生物標(biāo)記的雙分子定點(diǎn)生物素化重組堿性磷酸酶的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種生物標(biāo)記的雙分子定點(diǎn)生物素化重組堿性磷酸酶，是在堿性磷酸酶的氨基端、羧基端分別以生物方式各連接一個(gè)生物素分子構(gòu)建而成，該重組生物素標(biāo)記酶一經(jīng)產(chǎn)生即為雙分子生物素定點(diǎn)標(biāo)記的重組堿性磷酸酶，其酶學(xué)活性不受標(biāo)記因素影響。構(gòu)建方法為：首先，構(gòu)建具有兩個(gè)可生物素化序列及蛋白質(zhì)連接柔性Linker的中間載體，然后利用PCR技術(shù)將堿性磷酸酶基因克隆至兩個(gè)可生物素化序列的中間，細(xì)菌表達(dá)體系表達(dá)獲得重組堿性磷酸酶。本發(fā)明的重組堿性磷酸酶，在BAS體系的酶免疫分析中可與鏈霉親和素或親和素形成網(wǎng)狀的放大結(jié)構(gòu)，可有效提高BAS酶免疫分析的靈敏度與特異性，以及可減少標(biāo)記酶的用量，降低檢測(cè)成本。
【專利說明】生物標(biāo)記的雙分子定點(diǎn)生物素化重組堿性磷酸酶
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種生物標(biāo)記的雙分子定點(diǎn)生物素化重組堿性磷酸酶，及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，屬于基因工程和免疫學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]生物素-親和素系統(tǒng)(biotin-avidin system，BAS)是以生物素和親和素具有的獨(dú)特結(jié)合特性為基礎(chǔ)，結(jié)合二者即可偶聯(lián)抗原抗體等大分子生物活性物質(zhì)，它們的結(jié)合迅速、專一、穩(wěn)定，并具有多級(jí)放大效應(yīng)。目前，BAS技術(shù)已在整個(gè)生物學(xué)領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用，成為當(dāng)今生物醫(yī)學(xué)研究工作中最具使用價(jià)值和發(fā)展前途的技術(shù)之一。
[0003]堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase, AP)是酶免疫測(cè)定中較為常用的免疫標(biāo)記用酶。在ELISA中應(yīng)用，盡管AP系統(tǒng)的敏感性一般高于應(yīng)用HRP系統(tǒng)，空白值也較低。但由于AP較難得到高純度制劑，穩(wěn)定性較HRP低，價(jià)格較HRP高，制備酶結(jié)合物時(shí)得率較HRP低等原因，因此國(guó)內(nèi)在ELISA中一般均采用HRP。 [0004]生物素化酶(生物素-酶偶聯(lián)物)BAS體系應(yīng)用與酶免疫分析的關(guān)鍵構(gòu)件，當(dāng)前生物素化酶的主要制備方式是以化學(xué)共價(jià)偶聯(lián)標(biāo)記為主，該技術(shù)是利用酶分子內(nèi)-nh2、-CHO或-SH等活性位點(diǎn)通過化學(xué)法與活化生物素共價(jià)偶聯(lián)得到生物素化酶，文獻(xiàn)報(bào)到多種化學(xué)標(biāo)記方式，但實(shí)際上不同之處僅在于標(biāo)記物被轉(zhuǎn)換為反應(yīng)性衍生物的方式不同。盡管一個(gè)酶分子可被多個(gè)生物素標(biāo)記是BAS體系應(yīng)用與酶免疫分析的應(yīng)用基礎(chǔ)，但是生物素與酶分子內(nèi)的活性基團(tuán)是一種隨機(jī)結(jié)合方式，當(dāng)反應(yīng)基團(tuán)的氨基酸殘基位于酶活性位點(diǎn)或附近時(shí)勢(shì)必影響酶活性，導(dǎo)致生物素化酶的酶學(xué)活性不均一，從而影響免疫分析的特異性、穩(wěn)定性與靈敏度。
