金魚腎臟細(xì)胞系及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種金魚腎臟細(xì)胞系及其應(yīng)用。該金魚腎臟細(xì)胞系已于2013年12月4日保存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC），并證明存活，其保藏登記編號為CGMCC?No.8557。本發(fā)明所述的金魚腎臟細(xì)胞系特性穩(wěn)定、成分均一，是研究水產(chǎn)動物病毒的良好材料。
【專利說明】金魚腎臟細(xì)胞系及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種金魚腎臟細(xì)胞系及其應(yīng)用，屬于醫(yī)學(xué)生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]關(guān)于魚類細(xì)胞系的研究，國內(nèi)外取得了很大的研究進(jìn)展。在我國魚類細(xì)胞培養(yǎng)研究始于20世紀(jì)70年代，細(xì)胞系主要來自鯉科魚類。1981年張念慈等人建立的草魚吻端組織細(xì)胞系ZC-7901。后來草魚尾鰭細(xì)胞系GCCF-2、草魚腎臟組織細(xì)胞系CIK和團(tuán)頭魴尾鰭細(xì)胞系TQ-8801等多種魚類細(xì)胞系相繼建立，為魚類病毒的研究奠定了堅實的基礎(chǔ)。魚類原代細(xì)胞系的建立技術(shù)目前是一種較為成熟的技術(shù)，但是要獲得針對病毒敏感的細(xì)胞系是存著很大的偶然性，所以建立一株需要魚類細(xì)胞系有效的辦法是以數(shù)量對質(zhì)量，即制備大批量的原代細(xì)胞株，從而篩選出敏感的細(xì)胞系。
[0003]世界衛(wèi)生組織(OIE)檢測水產(chǎn)動物病毒的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”是通過細(xì)胞來分離病毒。為了能夠更好有效的分離到水產(chǎn)動物的病毒，及早的檢測出病毒，預(yù)防疾病的爆發(fā)，許多國內(nèi)外的學(xué)者仍然在進(jìn)行魚類細(xì)胞系的研究。目前尚無關(guān)于建立金魚腎臟細(xì)胞系的相關(guān)報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的第一個技術(shù)問題是提供一種特性穩(wěn)定、成分均一的金魚腎臟細(xì)胞系(GK)，是一些水產(chǎn)動物病毒的敏感細(xì)胞系，是進(jìn)一步研究未知病毒的良好材料。
[0005]本發(fā)明要解決的第二個技術(shù)問題是提供一種金魚腎臟細(xì)胞系的制備方法。
[0006]本發(fā)明要解決的第三個技術(shù)問題是提供所述的金魚腎臟細(xì)胞系在對水產(chǎn)動物病毒分離方面的初步應(yīng)用。`
[0007]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案:
[0008]經(jīng)過篩選，本發(fā)明獲得了特性穩(wěn)定、成分均一的金魚腎臟細(xì)胞系，該金魚腎臟細(xì)胞系(GK)已于2013年12月4日保存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，并證明存活，其保藏登記編號為CGMCC N0.8557，保存地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼100101，其分類命名為金魚腎臟細(xì)胞系。
[0009]進(jìn)一步地，所述細(xì)胞系具有以下生物學(xué)特性:
[0010](I)細(xì)胞呈現(xiàn)典型的上皮細(xì)胞形態(tài)，連續(xù)傳代培養(yǎng)50代仍保持該形態(tài)特點(diǎn)；
[0011](2)細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力，連續(xù)培養(yǎng)50代仍保持該增殖和生長特性。
[0012]本發(fā)明還提供了一種上述金魚腎臟細(xì)胞系的制備方法，該方法包括以下步驟:
[0013](I)取金魚一條，用醫(yī)用酒精浸泡l_5min，于無菌條件下剪取金魚的腎臟，放于濃度為1000u/ml的青霉素-鏈霉素雙抗溶液中，放置10-15min ；
