表面特異性定向吸附固定有IgG親和肽，是通過以下方法制備而成:將位點(diǎn)特異性生物素標(biāo)記的IgG親和肽(ZZ-Biotin)與預(yù)包被親和素或鏈霉親和素的聚苯乙烯載體以生物素-親和素結(jié)合特異性定向吸附固定，即得。
[0042]—種三維固相化IgG抗體,其結(jié)構(gòu)為:IgG親和肽與IgG抗體結(jié)合,IgG親和肽定向吸附固定在預(yù)包被親和素或鏈霉親和素的聚苯乙烯載體表面，是通過上述方法制備而成。
[0043]上述步驟(A) “將位點(diǎn)特異性生物素標(biāo)記的IgG親和肽(ZZ-Biotin)與預(yù)包被親和素或鏈霉親和素的聚苯乙烯載體以生物素-親和素結(jié)合特異性定向吸附固定”的具體方式如下: [0044]①按100 μ L/ 孔的 ZZ-Biotin 蛋白溶液(PBST 溶液，含 IMNaCl ;ZZ_Biotin 蛋白濃度0.05yg/mL)加到親和素預(yù)包被聚苯乙烯的96孔聚苯乙烯板孔內(nèi)，37°C溫育2h ；
[0045]②以含0.2MNaCl的PBST溶液洗滌，或:以含0.2MNaCl及0.005%NaN3的PBST溶液洗滌，共洗滌3次，每次5min，在吸水紙上拍干96孔板，獲得ZZ-Biotin定向吸附固定的聚苯乙烯微孔板，4°C保存。
[0046]上述步驟(B) “利用IgG親和肽與IgG抗體的特異性結(jié)合將IgG抗體結(jié)合到IgG親和肽上”的具體方式如下:
[0047]①按100 μ L/孔的IgG抗體(抗體的濃度為0.1 μ g/mL,溶劑為含IMNaCl的PBS溶液，)加到上述ZZ-Biotin定向吸附固定的聚苯乙烯微孔板，37°C溫育2h ；
[0048]②以含0.2MNaCl的PBST溶液洗滌，共洗滌3次，每次5min，在吸水紙上拍干96孔板，獲得三維定向固定的IgG抗體。
[0049]所述緩沖液PBST為ρΗ7.4的PBS溶液中含有0.05%Tween_20。
[0050]所述緩沖液PBS 為 ρΗ7.4 的溶液中，含有 NaCl 137mM，KC12.7mM, Na2HPO4IOmM,KH2P042mM。
[0051]由【背景技術(shù)】可知，SpA可親和IgG抗體而在免疫測(cè)定中應(yīng)用，但SpA的IgG結(jié)合活性來自E、D、A、B、C5個(gè)高度同源的IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域。研究發(fā)現(xiàn)，其IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域不僅與IgG的Fe段結(jié)合，也與某些IgG的Fab段(如人IgGl的F(ab’)2)結(jié)合。本發(fā)明以ZZ親和肽結(jié)構(gòu)域代替SpA的5個(gè)同源IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域克服了 SpA與某些IgG的Fab段結(jié)合的缺點(diǎn)。SpA也應(yīng)用于IgG抗體的間接包被,但SpA與固相載體的吸附是隨機(jī)化學(xué)或物理吸附,不能實(shí)現(xiàn)SpA的定向吸附固定。因此本發(fā)明采用僅與IgG的Fe段結(jié)合結(jié)構(gòu)域一ZZ親和肽，提高了對(duì)IgG的Fe結(jié)合特異性，也實(shí)現(xiàn)了 ZZ親和肽的定向固定。
[0052]由【背景技術(shù)】可知，生物素化抗體可通過生物素-親和素作用有效包被在親和素包被的載體表面，但生物素與抗體分子內(nèi)的活性基團(tuán)是一種隨機(jī)結(jié)合方式，當(dāng)反應(yīng)基團(tuán)的氨基酸殘基位于抗體Fab或附近時(shí)，導(dǎo)致固相化的生物素化抗體的Fe端向外而掩蓋Fab段，仍不能保證所吸附的抗體是定向固定的抗體。理論上講，Av1-tag可與單鏈抗體ScFv構(gòu)建融合蛋白實(shí)現(xiàn)生物素標(biāo)簽介導(dǎo)ScFv抗體的定向固定，但對(duì)于目前免疫分析中最為常用的多克隆及單克隆抗體，因受到構(gòu)建融合蛋白技術(shù)限制，不能實(shí)現(xiàn)多克隆及單克隆抗體的定向固定。