[0005]有研究報(bào)道化學(xué)標(biāo)記方式獲得的生物素化堿性磷酸酶，標(biāo)記后其酶學(xué)活性降低30 ~60% (Porstmann T, Kiessig ST.Enzyme immunoassay techniques.An overview.JImmunol Methods.1992，150(1-2):5-21.)，盡管殘余活性仍能發(fā)揮其酶學(xué)催化作用，但需要增加反應(yīng)體系中的酶分子數(shù)以彌補(bǔ)標(biāo)記后酶學(xué)活性降低所帶來的后果。因此，構(gòu)建一種標(biāo)記后酶學(xué)活性不降低的生物素化堿性磷酸酶是亟需解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了一種菌體內(nèi)生物標(biāo)記的雙分子定點(diǎn)生物素化重組堿性磷酸酶，該生物素化重組堿性磷酸酶是由大腸桿菌系統(tǒng)集表達(dá)與生物素化一體化、大腸桿菌體內(nèi)完成的兩分子生物素定點(diǎn)定量連接的重組堿性磷酸酶，該生物素化重組堿性磷酸酶一經(jīng)產(chǎn)生，無需體外與生物素化學(xué)根據(jù)偶聯(lián)即可用于生物素-親和素系統(tǒng)的酶免疫分析。本發(fā)明利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)免疫測(cè)定標(biāo)記用酶，可改變從生物體分離提純的生產(chǎn)方式，也是得到符合標(biāo)記要求高純度酶的一條新途徑，而將標(biāo)記酶直接與抗體融合表達(dá)的方式制備，可克服化學(xué)交聯(lián)劑偶聯(lián)方法的弊端。
[0007]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:[0008]—種生物標(biāo)記的雙分子定點(diǎn)生物素化重組堿性磷酸酶，是在堿性磷酸酶的氨基端、羧基端分別以生物方式各連接一個(gè)生物素分子構(gòu)建而成，該重組生物素標(biāo)記酶一經(jīng)產(chǎn)生即為雙分子生物素定點(diǎn)標(biāo)記的重組堿性磷酸酶，其酶學(xué)活性不受標(biāo)記因素影響。
[0009]所述生物標(biāo)記的雙分子定點(diǎn)生物素化重組堿性磷酸酶的構(gòu)建方法如下:首先，構(gòu)建具有兩個(gè)可生物素化序列及蛋白質(zhì)連接柔性Linker的中間載體pUCAv1-linker-Avi,然后利用PCR技術(shù)將堿性磷酸酶(AP)基因克隆至兩個(gè)可生物素化序列的中間，大腸桿菌表達(dá)并依菌體內(nèi)BirA酶同步催化獲得N端、C端分別生物素化的重組堿性磷酸酶:Biotin-AP-Biotin0通過該方法得到的重組酶無需體外再次生物素標(biāo)記即可用于BAS體系的酶免疫分析，可有效提高BAS酶免疫分析的靈敏度與特異性，因沒有經(jīng)過化學(xué)標(biāo)記，該重組酶充分保持了堿性磷酸酶的酶學(xué)活性，可減少標(biāo)記酶的用量，降低檢測(cè)成本。
[0010]所述生物標(biāo)記的雙分子定點(diǎn)生物素化重組堿性磷酸酶的制備方法如下:
[0011](I)根據(jù)(Gly4-Ser)3及Avi基因序列,化學(xué)合成Avi—(Gly4-Ser)3一克隆位點(diǎn)一(Gly4-Ser)3-Avi的基因片段，重組至pUC18載體，獲得中間質(zhì)粒載體(這個(gè)過程是常規(guī)技術(shù)手段就可以實(shí)現(xiàn)的，所提及的PUC18載體以及基因序列都是公知的)；
[0012](2)設(shè)計(jì)引物以PCR方式獲得大腸桿菌堿性磷酸酶基因，重組至步驟(1)的中間載體，獲得原核表達(dá)載體；
[0013](3)原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21，獲得基因工程菌；
[0014](4)培養(yǎng)基因工程菌，培養(yǎng)基中加入50 μ M生物素，依菌體內(nèi)BirA酶同步催化，在所表達(dá)目的蛋白的Avi序列賴氨酸位點(diǎn)結(jié)合生物素；
[0015](5)純化目的蛋白，獲得兩分子生物素定量連接的重組堿性磷酸酶。
[0016]進(jìn)一步地，具體制備方法如下:
[0017](I)根據(jù)(Gly4-Ser)3及Avi基因序列,化學(xué)合成Avi—(Gly4-Ser)3一克隆位點(diǎn)一(Gly4-Ser)3-Avi的基因片段，重組至pUC18載體的EcoR 1.Hind III位點(diǎn)，獲得中間質(zhì)粒載體；
