一株可以還原制備納米銀的解淀粉芽孢桿菌的制作方法
【專利摘要】一株可以還原制備納米銀的解淀粉芽孢桿菌，它涉及一株解淀粉芽孢桿菌。一株可以還原制備納米銀的解淀粉芽孢桿菌，它為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus?amyloli?quefaciens）zxw01，已在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)為CGMCC?No.8464，保藏日期為2013年11月11日，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰路1號(hào)院3號(hào)。本發(fā)明一株可以還原制備納米銀的解淀粉芽孢桿菌，它在含有硝酸銀的LB培養(yǎng)基生長培養(yǎng)中胞外合成納米銀，能夠通過連續(xù)添加含有硝酸銀的培養(yǎng)基來連續(xù)合成納米銀，為連續(xù)生產(chǎn)納米銀提供菌源，實(shí)現(xiàn)了利用發(fā)酵原理連續(xù)大量合成納米銀。
【專利說明】一株可以還原制備納米銀的解淀粉芽孢桿菌
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一株解淀粉芽孢桿菌。
【背景技術(shù)】
[0002]納米銀因呈現(xiàn)出不同于普通材料的光、電、磁、熱力學(xué)和化學(xué)反應(yīng)等方面的奇異性能，被廣泛應(yīng)用在化工、醫(yī)藥、抗菌、冶金、航空、航天、電子等領(lǐng)域。納米銀主要由化學(xué)方法合成，不足之處在于合成成本高、所需能耗大和易吸附有機(jī)溶劑等，這就限制了納米銀在醫(yī)藥方面的應(yīng)用。因此，納米銀生物合成法因其成本低廉、條件溫和和環(huán)境友好等優(yōu)勢(shì)引起了人們廣泛的關(guān)注。
[0003]近年來，細(xì)菌、放線菌、真菌和植物提取物等都被用來用來合成納米銀，細(xì)菌因便于基因操作，可以使用 基因工程技術(shù)使特定的還原酶活其穩(wěn)定作用的蛋白過量表達(dá)，，在制備納米銀方面有很大的優(yōu)勢(shì)。目前，細(xì)菌還原制備納米銀多采用細(xì)菌的培養(yǎng)上清液和菌體浸泡液，都屬于胞外液間歇式生產(chǎn)納米銀的過程，限制了納米銀的產(chǎn)量。因此，尋找能在生長培養(yǎng)過程中胞外合成納米銀的細(xì)菌菌株并應(yīng)用于連續(xù)生產(chǎn)納米銀是提高納米銀產(chǎn)量的關(guān)鍵問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明目的是提供一株可以還原制備納米銀的解淀粉芽孢桿菌，為連續(xù)生產(chǎn)納米銀提供菌源。
[0005]一株可以還原制備納米銀的解淀粉芽孢桿菌，它為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloli quefaciens) zxwOl,屬于芽孢桿菌屬(Bacillus),已在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)為CGMCC N0.8464，保藏日期為2013年11月11日，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰路I號(hào)院3號(hào)。
[0006]解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloli quefaciens) zxwOl,菌株的形態(tài)特征:它為桿菌，長1.5~1.8 μ m,寬0.3~0.4 μ m,有中生芽孢,無鞭毛,無莢膜,生長菌落為圓形,表面粗糙不透明，邊緣不整齊。
[0007]解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloli quefaciens) zxwOl,菌株的生理生化特征:它為革蘭氏陽性菌，過氧化氫酶接觸實(shí)驗(yàn)陽性，酪素水解、淀粉水解、明膠水解、尿素水解陽性，葡萄糖、蔗糖、甘露糖、果糖實(shí)驗(yàn)均產(chǎn)酸，D-木糖、L-阿拉伯糖、蜜二糖、麥芽糖、山梨醇、肌醇、甘露醇、乳糖、鼠李糖實(shí)驗(yàn)不產(chǎn)酸，硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、伏普實(shí)驗(yàn)、檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)、馬尿酸實(shí)驗(yàn)陽性，苯丙氨酸實(shí)驗(yàn)陰性。
[0008]解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloli quefaciens)zxw01,菌株的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果:它的16srDNA序列在GenBank的注冊(cè)號(hào)是KF700242，利用BLAST搜索與所得到的序列相似性高的序列，該菌的序列與解淀粉芽孢桿菌dhs-28的相似性達(dá)到99%，通過MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，如圖3所示，結(jié)合其形態(tài)鑒定及生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定該菌是解淀粉芽孢桿菌；但是傳統(tǒng)的解淀粉芽孢桿菌可以利用麥芽糖和L-阿拉伯糖產(chǎn)酸，而該菌株不可以利用這兩種糖，說明該菌株是解淀粉芽孢桿菌的一個(gè)新種。