[0053]本發(fā)明采用Av1-tag與IgG抗體親和肽構(gòu)建融合蛋白，解決了 IgG抗體親和肽的定向親和固定，更為進(jìn)步的是，實(shí)現(xiàn)了多克隆及單克隆抗體在聚苯乙烯載體上的生物學(xué)方式三維定向固定。本發(fā)明提供了一種位點(diǎn)特異性生物素標(biāo)記的IgG親和肽介導(dǎo)固相化三維IgG抗體，是利用生物素化標(biāo)簽肽(Av1-tag)與IgG抗體親和肽之間構(gòu)建重組蛋白，在菌體內(nèi)實(shí)現(xiàn)IgG親和肽的定點(diǎn)生物素化，繼而利用生物素-親和素特異性親和作用將IgG抗體親和肽定向吸附在PS表面，進(jìn)而結(jié)合IgG抗體Fe段達(dá)到抗體Fab端向外定向展示，獲得均一、Fab段充分暴露及保持高抗原結(jié)合活性的三維定向固相化IgG抗體。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0054]圖1:化學(xué)共價(jià)偶聯(lián)的生物素化抗體在親和素包被的固相載體表面的結(jié)合固定示意圖。
[0055]圖2:位點(diǎn)特異性生物素標(biāo)記重組IgG親和肽在親和素包被的固相載體表面的定向固定示意圖。
[0056]圖3:位點(diǎn)特異性 生物素標(biāo)記重組IgG親和肽導(dǎo)向IgG抗體的三維定向固定示意圖。
[0057]圖4:位點(diǎn)特異性生物素標(biāo)記重組IgG親和肽介導(dǎo)IgG定向固定與化學(xué)共價(jià)偶聯(lián)生物素化IgG直接吸附固定的ELISA檢測(cè)結(jié)果比較。
【具體實(shí)施方式】
[0058]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0059]若無特別說明，所涉及的試劑、試驗(yàn)方法均為常規(guī)法試劑、常規(guī)方法。
[0060]所述BufferB 的配方組成為:IOOmMTris.Cl，150mMNaCl，ImMEDTA，
2.5mMdesthiobiotin, pH8.0 (為現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī)試劑)。
[0061]所述LB培養(yǎng)基的配方為:IL培養(yǎng)基中含5g酵母粉，IOg蛋白胨，5gNaCl, IOOmg氨芐青霉素，余量為水，PH7.2~7.4。
[0062]所述LB培養(yǎng)基的配方為:IL培養(yǎng)基中含5g酵母粉，IOg蛋白胨，5gNaCl, IOOmg氨芐青霉素，余量為水，PH7.2~7.4。
[0063]所述緩沖液PBST為ρΗ7.4的PBS溶液中含有0.05%Tween_20。
[0064]所述緩沖液PBS 為 ρΗ7.4 的溶液中，含有 NaCl 137mM，KC12.7mM, Na2HPO4IOmM,KH2P042mM。
[0065]實(shí)施例1含(Gly4-Ser)3 - Av1-tag基因序列中間質(zhì)粒載體的構(gòu)建[0066]步驟如下:
[0067](I)根據(jù)(Gly4-Ser)3及Av1-tag基因序列設(shè)計(jì)如下基因序列:
[0068]5' -GCGGAGGTGGATCTGGCGGAGGTGGATCGGGCGGAGGTGGATCAGGTCTGAACGATATCTTCGAAGCTCAGAA AATCGAATGGCACGAA-3';如 SEQIDN0.2 所示；
[0069]其5'端及3'端分別設(shè)有Pst1、HindIII酶切位點(diǎn)。
[0070]上述基因序列化學(xué)合成委托大連寶生物生物工程公司完成；
[0071](2)化學(xué)合成得到的DNA片段雙酶切重組至pUC18載體，獲得含有(Gly4-Ser) 3_Avi_tag 融合基因的中間載體 pUC (Gly4-Ser) 3_Avi_tag。
[0072]實(shí)施例2IgG親和肽-Av1-tag融合蛋 白(ZZ-Av1-tagfusionprotein)的基因重組技術(shù)制備與純化
[0073]步驟如下:
[0074](I) IgG親和肽(ZZ基因)序列的擴(kuò)增、載體及基因工程菌的構(gòu)建:設(shè)計(jì)引物:
[0075]5' -CCGGAATTCCATGGCGCAACACGATGAAG-3'(如 SEQIDN0.3 所示)；
[0076]和:5'-CCCCTGCAGTTAATTCGCGTC-3'(如 SEQIDN0.4 所示)；