[0018](2)表達(dá)載體及基因工程菌的構(gòu)建:
[0019]①設(shè)計(jì)引物以PCR方式獲得大腸桿菌堿性磷酸酶基因(以pDAP2質(zhì)粒為模板，通過引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得，Genbank登陸號(hào):U35316)，然后將大腸桿菌堿性磷酸酶基因重組至步驟(1)的中間載體的Sac 1、PstI位點(diǎn)，獲得原核表達(dá)載體；所述引物的序列為:
[0020]primerl:5/ -GCTAGAGCTCACCAGAAATGCCTGTTCT-3'；
[0021]primer2:5/ -GCTACTGCAGTTAATGGTGATGGTGATGGT-3';如 SEQ ID N0.1、2 所示；
[0022]②表達(dá)載體CaCl2轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21，氨芐LB抗性平板(即培養(yǎng)基中除常規(guī)LB培養(yǎng)基的成分外，還含氨芐ΙΟΟμ g/mL)篩選陽(yáng)性克隆，獲得基因工程菌；
[0023](3)基因工程菌的培養(yǎng)及體內(nèi)生物素化:
[0024]①挑取單克隆菌落接種于5mL液體LB培養(yǎng)基(培養(yǎng)基中除常規(guī)LB培養(yǎng)基的成分外，還含氨芐ΙΟΟμ g/mL)，37°C過夜(10~14h)培養(yǎng)、活化；
[0025]②活化菌液按照2% (v/v)的接種量轉(zhuǎn)接于新鮮的50mL液體LB培養(yǎng)基(培養(yǎng)基中除常規(guī)1^培養(yǎng)基的成分外，還含氨芐10(^8/1^)，371:培養(yǎng)至00600為0.3時(shí)，向培養(yǎng)基中加入終濃度為50 μ M的生物素，繼續(xù)培養(yǎng)16h，依大腸桿菌菌體內(nèi)BirA酶同步催化所表達(dá)的目的蛋白在Avi序列賴氨酸位點(diǎn)結(jié)合生物素；[0026](4)融合蛋白的提取:
[0027]①經(jīng)上述培養(yǎng)的基因工程菌4°C，1000rpm離心lOmin，收集菌體；
[0028]②菌體以5mL0.1M的Tris緩沖液重懸，置入_80°C液氮中l(wèi)Omin，再迅速置入37°C的恒溫水浴中15min，如此反復(fù)凍融3次；
[0029]③上述反復(fù)凍融的菌液4°C，1200rpm離心lOmin，上清轉(zhuǎn)入一新離心管中；
[0030](5)目的融合蛋白的純化:
[0031]①清洗柱子:用2柱體積的Buffer W清洗Strep-Tactin柱；
[0032]②樣品上柱:取步驟(4)凍融的菌液上清5mL流通上柱結(jié)合目的蛋白；
[0033]③沖洗柱子:用5柱體積的Buffer W洗柱，并收集每部分的洗脫液；
[0034]④目的蛋白的洗脫:以Buffer E洗脫目的蛋白，收集每一部分并各取20 μ ISDS-PAGE 鑒定；
[0035]⑤目的蛋白的脫鹽與濃縮:使用Millipore超濾器,4°C, 4000rpm,離心30min濃縮，將濃縮液以0.01M TBS稀釋至合適體積，既得生物素化重組堿性磷酸酶。
[0036]所述Buffer W(washing buffer)的配方組成為:IOOmM Tris.Cl, 150mM NaCl,ImM EDTA，余量為水，pH8。
[0037]所述Buffer E (elution buffer)的配方組成為:IOOmM Tris.Cl, 150mM NaCl,ImM EDTA, 2.5mM desthiobi otin,余量為水，pH8。
[0038]由【背景技術(shù)】可知，目前現(xiàn)有技術(shù)中，生物素化堿性磷酸酶的主要制備方式是以化學(xué)共價(jià)偶聯(lián)標(biāo)記為主，該技術(shù)是利用酶分子內(nèi)-NH2、-CHO或-SH等活性位點(diǎn)通過化學(xué)法與活化生物素共價(jià)偶聯(lián)得到生物素化堿性磷酸酶(如圖2所示)，化學(xué)共價(jià)偶聯(lián)標(biāo)記中一個(gè)酶分子可被3~5個(gè)生物素標(biāo)記，這也是BAS體系應(yīng)用與酶免疫分析的應(yīng)用基礎(chǔ)，但是生物素與酶分子內(nèi)的活性基團(tuán)是一種隨機(jī)結(jié)合方式，所得產(chǎn)物從化學(xué)結(jié)構(gòu)上講是一種混合物，而且當(dāng)反應(yīng)基團(tuán)的氨基酸殘基位于酶活性位點(diǎn)或附近時(shí)勢(shì)必影響酶活性。