[0014](2)胰酶消化液消化lOmin，然后用剪刀剪成小塊，用培養(yǎng)基重懸，離心，棄掉上清液，再用培養(yǎng)基進(jìn)行重懸，離心，棄掉上清，最后加入培養(yǎng)基，重懸混勻；
[0015](3)將步驟(2)制備的重懸混勻液加入到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，25°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0016](4)待細(xì)胞鋪板到1/3的時候，更換新鮮的培養(yǎng)基一次；[0017](5)待細(xì)胞鋪滿板子，用胰酶消化液進(jìn)行初步消化后，加入新的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；
[0018](6)傳代3次后，凍存，復(fù)蘇后能夠繼續(xù)穩(wěn)定增殖生長，該細(xì)胞系命名為GK。
[0019]進(jìn)一步地，所述培養(yǎng)基為含有濃度為100u/ml青霉素-鏈霉素雙抗溶液和10 %特級胎牛血清的M199培養(yǎng)基。
[0020]進(jìn)一步地，所述胰酶消化液的配制:磷酸氫二鈉2.3g，磷酸二氫鉀0.1g,氯化鈉
8.0g,氯化鉀 0.2g，EDTA0.2g，胰酶 0.6g，水 1000ml。
[0021]進(jìn)一步地，本發(fā)明所述的金魚腎臟細(xì)胞系GK可以作為研究水產(chǎn)動物病毒宿主細(xì)胞使用，用于水產(chǎn)動物病毒的分離。
[0022]本發(fā)明的有益效果如下:
[0023]實驗中使用的是魚類細(xì)胞培養(yǎng)的最常用的培養(yǎng)基、且在簡單的條件進(jìn)行原代細(xì)胞篩選培養(yǎng)，保證最終獲得的細(xì)胞無需特殊試劑和條件就能增殖，為其今后的應(yīng)用提供更好的空間。該金魚腎臟細(xì)胞系是首次成功在體外培養(yǎng)。該細(xì)胞在培養(yǎng)7天，明顯出現(xiàn)延伸生長；15天后鋪滿板子，進(jìn)行消化后，具有較強(qiáng)的繁殖能力，呈現(xiàn)典型的上皮細(xì)胞形態(tài)。細(xì)胞連續(xù)傳代培養(yǎng)16個月已傳至50代，仍然保持上述形態(tài)特點(diǎn)、生長和增殖特性。因此，該細(xì)胞是一種特性穩(wěn)定、成分均一的金魚腎臟細(xì)胞系，是研究水產(chǎn)動物病毒的良好材料。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)的說明；
[0025]圖1相差顯微鏡下的金魚腎臟細(xì)胞系的形態(tài)；
[0026]圖2金魚腎臟細(xì)胞系懸浮特`性分析
[0027]圖3金魚腎臟細(xì)胞系的最佳血清濃度的確定；
[0028]圖4金魚腎臟細(xì)胞系的最佳培養(yǎng)溫度的確定；
[0029]圖5金魚腎臟細(xì)胞系的倍增曲線分析；
[0030]圖6病魚組織進(jìn)行PCR檢測結(jié)果；M:DL2000DNA Marker ；N:空白對照(水);P:陽性對照。
[0031]圖7金魚腎臟細(xì)胞系的增殖病毒的初步應(yīng)用。
【具體實施方式】
[0032]為更好地理解本發(fā)明，下面將通過具體的實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的方案，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)包括權(quán)利要求的全部內(nèi)容，但不限于此。
[0033]實施例1金魚腎臟細(xì)胞的分離和原代培養(yǎng)
[0034]實驗材料和試劑
[0035]實驗動物:10g_30g的金魚(經(jīng)過反復(fù)分子方法驗證未感染水產(chǎn)動物病毒的健康金魚)。
[0036]實驗器具:解剖刀、眼科剪刀、眼科鑷子和紗布等。
[0037]培養(yǎng)基和相關(guān)試劑:
[0038]青霉素-鏈霉素雙抗溶液濃度為10000u/ml ；
[0039]培養(yǎng)基:含有濃度為100u/ml青霉素-鏈霉素雙抗溶液和10 %特級胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)的M199培養(yǎng)基(gibco公司)；[0040]胰酶消化液:磷酸氫二鈉2.3g，磷酸二氫鉀0.1g,氯化鈉8.0g,氯化鉀0.2g，EDTA0.2g，胰酶 0.6g，水 1000ml ；