[0077]以pEZZ18為模板，上述引物PCR擴(kuò)增ZZ基因，克隆至實(shí)例I構(gòu)建的中間質(zhì)粒載體pUC(Gly4-Ser) 3-Av1-tag的EcoR1、PstI位點(diǎn)，獲重組表達(dá)載體pUCZZ-(Gly4-Ser)3-Av1-tag/E.coliBL21 質(zhì)粒，CaCl2 轉(zhuǎn)化 E.coliBL21，氨芐 LB 抗性平板(即培養(yǎng)基中除常規(guī)LB培養(yǎng)基的成分外，還含氨芐100 μ g/mL)篩選陽性克隆，獲得基因工程菌。
[0078](2) ZZ-Av1-tag融合蛋白的表達(dá):
[0079]①挑取單克隆菌落接種于5mL液體LB培養(yǎng)基(培養(yǎng)基中除常規(guī)LB培養(yǎng)基的成分外，還含氨芐100μ g/mL)，37°C過夜(12h)培養(yǎng)、活化；
[0080]②活化菌液按照2% (v/v)的接種量轉(zhuǎn)接于新鮮的50mL液體LB培養(yǎng)基(培養(yǎng)基中除常規(guī)LB培養(yǎng)基的成分外，還含氨芐100μ g/mL)，37°C培養(yǎng)至0D_為0.3時(shí)，在培養(yǎng)基中加入終濃度為50 μ M的生物素，繼續(xù)培養(yǎng)16h，依大腸桿菌菌體內(nèi)BirA酶同步催化所表達(dá)的目的蛋白在Avi序列賴氨酸位點(diǎn)結(jié)合生物素。
[0081](3)融合蛋白的提取:
[0082]①經(jīng)上述培養(yǎng)的基因工程菌4°C，1000rpm離心lOmin，收集菌體；
[0083]②菌體以5mL0.1M的Tris緩沖液重懸，置入_80°C液氮中l(wèi)Omin，再迅速置入37°C的恒溫水浴中15min，如此反復(fù)凍融3次，釋放目的蛋白；
[0084]③上述反復(fù)凍融的菌液4°C，12000rpm離心lOmin，上清轉(zhuǎn)入一新離心管中；
[0085](4)目的融合蛋白的純化:
[0086]①清洗柱子:用2柱體積的BufferA清洗Strep-Tactin柱；
[0087]②樣品上柱:取步驟(4)凍融的菌液上清5mL流通上柱結(jié)合目的蛋白；
[0088]③沖洗柱子:用5柱體積的BufferA洗柱；
[0089]④目的蛋白的洗脫:以BufferB洗脫目的蛋白，流速0.2ml/min,收集每一部分并各取 20 μ ISDS-PAGE 鑒定；
[0090]⑤目的蛋白的脫鹽與濃縮:使用Millipore超濾器,4°C, 4000rpm,離心30min濃縮，用5mL0.1MPBS加入超濾管中，離心30min，重復(fù)3次，可去除濃縮液中的EDTA并將緩沖液更換為0.1MPBS，將濃縮液以0.1MPBS稀釋至合適體積，既得定點(diǎn)定量生物素標(biāo)記的ZZ親和肽=ZZ-Biotin。
[0091]實(shí)施例3ZZ_Biotin對(duì)ZZ親和肽的定向固定
[0092]步驟如下:
[0093](1)按 100 μ L/孔的 ZZ-Biotin 蛋白溶液(PBST 溶液，含 IMNaCl ;ZZ_Biotin 蛋白濃度0.05 μ g/mL)加到親和素預(yù)包被聚苯乙烯的96孔聚苯乙烯板孔內(nèi)，37°C溫育2h ；
[0094](2)以含0.2MNaCl的PBST溶液洗滌，共洗滌3次，每次5min，在吸水紙上拍干96孔板，獲得ZZ-Biotin定向吸附固定的聚苯乙烯微孔板(如圖2所示)，4°C保存。
[0095]實(shí)施例4ZZ_Biotin導(dǎo)向IgG多克隆抗體在微孔板表面的三維定向固定
[0096]步驟如下:
[0097](I)按100 μ L/孔的兔IgG抗體(兔IgG抗體的濃度為0.1 μ g/mL，溶劑為含IMNaCl的PBS溶液，)加到上述ZZ-Biotin定向吸附固定的聚苯乙烯微孔板，37°C溫育2h ；
[0098](2)以含0.2MNaCl的PBST溶液洗滌，共洗滌3次，每次5min，在吸水紙上拍干96孔板，獲得三維定向固定的兔多克隆IgG抗體(如圖3所示)。
[0099]實(shí)施例5ZZ_Biotin導(dǎo)向IgG單克隆抗體在微孔板表面的三維定向固定
[0100]步驟如下:
[0101](I)按100 μ L/孔的鼠單克隆抗體(0.01 μ g/mL，含IMNaCl的PBS溶液，)加到聚苯乙烯微孔板已包被的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37°C溫育2h ；