[0009]本發(fā)明一株可以還原制備納米銀的解淀粉芽孢桿菌，它為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloli quefaciens) zxwOl,屬于芽抱桿菌屬(Bacillus),已在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)為CGMCC N0.8464，保藏日期為2013年11月11日，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰路I號(hào)院3號(hào)。
[0010]本發(fā)明一株可以還原制備納米銀的解淀粉芽孢桿菌，它在含有硝酸銀的LB培養(yǎng)基生長培養(yǎng)中胞外合成納米銀，能夠通過連續(xù)添加含有硝酸銀的培養(yǎng)基來連續(xù)合成納米銀，為連續(xù)生產(chǎn)納米銀提供菌源，實(shí)現(xiàn)了利用發(fā)酵原理連續(xù)大量合成納米銀。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1為【具體實(shí)施方式】一中解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloli quefaciens)zxw01的透射電鏡圖；
[0012]圖2為【具體實(shí)施方式】一中解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloli quefaciens)zxw01的PCR的擴(kuò)增電泳圖；
[0013]圖3為【具體實(shí)施方式】一中解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloli quefaciens)zxw01的系統(tǒng)進(jìn)化樹圖；
[0014]圖4為【具體實(shí)施方式】一中解淀粉芽抱桿菌(Bacillus amyloli quefaciens)zxw01合成納米銀的電鏡圖。
【具體實(shí)施方式】
[0015]【具體實(shí)施方式】一:本實(shí)施方式一株可以還原制備納米銀的解淀粉芽孢桿菌，它為解淀粉芽抱桿菌(Bacillus amyloli quefaciens) zxwOl,屬于芽抱桿菌屬(Bacillus),已在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微`生物中心保藏，保藏編號(hào)為CGMCC N0.8464，保藏日期為2013年11月11日，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰路I號(hào)院3號(hào)。
[0016]本實(shí)施方式中一株可以還原制備納米銀的解淀粉芽孢桿菌，它使用常規(guī)的篩選方法獲得，過程如下:
[0017]稱量IOg取自東北林業(yè)大學(xué)林場的土壤，于90ml蒸餾水中制成懸浮液，取2ml懸浮液接種于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)20h，加入0.5mmol/L的AgNO3避光培養(yǎng)3天，取2ml該培養(yǎng)液接種于含有1.0mmoI/L AgNO3的改良LB培養(yǎng)基中避光培養(yǎng)3天，取2ml該培養(yǎng)液接種于含有1.5mmol/L AgNO3的改良LB培養(yǎng)基中避光培養(yǎng)3天，依據(jù)此方法，將AgNO3的濃度提高到5mmol/L ;將含有5mmol/L AgNO3的培養(yǎng)液涂布于LB固體培養(yǎng)基平板培養(yǎng)24h，將長出的單菌落進(jìn)行劃線純化，即得到了能耐銀的細(xì)菌菌株。
[0018]改良的LB培養(yǎng)基成分:酵母提取物5g，蛋白胨10g，溶于IL水中，pH7.0~7.2。
[0019]結(jié)果:所得到的菌，其菌體形態(tài)如圖1所示，它為桿菌，長1.5~1.8 μ m，寬0.3~
0.4 μ m，有中生芽孢，無鞭毛，無莢膜。
[0020]參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第八版和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》，對(duì)篩選到的菌進(jìn)行生理生化特征測定:它為革蘭氏陽性菌，過氧化氫酶接觸實(shí)驗(yàn)陽性，酪素水解、淀粉水解、明膠水解、尿素水解陽性，葡萄糖、蔗糖、甘露糖、果糖實(shí)驗(yàn)均產(chǎn)酸，D-木糖、L-阿拉伯糖、蜜二糖、麥芽糖、山梨醇、肌醇、甘露醇、乳糖、鼠李糖實(shí)驗(yàn)不產(chǎn)酸，硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、伏普實(shí)驗(yàn)、檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)、馬尿酸實(shí)驗(yàn)陽性，苯丙氨酸實(shí)驗(yàn)陰性。