[0041]醫(yī)用酒精；
[0042]0.01M 的 PBS 緩沖液(NaC180g，Na2HPO4.12H2029g, KH2P042g, KC12g，水 1000ml)。
[0043]實驗方法
[0044]經(jīng)過檢測的健康金魚，在實驗室內(nèi)暫養(yǎng)15天，無其他疾病，開始實驗。具體方法:
[0045](I)取一條金魚在醫(yī)用酒精中浸泡5min，無菌條件下，取金魚的腎臟，放于濃度為1000u/ml的青霉素-鏈霉素雙抗溶液中，放置15min ；
[0046](2)胰酶消化液消化lOmin,用解剖刀切割成小塊(約1mm)。加入培養(yǎng)基,重懸。離心lOOOrmp，IOmin0棄掉上清液，再次加入培養(yǎng)基,進(jìn)行重懸,離心,棄掉上清液,最后加入培
養(yǎng)基,重懸混勻。
[0047](3)鋪瓶，放入到25°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0048](4)待培養(yǎng)2天后觀察細(xì)胞貼壁情況，適當(dāng)加入培養(yǎng)基(保證培養(yǎng)基的pH)。待細(xì)胞鋪板到1/3的時候(約7天)，更換新鮮的培養(yǎng)基一次。
[0049](5)待細(xì)胞鋪滿 板子(約15天)，用胰酶消化液進(jìn)行初步消化后，加入新的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；
[0050](6)傳代3次后，凍存，復(fù)蘇后能夠繼續(xù)穩(wěn)定增殖生長，該細(xì)胞系命名為GK;
[0051](7)每隔7天傳代I次。
[0052]實驗結(jié)果:
[0053]圖1為相差顯微鏡下的金魚腎臟細(xì)胞系的形態(tài)；圖2是金魚腎臟細(xì)胞系懸浮特性分析，結(jié)果表明細(xì)胞均一性比較好，集中在直徑12-18微米。
[0054]實施例2金魚腎臟細(xì)胞系的傳代培養(yǎng)和凍存保種
[0055]試劑
[0056]胰酶消化液:磷酸氫二鈉2.3g，磷酸二氫鉀0.1g,氯化鈉8.0g,氯化鉀0.2g,EDTA0.2g，胰酶 0.6g，水 1000ml0
[0057]凍存液:含10 % DMS0、25 %的特級胎牛血清的M199培養(yǎng)基。
[0058]實驗方法
[0059]待細(xì)胞生長至90 %時，棄掉舊的培養(yǎng)基，加入2.5ml胰酶消化液進(jìn)行消化；
[0060]待細(xì)胞呈現(xiàn)“白霧”狀的時候，加入2ml的凍存液，以終止胰酶的作用，輕輕幌動，使細(xì)胞混勻，計數(shù)。
[0061]收集細(xì)胞到凍存管中，于凍存管上注明細(xì)胞的名稱、細(xì)胞數(shù)和凍存日期。
[0062]一個月后，按照常規(guī)細(xì)胞復(fù)蘇的方法，進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇，細(xì)胞增殖能力仍然很強(qiáng)，狀態(tài)良好。
[0063]獲得的金魚腎臟細(xì)胞系(GK)已于2013年12月4日保存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，并證明存活，其保藏登記編號為CGMCC N0.8557。
[0064]實施例3金魚腎臟細(xì)胞系的最適條件確定
[0065]一、試劑
[0066]胰酶消化液:磷酸氫二鈉2.3g，磷酸二氫鉀0.1g,氯化鈉8.0g,氯化鉀0.2g,EDTA0.2g,胰酶 0.6g,水 1000ml。[0067]培養(yǎng)基:不同濃度的特級胎牛血清的M199培養(yǎng)基。
[0068]二、實驗方法
[0069]1、最適血清的確定
[0070]分別配制特級胎牛血清濃度為10%、15%、20%的培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞密度為
2.SXlO5mL'三種血清濃度培養(yǎng)基各按ImL/孔的量接種于24孔板，于25 °C，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2d從每個實驗組里取出3孔細(xì)胞，消化收集細(xì)胞并計數(shù)，共培養(yǎng)12d，連續(xù)計數(shù)6次，繪制其生長曲線。