而本發(fā)明的生物素化堿性磷酸酶是以基因工程方式實(shí)現(xiàn)的生物方式標(biāo)記，所提供的菌體內(nèi)生物方式標(biāo)記的生物素化重組堿性磷酸酶，是一種位點(diǎn)專一性、雙分子定量生物素化重組堿性磷酸酶，是在堿性磷酸酶的氨基端、羧基端分別以生物方式各連接一個(gè)生物素分子(如圖1所示);該重組生物素標(biāo)記酶一經(jīng)產(chǎn)生即為雙分子生物素定點(diǎn)標(biāo)記重組堿性磷酸酶，其酶學(xué)活性不受標(biāo)記因素影響；并且是一個(gè)酶分子被兩分子生物素定點(diǎn)標(biāo)記，在BAS體系的酶免疫分析中可與鏈霉親和素或親和素形成網(wǎng)狀的放大結(jié)構(gòu)，因沒有經(jīng)過化學(xué)標(biāo)記該重組酶充分保持了堿性磷酸酶的酶學(xué)活性，可有效提高BAS酶免疫分析的靈敏度與特異性，以及可減少標(biāo)記酶的用量，降低檢測(cè)成本。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0039]圖1:本發(fā)明的雙分子生物素定點(diǎn)標(biāo)記重組堿性磷酸酶結(jié)構(gòu)示意圖。
[0040]圖2:化學(xué)共價(jià)偶聯(lián)的生物素化堿性磷酸酶結(jié)構(gòu)示意圖。
[0041]圖3:雙分子生物素定點(diǎn)標(biāo)記堿性磷酸酶的表達(dá)與純化電泳圖，其中，I為對(duì)照菌，2為表達(dá)菌株，M為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，3,4,5,6,7為洗脫的目的蛋白。
[0042]圖4:雙分子生物素定點(diǎn)標(biāo)記堿性磷酸酶的BAS系統(tǒng)應(yīng)用示意圖。
[0043]圖5:化學(xué)共價(jià)偶聯(lián)的生物素化堿性磷酸酶的BAS系統(tǒng)應(yīng)用示意圖。[0044]圖6:雙分子生物素定點(diǎn)標(biāo)記堿性磷酸酶與化學(xué)共價(jià)偶聯(lián)的生物素化堿性磷酸酶的應(yīng)用效果，其中，a為雙分子生物素定點(diǎn)標(biāo)記堿性磷酸酶檢測(cè)，b為化學(xué)共價(jià)偶聯(lián)的生物素化堿性磷酸酶檢測(cè)。
【具體實(shí)施方式】[0045]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0046]若無特別說明，所涉及的試劑、試驗(yàn)方法均為常規(guī)法試劑、常規(guī)方法。
[0047]實(shí)施例1雙分子定點(diǎn)生物素化重組堿性磷酸酶表達(dá)載體的構(gòu)建
[0048]步驟如下:
[0049](I)根據(jù)(Gly4-Ser)3及Avi基因序列,化學(xué)合成Avi—(Gly4-Ser)3一克隆位點(diǎn)一(Gly4-Ser)3-Avi的基因片段，其基因序列為:
[0050]GAATTCGATGGGCGGAGGTGGATCTGGCGGAGGTGGATCGGGCGGAGGTGGATCAGGTCTGAACGATATCTTCGAAGCTCAGAAAATCGAATGGCACGAAGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCGGCGGAGGTGGATCTGGCGGAGGTGGATCGGGCGGAGGTGGATCAGGTCTGAACGATATCTTCGAAGCTCAGAAAATCGAATGGCACGAATAAAAGCTT ;如 SEQ ID N0.3 所示；
[0051]上述合成的DNA片段雙酶切重組至PUC18載體的EcoR 1、Hind III位點(diǎn)，獲得中間質(zhì)粒載體；
[0052](2)設(shè)計(jì)引物:
[0053]primerl:5' -GCTAGAGCTCACCAGAAATGCCTGTTCT-3'；
[0054]及primerfj' -GCTACTGCAGTTAATGGTGATGGTGATGGT-3';如 SEQ ID N0.1、2 所示；
