一種β-葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體催化合成紅景天苷的工藝的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種β-葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體（簡稱：β-葡萄糖苷酶CLEAs）催化合成紅景天苷的工藝，其中，在紅景天苷合成階段中：反應體系為1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽/仿水溶劑/1,4-二氧六環(huán)/緩沖溶液，仿水溶劑為乙酸乙酯，β-葡萄糖苷酶CLEAs的單位酶活為1.3~1.6U/ml，1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽與乙酸乙酯的體積和與1,4-二氧六環(huán)體積比為2:3~3:2，緩沖溶液的體積分數(shù)為12~18%；反應溫度為48~52℃，反應5~9d。本發(fā)明能夠大幅提高產(chǎn)物紅景天苷的濃度，且可保持較高的β-葡萄糖苷酶CLEAs殘余相對酶活。
【專利說明】一種β-葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體催化合成紅景天苷的工藝
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于酶催化合成紅景天苷領域，尤其是一種β-葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體(簡稱:β -葡萄糖苷酶CLEAs)催化合成紅景天苷的工藝。
【背景技術】
[0002]紅景天苷是具有特殊生理功能的化合物，它在抗細胞缺氧、抗腫瘤、增強機體免疫力等方面均有良好效果。由于生物合成紅景天苷具有選擇性高、反應條件溫和、產(chǎn)物純度較高、產(chǎn)品便于分離純化等優(yōu)點，因此受到普遍關注。
[0003]鑒于酶催化合成紅景天苷的反應時間比植物組織培養(yǎng)和細胞培養(yǎng)時間都要短很多，并且，反應過程無需昂貴的糖苷供體和催化劑，避免了化學合成繁瑣的反應步驟，另外，反應完成后可以方便的從反應液中提取目標產(chǎn)物紅景天苷，未反應的底物對羥基苯乙醇可再次循環(huán)使用，降低生產(chǎn)成本，因此，酶催化合成紅景天苷為紅景天苷批量生產(chǎn)具有非常大的經(jīng)濟意義和現(xiàn)實意義。
[0004]由于紅景天苷在糖苷酶的存在下極易被水解，而生物合成紅景天苷過程中所需的酶又需要水環(huán)境來保持其活性，即保持較高的紅景天苷合成效率，因此，如何實現(xiàn)保持酶活性與抑制紅景天苷水解的平衡點，成為了一大難題。陳磊在其碩士學位論文“西梅籽β_葡萄糖苷酶的分離純化、性質及固定化研究”一文中提到了關于β -葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體在合成紅景天苷中的應用，其結論是:以β_葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體為催化劑催化合成紅景天苷的反應中，產(chǎn)物紅景天苷的濃度大約為0.76 g/L，僅比采用粗酶粉催化合成紅景天苷的產(chǎn)物紅景天苷濃度高0.1 g/L。王夢亮等人于2009年發(fā)表了一篇“固定化β-葡萄糖苷酶催化合成紅景天苷的研究”的文章，在1- 丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽(C4MIm WF6)離子液體/1，4- 二氧六環(huán)作為反應介質，C4MIm.PF6 /I, 4- 二氧六環(huán)為99% (ν/ν),經(jīng)過條件優(yōu)化后，紅景天苷產(chǎn)物濃度可達18.57 g/L，此為現(xiàn)階段國內(nèi)外生物合成紅景天苷領域紅景天苷濃度可達到的最高值。但是，產(chǎn)物紅景天苷的濃度依然較低，無法滿足工業(yè)化生產(chǎn)對經(jīng)濟利益最大化的需求，并且，酶活回收率較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明旨在提供一種能夠大幅提高產(chǎn)物紅景天苷濃度的β_葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體(簡稱:β -葡萄糖苷酶CLEAs)催化合成紅景天苷的工藝，本發(fā)明反應過程無需昂貴的糖苷供體和催化劑，避免了化學合成繁瑣的反應步驟，另外，反應完成后可以方便的從反應液中提取目標產(chǎn)物紅景天苷，未反應的底物對羥基苯乙醇可再次循環(huán)使用，降低生產(chǎn)成本，同時解決了由于離子液體價格昂貴，離子液體的加入量在工藝中仍然很大，使得生產(chǎn)紅景天苷的成本偏高等問題，因此，酶催化合成紅景天苷為紅景天苷批量生產(chǎn)具有非常大的經(jīng)濟意義和現(xiàn)實意義。
[0006]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案:
一種β_葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體催化合成紅景天苷的工藝，包括β_葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體的制備和紅景天苷的合成兩個階段；
β -葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體制備階段，包括以下步驟:
(1)將沉降劑加入β-葡萄糖苷酶溶液中，振蕩；
(2)再加入戊二醛；
(3)向混合液中加入硼氫化鈉，振蕩后，300~500rpm離心5~IOmin,收集沉淀，即為β-葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體；
紅景天苷的合成階段，包括以下步驟:
(4)將β-D-葡萄糖和對羥基苯乙醇溶解于含β-葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體的pH為5.5^6.5的緩沖溶液中，再加入1- 丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽、仿水溶劑和1，4- 二氧六環(huán)，形成1- 丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽/仿水溶劑/1，4- 二氧六環(huán)/緩沖溶液反應體系，仿水溶劑為乙酸乙酯；(5)密封，保持溫度為48~52°C，轉速為245~255 rpm，反應5~9d，收集反應液；
其中，步驟(4)的1- 丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽/仿水溶劑/1，4- 二氧六環(huán)/緩沖溶液反應體系中，β-D-葡萄糖與對羥基苯乙醇的摩爾比為1: f 1:3，1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽的單位酶活為1.3^1.6U/ml，1- 丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽與乙酸乙酯的體積和與1，4-二氧六環(huán)的體積比為2:3~3:2，緩沖溶液的體積分數(shù)為12~18%。
[0007]步驟(1)中沉降劑為1，4-二氧六環(huán)，1，4-二氧六環(huán)與葡萄糖苷酶液的體積比為1.7: f 2.2:1，β-葡萄糖 苷酶液含葡萄糖苷酶1.5~2.5mg/ml ;步驟(2)中戊二醛的終濃度為38~43mM，交聯(lián)時間為8~12min ;步驟(3)中硼氫化鈉的終濃度為20~25 mM ; β -葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體制備階段整個反應過程的反應溫度控制在4~6°C，pH為5.0-5.5。
[0008]紅景天苷合成階段的步驟(4)中乙酸乙酯與1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽的體積比為50%~80%。
[0009]本發(fā)明采用β_葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體作為合成紅景天苷的催化劑，在離子液體/有機溶劑體系中催化直接糖基化反應成功合成紅景天苷。本發(fā)明的技術效果在于:(1)將產(chǎn)物紅景天苷的濃度提高至21g/L以上；(2)采用β -葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體作為催化劑，β-葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體的殘余相對酶活高(反應后葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體的殘余相對酶活也在84%以上)，制作簡單，同時，β -葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體通過離心即可實現(xiàn)高效回收，酶的回收作業(yè)簡單、快捷；(3)本發(fā)明的β -葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體催化合成紅景天苷的工藝中，采用廉價的仿水溶劑(如:乙酸乙酯)來代替部分的離子液體，可在不影響產(chǎn)物紅景天苷濃度的前提下(產(chǎn)物紅景天苷的濃度可維持在21g/L以上)，大大降低生產(chǎn)成本；
(4)本發(fā)明通過對β-葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體制備階段反應條件的優(yōu)化，使得β-葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體的酶活回收率也達到了 80%以上，大大降低了 β -葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體制備階段的酶活損失，從而，降低了合成一定量紅景天苷的β -葡萄糖苷酶用量，進一步縮減生產(chǎn)成本。