[0071]2、最適溫度的確定
[0072]選擇15°C、20°C、25°C、30°C四個不同培養(yǎng)溫度，使用添加10%特級胎牛血清的M199培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞密度為2.8 X IO5IiiL-1,細(xì)胞懸液按ImL/孔的量接種于24孔板并置于四個不同培養(yǎng)溫度培養(yǎng)箱里。每2d從每個實驗組里取出3孔細(xì)胞，收集細(xì)胞并計數(shù)，共培養(yǎng)12d，連續(xù)計數(shù)6次，繪制其生長曲線。
[0073]三、實驗結(jié)果
[0074]最適血清的確定(圖3)，金魚腎臟細(xì)胞系在特級胎牛血清10%的M199培養(yǎng)基中，增長繁殖最好。
[0075]最適溫度的確定(圖4)，金魚腎臟細(xì)胞系在25°C生長，繁殖最好。
[0076]實施例4金魚腎臟細(xì)胞系的生長曲線
[0077]一、試劑
[0078]胰酶消化液:磷酸氫二鈉2.3g，磷酸二氫鉀0.1g,氯化鈉8.0g,氯化鉀0.2g,EDTA0.2g，胰酶 0.6g，水 1000ml0
[0079]培養(yǎng)基:10%的特級胎牛血清(FBS)的M199培養(yǎng)基。
[0080]二、實驗方法
[0081]取對數(shù)生長期的細(xì)胞，收集計數(shù)細(xì)胞，使用含10%FBS的M199培養(yǎng)，調(diào)整細(xì)胞濃度為8.38X IOW1,按ImL/孔的量接種至24孔板中，置培養(yǎng)箱中25°C培養(yǎng)。每天取3個孔細(xì)胞，胰酶消化消化制成細(xì)胞懸液，混勻后用細(xì)胞計數(shù)儀進(jìn)行計數(shù)，實驗重復(fù)3次，連續(xù)進(jìn)行9d，以培養(yǎng)時間(d)為橫坐標(biāo)，細(xì)胞濃度(細(xì)胞/mL)為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線；根據(jù)公式T=tXlg2/lg(Nt/N0)計算細(xì)胞的群體倍增時間，其中，N0為接種細(xì)胞數(shù)，Nt為時間t后的細(xì)胞數(shù)。
[0082]三、實驗結(jié)果
[0083]金魚腎臟細(xì)胞系在傳代24h內(nèi)為遲緩期，對數(shù)生長期在第24_120h，當(dāng)120h時進(jìn)入到平穩(wěn)期(圖5)
[0084]實施例5金魚腎臟細(xì)胞系的初步應(yīng)用
[0085]一、試劑
[0086] 胰酶消化液:磷酸氫二鈉2.3g，磷酸二氫鉀0.1g,氯化鈉8.0g,氯化鉀0.2g,EDTA0.2g，胰酶 0.6g，水 1000ml0
[0087]培養(yǎng)基:10%的特級胎牛血清(FBS)的M199培養(yǎng)基。
[0088]發(fā)病魚的組織樣品是由本實驗室人員去異育銀鯽的養(yǎng)殖場獲得的。
[0089]二、實驗方法
[0090](I)發(fā)病魚的組織樣品的病原檢測，根據(jù)典型癥狀初步判斷為有金魚造血器官壞死病毒引起的，對于典型癥狀的病魚組織進(jìn)行PCR方法確診。具體步驟如下:
[0091]設(shè)計引物:
[0092]F2:5 ‘-CCC-AGC-AAC-ATG-TGC-GAC-GG-3’
[0093]R2:5， -CCG-TAR-TGA-GAG-TTG-GCG-CA-3’
[0094]擴(kuò)增362bp片段，
[0095]反應(yīng)條件:95°C,3min；95°C,30s ；55°C,30s ；72°C, Imin ；72°C, IOmin ;反應(yīng) 35 個循環(huán)。
[0096](2)PCR檢測陽性的組織接種于金魚腎臟細(xì)胞系(GK):對金魚腎臟細(xì)胞系用胰酶消化液進(jìn)行消化，含有10%的特級胎牛血清(FBS)的M199培養(yǎng)基重懸，滴入96空板中，25°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞增殖在24h內(nèi)接入已稀釋好的陽性病魚組織，置于20°C培養(yǎng)箱中，每天觀察變化。
[0097]三、實驗結(jié)果