[0055]以PDAP2質(zhì)粒為模板PCR方式獲得大腸桿菌堿性磷酸酶基因，雙酶切重組至上述中間載體的Sac 1、PstI位點(diǎn)(這兩個(gè)酶切位點(diǎn)，pUC18載體帶有，步驟I合成的序列中也帶有)，獲得原核表達(dá)載體。
[0056]實(shí)施例2雙分子定點(diǎn)生物素化重組堿性磷酸酶基因表達(dá)與純化
[0057]步驟如下:
[0058](I)原核表達(dá)載體(實(shí)施例1制備)CaCl2轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21，氨芐LB抗性平板篩選陽(yáng)性克隆，獲得基因工程菌；
[0059](2)挑取單克隆菌落接種于5mL液體LB培養(yǎng)基(含氨芐100 y g/mL)，37°C過夜(12h)培養(yǎng)、活化；
[0060](3)活化菌液按照2%的接種量轉(zhuǎn)接于新鮮的50mL液體LB培養(yǎng)基(含氨芐100 U g/mL), 37°C培養(yǎng)至0D600為0.3時(shí)，加入終濃度為50 y M的生物素，繼續(xù)培養(yǎng)16h，依大腸桿菌菌體內(nèi)BirA酶同步催化在所表達(dá)的目的蛋白Avi序列的賴氨酸位點(diǎn)結(jié)合生物素；
[0061](4)經(jīng)上述培養(yǎng)的基因工程菌4°C，1000rpm離心lOmin，收集菌體；菌體以5mL0.1M的Tris緩沖液重懸，置入_80°C液氮中l(wèi)Omin，再迅速置入37°C的恒溫水浴中15min，如此反復(fù)凍融3次；
[0062](5)上述反復(fù)凍融的菌液4°C，1200rpm離心lOmin，上清轉(zhuǎn)入一新離心管中；
[0063](6)Buffer W 清洗 Strep-Tactin 柱(:用 2 柱體積的 Buffer W 清洗 Strep-Tactin柱);凍融的菌液上清5mL流通上柱結(jié)合目的蛋白；用5柱體積的Buffer W洗柱，以BufferE洗脫目的蛋白，收集每部分的洗脫液洗脫目的蛋白，并SDS-PAGE鑒定，鑒定結(jié)果如圖3所示，通過圖3可以看到，得到了分子量為48kD的蛋白，與目的蛋白的理論分子量一致，可以確定，該條帶即為目的蛋白條帶；
[0064](7)目的蛋白的脫鹽與濃縮:使用Millipore超濾器,4°C,4000rpm,離心30min濃縮，得生物素化重組堿性磷酸酶；冷凍干燥，稱重，收集IL發(fā)酵液菌體得到60mg目的蛋白。
[0065]所述Buffer W(washing buffer)的配方組成為:IOOmM Tris ? Cl, 150mM NaCl,ImM EDTA，余量為水，pH8。
[0066]所述Buffer E (elution buffer)的配方組成為::100mM Tris ? Cl, 150mM NaCl,ImM EDTA, 2.5mM desthiobiotin,余量為水，pH8。
[0067]實(shí)施例3化學(xué)偶聯(lián)生物素化堿性磷酸酶的制備
[0068]本實(shí)施例中先大腸桿菌表達(dá)制備堿性磷酸酶，然后采用化學(xué)標(biāo)記法獲得生物素化的堿性磷酸酶。
[0069](I)原核表達(dá)載體pDAP2以CaCl2轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21，氨芐LB抗性平板篩選陽(yáng)性克隆，獲得含PDAP2質(zhì)粒的工程菌；
[0070](2)挑取單克隆菌落接種于5mL液體LB培養(yǎng)基(含氨芐100 y g/mL)，37°C過夜(12h)培養(yǎng)、活化；
[0071](3)活化菌液按照2%的接種量轉(zhuǎn)接于新鮮的50mL液體LB培養(yǎng)基(含氨芐100 u g/mL)，37°C培養(yǎng)至0D600為0.3時(shí)，加入終濃度為50 y M的生物素，繼續(xù)培養(yǎng)16h ；
[0072](4)經(jīng)上述培養(yǎng)的基因工程菌4°C，1000rpm離心lOmin，收集菌體；菌體以5mL0.1M的Tris緩沖液重懸，置入_80°C液氮中l(wèi)Omin，再迅速置入37°C的恒溫水浴中15min，如此反復(fù)凍融3次；