[0010]在酶催化合成紅景天苷領域，由于紅景天苷在糖苷酶存在下極易被水解的特性，使得提高產(chǎn)物紅景天苷的濃度變得十分困難。本發(fā)明能夠得到如此高的產(chǎn)物紅景天苷濃度，不僅僅在于β-葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體在離子液體/有機溶劑體系中的酶催化效率高；另外，仿水溶劑的選擇也很重要，本 申請人:分別采用乙酸乙酯、乙腈、N，N-二甲基甲酰胺作為仿水溶劑進行試驗，發(fā)現(xiàn)僅乙酸乙酯(本申請采用乙酸乙酯作為仿水溶劑)可使得最終制得的反應液紅景天苷濃度較高；還在于，本 申請人:進行無數(shù)次的試驗，得到了紅景天苷合成過程各個反應條件的較佳值，最終，才使得本發(fā)明的產(chǎn)物紅景天苷濃度達到21 g/L以上，高于現(xiàn)有的國內(nèi)外所報道的最高值(18.57g/L)，并且，β -葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體的殘余相對酶活也保持在較高的水平(85%以上)。再加上，本 申請人:通過對葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體的制備過程中各個反應條件進行了優(yōu)化，提高了 β-葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體的酶活回收率。
【具體實施方式】
[0011]實施例1 β -葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體(簡稱β -葡萄糖苷酶CLEAs)催化合成紅景天苷的工藝，包括β -葡萄糖苷酶CLEAs的制備和紅景天苷合成兩個階段；
β -葡萄糖苷酶CLEAs的制備階段，包括以下步驟:(I)將1.7ml I, 4- 二氧六環(huán)加入Iml含β -葡萄糖苷酶2.5mg/ml的β -葡萄糖苷酶溶液中(1，4- 二氧六環(huán)與β -葡萄糖苷酶液的體積比為1.7:1(ν: V))，振蕩；(2)再加入戊二醛，至其終濃度為38mM，反應12min，進行交聯(lián)；(3)向混合液中加入硼氫化鈉(NaBH4)，至NaBH4的終濃度為25mM，進行還原，振蕩后，300rpm離心8min，收集沉淀，即為β -葡萄糖苷酶CLEAs ;整個反應過程的反應溫度控制在6°C，pH為5.2 ;收集沉淀，測得β -葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率為81.71%。
[0012]紅景天苷的合成階段，包括以下步驟:(4)將0.220 g β-D-葡萄糖和0.169 g對羥基苯乙醇(β-D-葡萄糖與對羥基苯乙醇的摩爾比為1:1)溶解在含β-葡萄糖苷酶CLEAs的pH為5.5的緩沖溶液中，再加入235 μ L 1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽((:4]\0111斗?6)、235 4 1^乙酸乙酯和47(^1^ I，4-二氧六環(huán)(C4MIm.PF6:乙酸乙酯:1，4_ 二氧六環(huán)的體積比為2.5: 2.5: 5)，形成C4MIm.PF6/乙酸乙酯(仿水溶劑)/1，4-二氧六環(huán)/緩沖溶液反應體系，其中，緩沖溶液體積分數(shù)為15% ；(5)密封，保持溫度為48°C，轉速為250 rpm,反應9d，收集上清液。
[0013]測得反應液中紅景天苷的濃度為25.32g/L，離心，收集沉淀，測得反應后β -葡萄糖苷酶CLEAs的殘余相對酶活為84.61%。
[0014]β-葡萄糖苷酶CLEAs的回收處理方式為:反應液離心后，將收集得到的葡萄糖苷酶CLEAs沉淀以緩沖溶液(pH為6.0的檸檬酸-Na2HPO4緩沖溶液)洗滌3次，再分別加入ImL緩沖溶液(pH為6.0的檸檬酸-Na2HPO4緩沖溶液)并振蕩使之成為懸濁液，取樣測定葡萄糖苷酶CLEAs的酶活。以不經(jīng)沉降劑、交聯(lián)劑處理的酶液的酶活為100%，計算β -葡萄糖苷酶CLEAs制備階段得到的β -葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率。以紅景天苷合成階段前葡萄糖苷酶的相對水解活力為100%，計算收集得到的反應液沉淀中β-葡萄糖苷酶的殘余相對酶活。
[0015]β -葡萄糖苷酶的酶活測定方法為:分別取100 μ L待測β -葡萄糖苷酶CLEAs溶液與10 mM的2 mL對硝基苯基-β -D-葡萄糖苷(pNPG)溶液，二者混合后50°C水浴精確保溫10 min，之后立即加入I M的碳酸鈉溶液2 mL以終止反應，振蕩均勻后室溫靜置5 min,適當稀釋后以紫外分光光度計測定樣本在波長410 nm處的吸光值，代入pNP標準曲線計算可得PNP生成量。酶活力單位定義為:每分鐘內(nèi)催化pNPG生成IymoL pNP的酶量。其中，PNP標準曲線制作過程為本領域常見的標準曲線制作方法，在此不做贅述。[0016]紅景天苷濃度的測定方法為:將含有紅景天苷的上清液，以孔徑0.45 μπι的有機濾膜過濾，濾液以甲醇稀釋一定倍數(shù)后以高效液相色譜儀對樣本中紅景天苷含量進行測定。所測定的紅景天苷峰面積代入紅景天苷標準曲線中加以計算即可得樣本中紅景天苷濃度。其中，紅景天苷標準曲線制作過程為本領域常見的標準曲線制作方法，在此不做贅述。