[0098](I) PCR檢測電泳結(jié)果:在病魚的脾臟、腎臟、腦、鰓和肝臟中明顯檢測出陽性，結(jié)果表明病魚組織中確實含有金魚造血器官壞死病毒。
[0099](2)病魚組織接入金魚腎臟細(xì)胞系中，經(jīng)過7天觀察出現(xiàn)了細(xì)胞病變(CPE)，圖7。目前針對金魚造血器官壞死病毒缺乏敏感細(xì)胞系，本次試驗結(jié)果說明金魚腎臟細(xì)胞系能夠增殖病毒金魚造血器官壞死病毒，為其的研究提供了有力的材料。 [0100]顯然，本發(fā)明的上述實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對本發(fā)明的實施方式的限定，對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動，這里無法對所有的實施方式予以窮舉，凡是屬于本發(fā)明的技術(shù)方案所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之列。
【權(quán)利要求】
1.一種金魚腎臟細(xì)胞系GK，其保藏號為CGMCC N0.8557。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金魚腎臟細(xì)胞系GK，其特征在于，所述細(xì)胞系具有以下生物學(xué)特性: (1)細(xì)胞呈現(xiàn)典型的上皮細(xì)胞形態(tài)，連續(xù)傳代培養(yǎng)50代仍保持該形態(tài)特點(diǎn)； (2)細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力，連續(xù)培養(yǎng)50代仍保持該增殖和生長特性。
3.—種權(quán)利要求1所述的金魚腎臟細(xì)胞系GK的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟: (1)取金魚一條，用醫(yī)用酒精浸泡l_2min，于無菌條件下剪取金魚的腎臟，放于濃度為1000u/ml的青霉素-鏈霉素雙抗溶液中； (2)胰酶消化液消化lOmin，然后剪成小塊，用培養(yǎng)基重懸，離心，棄掉上清液，再用培養(yǎng)基進(jìn)行重懸，離心，棄掉上清，最后加入培養(yǎng)基，重懸混勻； (3)將步驟(2)制備的重懸混勻液加入到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，25°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； (4)待細(xì)胞鋪板到1/3的時候，更換新鮮的培養(yǎng)基一次； (5)待細(xì)胞鋪滿板子，用胰酶消化液進(jìn)行初步消化后，加入新的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)； (6)傳代3次后，凍存，復(fù)蘇后能夠繼續(xù)穩(wěn)定增殖生長，該細(xì)胞系命名為GK。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基為含有濃度為lOOu/ml青霉素-鏈霉素雙抗溶液和10 %特級胎牛血清的M199培養(yǎng)基。`
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述胰酶消化液的配制:磷酸氫二鈉2.3g，磷酸二氫鉀 0.1g,氯化鈉 8.0g,氯化鉀 0.2g，EDTA0.2g，胰酶 0.6g，水 1000ml。
6.權(quán)利要求1所述的金魚腎臟細(xì)胞系GK作為研究水產(chǎn)動物病毒宿主細(xì)胞的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1所述的金魚腎臟細(xì)胞系GK在水產(chǎn)動物病毒分離中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N5/10GK103695366SQ201310713551
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月20日
【發(fā)明者】高隆英, 景宏麗, 李維, 張旻, 王娜, 張利峰, 林祥梅, 吳紹強(qiáng), 江育林 申請人:中國檢驗檢疫科學(xué)研究院, 中華人民共和國蛇口出入境檢驗檢疫局