[0073](5)收集上清，并用0.22iim濾膜過濾，使用Millipore超濾器(截留分子量為IOkDa), 4°C，4000rpm,離心 30min 濃縮；
[0074](6)將IOmL N1-NTA倒入2.5 X IOcm柱中，用3個(gè)柱床體積的緩沖液A(50mM Tris,pH8.0 ；0.3M氯化鈉；10mM咪唑)在4°C進(jìn)行柱平衡；
[0075](7)將濃縮發(fā)酵液上樣，用6個(gè)柱床體積的緩沖液(50mM Tris,pH8.0 ；20mM咪唑；
0.3M氯化鈉)清洗；
[0076](8)用6個(gè)柱床體積的緩沖液(50mM Tris，pH8.0 ；250mM咪唑；0.3M氯化鈉)洗脫目的蛋白；
[0077](9)使用Millipore超濾器(截留分子量為IOkD), 4°C, 4000rpm,離心30min濃縮、
脫鹽，既得堿性磷酸酶；
[0078](10)以 Thermo Scientific EZ-Link 生物素標(biāo)記試劑盒(Sulfo-NHS-Biotin)按照說明書對(duì)步驟(9 )所得的堿性磷酸酶進(jìn)行化學(xué)標(biāo)記，得生物素化堿性磷酸酶。
[0079]實(shí)施例4堿性磷酸酶酶學(xué)活性的測(cè)定
[0080]堿性磷酸酶活性檢測(cè)原理:
[0081]
【權(quán)利要求】
1.一種生物標(biāo)記的雙分子定點(diǎn)生物素化重組堿性磷酸酶，其特征在于:是在堿性磷酸酶的氨基端、羧基端分別以生物方式各連接一個(gè)生物素分子構(gòu)建而成。
2.權(quán)利要求1所述的生物標(biāo)記的雙分子定點(diǎn)生物素化重組堿性磷酸酶的構(gòu)建方法，其特征在于:首先，構(gòu)建具有兩個(gè)可生物素化序列及蛋白質(zhì)連接柔性Linker的中間載體pUCAv1-linker-Avi，然后利用PCR技術(shù)將堿性磷酸酶基因克隆至兩個(gè)可生物素化序列的中間，細(xì)菌表達(dá)體系表達(dá)并依菌體內(nèi)BirA酶同步催化獲得N端、C端分別生物素化的重組喊性憐酸酶:Biotin-AP_Biotin。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生物標(biāo)記的雙分子定點(diǎn)生物素化重組堿性磷酸酶的構(gòu)建方法，其特征在于:包括以下步驟: (O根據(jù)(Gly4-Ser)3及Avi基因序列，化學(xué)合成Avi—(Gly4-Ser)3一克隆位點(diǎn)一(Gly4-Ser)3-Avi的基因片段，重組至pUC18載體，獲得中間質(zhì)粒載體； (2 )設(shè)計(jì)引物以PCR方式獲得大腸桿菌堿性磷酸酶基因，重組至步驟(1)的中間載體，獲得原核表達(dá)載體； (3)原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21，獲得基因工程菌； (4)培養(yǎng)基因工程菌，培養(yǎng)基中加入50μ M生物素，依菌體內(nèi)BirA酶同步催化，在所表達(dá)目的蛋白的Avi序列賴氨酸位點(diǎn)結(jié)合生物素； (5)純化目的蛋白，獲得兩分子生物素定量連接的重組堿性磷酸酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生物標(biāo)記的雙分子定點(diǎn)生物素化重組堿性磷酸酶的構(gòu)建方法，其特征在于:所述步驟(1)具體如下:根據(jù)(Gly4-Ser)3及Avi基因序列，化學(xué)合成Avi— (Gly4-Ser) 3一克隆位點(diǎn)一(Gly4-Ser) 3一Avi的基因片段,重組至pUC18載體的EcoR1、HindIII位點(diǎn)，獲得中間質(zhì)粒載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生物標(biāo)記的雙分子定點(diǎn)生物素化重組堿性磷酸酶的構(gòu)建方法，其特征在于:所述Avi— (Gly4-Ser) 3一克隆位點(diǎn)一(Gly4-Ser) 3一Avi的基因片段的序列為:
GAATTCGATGGGCGGAGGTGGATCTGGCGGAGGTGGATCGGGCGGAGGTGGATCAGGTCTGAACGATATCTTCGAAGCTCAGAAAATCGAATGGCACGAAGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCGGCGGAGGTGGATCTGGCGGAGGTGGATCGGGCGGAGGTGGATCAGGTCTGAACGATATCTTCGAAGCTCAGAAAATCGAATGGCACGAATAAAAGCTT ;如 SEQ ID N0.3 所示。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生物標(biāo)記的雙分子定點(diǎn)生物素化重組堿性磷酸酶的構(gòu)建方法，其特征在于:所述步驟(2)具體如下: ①設(shè)計(jì)引物以PCR方式獲得大腸桿菌堿性磷酸酶基因，然后將大腸桿菌堿性磷酸酶基因重組至步驟(1)的中間載體的Sac1、PstI位點(diǎn)，獲得原核表達(dá)載體；所述引物的序列為:
primerl:5/ -GCTAGAGCTCACCAGAAATGCCTGTTCT-3'；
primer2:5/ -GCTACTGCAGTTAATGGTGATGGTGATGGT-3';如 SEQ ID N0.1、2 所示； ②表達(dá)載體CaCl2轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21，氨芐LB抗性平板篩選陽(yáng)性克隆，獲得基因工程菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生物標(biāo)記的雙分子定點(diǎn)生物素化重組堿性磷酸酶的構(gòu)建方法，其特征在于:所述步驟(3)具體如下:①挑取單克隆菌落接種于含氨節(jié)的液體LB培養(yǎng)基，37°C10~14h培養(yǎng)、活化； ②活化菌液按照2%的接種量轉(zhuǎn)接于新鮮的含氨芐的液體LB培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)至0D600為0.3時(shí)，向培養(yǎng)基中加入終濃度為50 μ M的生物素，繼續(xù)培養(yǎng)16h，依大腸桿菌菌體內(nèi)BirA酶同步催化所表達(dá)的目的蛋白在Avi序列賴氨酸位點(diǎn)結(jié)合生物素。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生物標(biāo)記的雙分子定點(diǎn)生物素化重組堿性磷酸酶的構(gòu)建方法，其特征在于:所述步驟(4)具體如下: ①經(jīng)培養(yǎng)的基因工程菌在4°C，1000rpm離心lOmin，收集菌體； ②菌體以Tris緩沖液重懸，置入_80°C液氮中l(wèi)Omin，再迅速置入37°C的恒溫水浴中15min,如此反復(fù)凍融3次； ③上述反復(fù)凍融的菌液在4°C，1200rpm離心lOmin，上清轉(zhuǎn)入一新離心管中。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生物標(biāo)記的雙分子定點(diǎn)生物素化重組堿性磷酸酶的構(gòu)建方法，其特征在于:所述步驟(5)具體如下: ①清洗柱子:用2柱體積的BufferW清洗Strep-Tactin柱； ②樣品上柱:取步驟(4)凍融的菌液上清流通上柱結(jié)合目的蛋白； ③沖洗柱子:用5柱體積的BufferW洗柱，并收集每部分的洗脫液； ④目的蛋白的洗脫:以BufferE洗脫目的蛋白，收集每一部分并鑒定； ⑤目的蛋白的脫鹽與濃縮:使用Millipore超濾器,4°C,4000rpm,離心30min濃縮，既得生物素化重組堿性磷酸酶。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的生物標(biāo)記的雙分子定點(diǎn)生物素化重組堿性磷酸酶的構(gòu)建方法,其特征在于:所述Buffer W的配方組成為:100mM Tris.Cl,150mM NaCl,lmM EDTA，余量為水，pH8 ； 所述 Buffer E 的配方組成為:100mM Tris.Cl,150mM NaCl,ImM EDTA,2.5mMdesthiobiotin,余量為水，pH8。
【文檔編號(hào)】C12N9/16GK103667205SQ201310669405
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月10日
【發(fā)明者】唐金寶 申請(qǐng)人:濰坊醫(yī)學(xué)院