[0102](2)以含0.2MNaCl的PBST溶液洗滌，共洗滌3次，每次5min，在吸水紙上拍干96孔板，獲得三維定向固定的鼠單克隆IgG抗體。
[0103]實(shí)施例6ZZ_Biotin導(dǎo)向三維定向固定IgG抗體對(duì)檢測(cè)效能的影響
[0104]步驟如下:
[0105](I)按100 μ L/孔的鼠-抗IgY單克隆抗體(IgG2a亞類)(鼠IgG抗體的濃度為
0.1 μ g/mL，溶劑為含IMNaCl的PBS溶液)加到實(shí)施例3的ZZ-Biotin定向吸附固定的聚苯乙烯微孔板，37 °C溫育a;
[0106](2)以含0.2MNaCl的PBST溶液洗滌，共洗滌3次，每次5min，在吸水紙上拍干96孔板。
[0107](3) IOOyL系列濃度的IgY (O~400ng/mL)加入到孔內(nèi)，37°C溫育lh，以PBST洗滌3次，100 μ L/孔HRP標(biāo)記的山羊-抗IgY抗體(1:2000)加入到孔內(nèi)，37°C溫育Ih，以PBST洗滌3次，TMB底物顯色。
[0108](4)對(duì)照實(shí)驗(yàn):生物素化學(xué)直接標(biāo)記的鼠-抗IgY單克隆抗體(IgG2a亞類)(鼠IgG抗體的濃度為0.1 μ g/mL,溶劑為含IMNaCl的PBS溶液)按100 μ L/孔的加入親和素預(yù)包被聚苯乙烯的96孔聚苯乙烯板孔，4°C過夜包被，以PBST洗滌3次，每次5min，甩干；100 μ L系列濃度的IgY (O - 400n g/mL)加入到孔內(nèi)，37°C溫育Ih,以PBST洗滌3次，100 μ L/孔HRP標(biāo)記的山羊-抗IgY抗體(1:2000)加入到孔內(nèi)，37°C溫育lh，以PBST洗滌3次，TMB底物顯色。
[0109](5)兩種不同固定方式的結(jié)果如圖4所示，本發(fā)明ZZ-Biotin導(dǎo)向三維定向固定IgG抗體的檢測(cè)線性范圍為0.5~800ng/mL，檢測(cè)靈敏度為0.1ng/mL ;對(duì)照試驗(yàn)即直接吸附固定模式的檢測(cè)線性范圍為2~600ng/mL，檢測(cè)靈敏度為Ing/mL。本發(fā)明ZZ-Biotin導(dǎo)向三維定向固定 IgG抗體技術(shù)在ELISA測(cè)定中有更寬的檢測(cè)線性范圍，檢測(cè)靈敏度可提高10倍。
【權(quán)利要求】
1.一種位點(diǎn)特異性生物素標(biāo)記的IgG親和肽，是在IgG親和肽的羧基端以生物學(xué)方式連接生物素構(gòu)建而成。
2.權(quán)利要求1所述的位點(diǎn)特異性生物素標(biāo)記的IgG親和肽的制備方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)根據(jù)(Gly4-Ser)3及Avi基因序列，化學(xué)合成(Gly4-Ser)3-Avi的基因片段，重組至PUC18載體，獲得中間質(zhì)粒載體； (2)設(shè)計(jì)引物以PCR方式獲得IgG親和肽基因，重組至上述中間質(zhì)粒載體，獲得原核表達(dá)載體； (3)原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21，獲得基因工程菌； (4)培養(yǎng)基因工程菌，培養(yǎng)基中含有生物素，依菌體內(nèi)BirA酶同步催化，在所表達(dá)的目的蛋白的Avi序列的賴氨酸位點(diǎn)結(jié)合生物素； (5)純化目的蛋白，獲得生物素定點(diǎn)定量連接的IgG親和肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的位點(diǎn)特異性生物素標(biāo)記的IgG親和肽的制備方法，其特征在于:步驟如下: (O根據(jù)Av1-tag氨基酸序列，化學(xué)合成其基因序列，并在其5'端置入柔性蛋白Linker: (Gly4-Ser)3的基因序列，得(Gly4-Ser) 3_Avi_tag基因序列，并分別在該重組基因片段上下游置入Pst1、HindIII酶切位點(diǎn)，酶切插入pUC18載體，得中間質(zhì)粒載體； (2)表達(dá)載體及基因工程菌的構(gòu)建: ①設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增ZZ親和肽基因，并插入到上述中間質(zhì)粒載體的EcoR1、PstI位點(diǎn)，構(gòu)建得到重組表達(dá)載體pUCZZ- (Gly4-Ser) 