[0021]對(duì)篩選到的菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定:用購買自北京莊盟生物公司的細(xì)菌基因組提取試劑盒提取該菌的基因組DNA，用細(xì)菌通用引物27F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTGAG-3’和1492R:5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’對(duì)細(xì)菌的 16srDNA 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增；PCR 擴(kuò)增體系:5yL模板 DNA，5 μ LlOXBuffer (含 15mmol/LMgCl2)，I μ L10mmol/L dNTP, 10 μ L2.5mmol/L 的引物 27F, 10μ L2.5mmol/L 的 1492R，0.5 μ L5U/L 聚合酶，18.5 μ L 去離子水；PCR 擴(kuò)增條件:94°C 預(yù)變性 5min，94°C 變性 30s，52°C 退火 30s，72°C 延伸 3min，循環(huán) 30 次，72°C 延伸 IOmin ；得到目的片段，電泳后膠回收PCR產(chǎn)物，將產(chǎn)物連接到T載體后轉(zhuǎn)入E.coli DH5 α，得到帶有細(xì)菌16srDNA的轉(zhuǎn)化子，將轉(zhuǎn)化子大腸桿菌送上海生工生物公司進(jìn)行測序。電泳圖譜如圖2所示，目的片段16srDNA在1600bp左右；然后利用拼接軟件將測序結(jié)果進(jìn)行拼接，得到該細(xì)菌16srDNA的序列，序列長度為1514bp。[0022]鑒定結(jié)果:它的16srDNA序列在GenBank的注冊(cè)號(hào)是KF700242，利用BLAST搜索與所得到的序列相似性高的序列，該菌的序列與解淀粉芽孢桿菌dhs-28的相似性達(dá)到99%，通過MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，如圖3所示，結(jié)合其形態(tài)鑒定及生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定該菌是解淀粉芽孢桿菌；但是傳統(tǒng)的解淀粉芽孢桿菌可以利用麥芽糖和L-阿拉伯糖產(chǎn)酸，而該菌株不可以利用這兩種糖，說明該菌株是解淀粉芽孢桿菌的一個(gè)新種，它為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloli quefaciens) zxwOl。
[0023]解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloli quefaciens)zxw01,取I接菌環(huán)接種在含有200ml LB培養(yǎng)基的錐形瓶里，在37°C，120r/min的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20_24h，獲得培養(yǎng)液；將2ml培養(yǎng)液接種到含有200ml LB培養(yǎng)基的錐形瓶里，在37°C，150rpm的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期，然后加入IOmllOmM AgNO3溶液避光培養(yǎng)20天，在4000rpm的條件下將培養(yǎng)液離心收集菌體沉淀，再利用TECNAIG2儀器(荷蘭)在60kV下進(jìn)行成像；結(jié)果如圖4所示，該細(xì)菌胞外合成了納米銀，近似球行，小部分有團(tuán)聚現(xiàn)象，可見本實(shí)施方式篩選出的菌，是一株可以還原制備納米銀的解淀粉芽孢桿菌。
[0024]將解淀粉芽抱桿菌(Bacillusamyloli quefaciens) zxwOl,取 2 環(huán)接種于 100mlLB培養(yǎng)基中，于37°C，150rpm恒溫培養(yǎng)20h，使培養(yǎng)液的0D_達(dá)到1.5，制成搖瓶種子，按
0.5:1的接種量將搖瓶種子中的培養(yǎng)液接種到含有5L改良LB培養(yǎng)基的種子罐中培養(yǎng)12h，攪拌轉(zhuǎn)速為340r/min，然后按5%的接種量，利用注射器在含有10L含有2.5mmol/L改良LB培養(yǎng)基的發(fā)酵罐的接種口橡皮膜上進(jìn)行注射接種，發(fā)酵5天，流出罐內(nèi)6L培養(yǎng)物收集納米銀，重新加入6L新鮮的含有2.5mmol/L改良LB培養(yǎng)基連續(xù)發(fā)酵5天，將罐內(nèi)6L培養(yǎng)物流出，重新加入6L新鮮的含有2.5mmol/L改良LB培養(yǎng)基連續(xù)發(fā)酵5天，這就實(shí)現(xiàn)了利用發(fā)酵原理連續(xù)大量合成納米銀。可見，本實(shí)施方式中解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) zxwOl為連續(xù)生產(chǎn)納米銀提供了新的菌源。
【權(quán)利要求】
1.一株可以還原制備納米銀的解淀粉芽孢桿菌，其特征在于它為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloli quefaciens) zxwOl,屬于芽抱桿菌屬(Bacillus),已在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)為CGMCC N0.8464，保藏日期為2013年11月11日，保藏 地址為北京市朝陽區(qū)北辰路I號(hào)院3號(hào)。
【文檔編號(hào)】C12N1/20GK103627664SQ201310682200
【公開日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2013年12月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月13日
【發(fā)明者】張 杰, 王濱松, 張映, 王嬌, 熊文 申請(qǐng)人:東北林業(yè)大學(xué)