3_Avi_tag ； ②上述重組表達(dá)載體CaCl2轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21，氨芐LB抗性平板篩選陽性克隆，獲得基因工程菌； (3)基因工程菌的培養(yǎng)及體內(nèi)生物素化: ①挑取單克隆菌落接種于5mL液體LB培養(yǎng)基，37°C過夜培養(yǎng)、活化； ②活化菌液按照2%的接種量轉(zhuǎn)接于新鮮的50mL液體LB培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)至0D_為.0.3時(shí)，在培養(yǎng)基中加入終濃度為50 μ M的生物素，繼續(xù)培養(yǎng)16h，依大腸桿菌菌體內(nèi)BirA酶同步催化所表達(dá)的目的蛋白在Avi序列賴氨酸位點(diǎn)結(jié)合生物素； (4)融合蛋白的提取: ①經(jīng)上述培養(yǎng)的基因工程菌4°C，1000rpm離心lOmin，收集菌體； ②菌體以5mL0.1M的Tris緩沖液重懸，置入-80°C液氮中l(wèi)Omin，再迅速置入37°C的恒溫水浴中15min，如此反復(fù)凍融3次； ③上述反復(fù)凍融的菌液4°C，1200rpm離心lOmin，上清轉(zhuǎn)入一新離心管中； (5)目的融合蛋白的純化: ①清洗柱子:用2柱體積的BufferA清洗Strep-Tactin柱； ②樣品上柱:取步驟(4)凍融的菌液上清5mL流通上柱結(jié)合目的蛋白； ③沖洗柱子:用5柱體積的BufTerA洗柱，并收集每部分的洗脫液； ④目的蛋白的洗脫: 以BufferB洗脫目的蛋白； ⑤目的蛋白的脫鹽與濃縮:使用Millipore超濾器,4°C,4000rpm,離心30min濃縮，既得定點(diǎn)定量生物素標(biāo)記的ZZ親和肽。
4.權(quán)利要求1所述的位點(diǎn)特異性生物素標(biāo)記重組IgG親和肽在三維定向固定IgG抗體中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于:應(yīng)用時(shí)，方法為:(A)首先，將位點(diǎn)特異性生物素標(biāo)記的IgG親和肽與預(yù)包被親和素或鏈霉親和素的聚苯乙烯載體以生物素-親和素結(jié)合特異性定向吸附固定；(B)然后再利用IgG親和肽與IgG抗體的特異性結(jié)合將IgG抗體Fe端結(jié)合到IgG親和肽上。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于:所述步驟(A)的具體方式如下: ①按100μ L/孔的ZZ-BiOtin蛋白溶液加到親和素預(yù)包被聚苯乙烯的96孔聚苯乙烯板孔內(nèi)，37 °C溫育2h; ②以含0.2MNaCl的PBST溶液洗滌，或:以含0.2MNaCl及0.005%NaN3的PBST溶液洗漆，共洗漆3次,每次5min,在吸水紙上拍干96孔板,獲得ZZ-Biotin定向吸附固定的聚苯乙烯微孔板。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于:所述步驟(B)的具體方式如下: ①按100μ L/孔的IgG抗體加到ZZ-BiOtin定向吸附固定的聚苯乙烯微孔板，37°C溫育2h ； ②以含0.2MNaCl的PBST溶液洗滌，共洗滌3次，每次5min，在吸水紙上拍干96孔板，獲得三維定向固定的IgG抗體。
8.一種結(jié)合有IgG親和肽的固相載體，其特征在于:其結(jié)構(gòu)為:在預(yù)包被親和素或鏈霉親和素的聚苯乙烯載體表面特異性定向吸附固定有權(quán)利要求1所述的位點(diǎn)特異性生物素標(biāo)記的IgG親和肽。
9.一種三維固相化IgG抗體，其特征在于:其結(jié)構(gòu)為:權(quán)利要求1所述的位點(diǎn)特異性生物素標(biāo)記的IgG親和肽與IgG抗體結(jié)合，IgG親和肽定向吸附固定在預(yù)包被親和素或鏈霉親和素的聚苯乙烯載體表面。
【文檔編號(hào)】C12N15/70GK103694358SQ201310730765
【公開日】2014年4月2日 申請(qǐng)日期:2013年12月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月26日
【發(fā)明者】唐金寶, 楊洪鳴 申請(qǐng)人:濰坊醫(yī)學(xué)院