[0017]實施例2
β -葡萄糖苷酶CLEAs催化合成紅景天苷的工藝，包括β -葡萄糖苷酶CLEAs的制備和紅景天苷合成兩個階段；
β-葡萄糖苷酶CLEAs的制備階段，包括以下步驟:(I)將2.2ml 1，4-二氧六環(huán)加入Iml含β -葡萄糖苷酶1.5mg/ml的β -葡萄糖苷酶溶液中(1，4- 二氧六環(huán)與β -葡萄糖苷酶液體積比為2.2:1)，振蕩；(2)再加入戊二醛，至其終濃度為40mM，反應8min，進行交聯(lián)；(3)向混合液中加入硼氫化鈉(NaBH4),至NaBH4的終濃度為20 mM,進行還原，振蕩后，500rpm離心5min,收集沉淀，即為β -葡萄糖苷酶CLEAs ;整個反應過程的反應溫度控制在4°C, pH為5.5 ;收集沉淀，測得β -葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率為81.65%。
[0018]紅景天苷的合成階段，包括以下步驟:(4)將0.110 g β-D-葡萄糖和0.169 g對羥基苯乙醇(β-D-葡萄糖與對羥基苯乙醇的摩爾比為1:2)溶解在含β-葡萄糖苷酶CLEAs的pH為6.5的緩沖溶液中，再加入150 μ L C4MIm.PF6、226y L乙酸乙酯和564 μ L
1.4-二氧六環(huán)(C4MIm.PF6:乙酸乙酯:1，4-二氧六環(huán)體積比為0.8: 1.2: 3)，形成C4MIm *PF6/乙酸乙酯(仿水溶劑)/1，4- 二氧六環(huán)/緩沖溶液反應體系,其中，緩沖溶液體積分數(shù)為12% ; (5)密封，保持溫度為52°C，轉速為250 rpm，反應8d，收集反應液。
[0019]測得反應液中紅景天苷的濃度為24.67g/L，離心，收集沉淀，測得反應后β -葡萄糖苷酶CLEAs的殘余相對酶活為89.73%。
[0020]實施例3`
β -葡萄糖苷酶CLEAs催化合成紅景天苷的工藝，包括β -葡萄糖苷酶CLEAs的制備和紅景天苷合成兩個階段；
β -葡萄糖苷酶CLEAs的制備階段，包括以下步驟:(I)將2.0ml I, 4- 二氧六環(huán)加入Iml含β -葡萄糖苷酶1.5mg/ml的β -葡萄糖苷酶溶液中(1，4- 二氧六環(huán)與β -葡萄糖苷酶液體積比為2:1)，振蕩；(2)再加入戊二醛，至其終濃度為43mM，反應8min，進行交聯(lián)；(3)向混合液中加入硼氫化鈉(NaBH4),至NaBH4的終濃度為23 mM,進行還原，振蕩后，400rpm離心5min,收集沉淀，即為β -葡萄糖苷酶CLEAs ;整個反應過程的反應溫度控制在5°C,pH為5.0 ;收集沉淀，測得β -葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率為80.59%。
[0021]紅景天苷的合成階段，包括以下步驟:(4)將0.110 g β-D-葡萄糖和0.254 g對羥基苯乙醇(β-D-葡萄糖與對羥基苯乙醇的摩爾比為1:3)溶解在含β-葡萄糖苷酶CLEAs的pH為6.0的緩沖溶液中，再加入113 μ L C4MIm.PF6,251 μ L乙酸乙酯和376 μ L
1.4-二氧六環(huán)(C4MIm.PF6:乙酸乙酯:1，4-二氧六環(huán)體積比為0.6: 2.4: 2)，形成C4MIm *PF6/乙酸乙酯(仿水溶劑)/1，4- 二氧六環(huán)/緩沖溶液反應體系,其中，緩沖溶液體積分數(shù)為18% ; (5)密封，保持溫度為50°C，轉速為250 rpm，反應5d，收集反應液。
[0022]測得反應液中紅景天苷的濃度為24.49g/L，離心，收集沉淀，測得反應后β -葡萄糖苷酶CLEAs的殘余相對酶活為88.04%。
[0023]實施例4β -葡萄糖苷酶CLEAs催化合成紅景天苷的工藝，包括β -葡萄糖苷酶CLEAs的制備和紅景天苷合成兩個階段；
β -葡萄糖苷酶CLEAs的制備階段，包括以下步驟:(I)將4.0ml 1，4- 二氧六環(huán)加入Iml含β -葡萄糖苷酶1.25mg/ml的β -葡萄糖苷酶溶液中(1，4- 二氧六環(huán)與β -葡萄糖苷酶液體積比為4:1 (V: V))，振蕩；(2)再加入戊二醛，至其終濃度為30禮，反應lOmin，進行交聯(lián)；(3)向混合液中加入硼氫化鈉(NaBH4),至NaBH4的終濃度為30mM，進行還原，振蕩后，400rpm離心IOmin,收集沉淀，即為β -葡萄糖苷酶CLEAs ;整個反應過程的反應溫度控制在4°C，pH為5.0 ;收集沉淀，測得β -葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率為74.37%。
[0024]紅景天苷的合成階段，包括以下步驟:(4)將0.110 g β-D-葡萄糖和0.254 g對羥基苯乙醇(β-D-葡萄糖與對羥基苯乙醇的摩爾比為1:3)溶解在含β-葡萄糖苷酶CLEAs的pH為6.0的緩沖溶液中，再加入113 μ L C4MIm.PF6、251 μ L乙酸乙酯和376 μ L1，4-二氧六環(huán)(C4MIm.PF6:乙酸乙酯:1，4-二氧六環(huán)體積比為0.6: 2.4: 2)，形成C4MIm *PF6/乙酸乙酯(仿水溶劑)/1，4- 二氧六環(huán)/緩沖溶液反應體系,其中，緩沖溶液體積分數(shù)為12% ; (5)密封，保持溫度為50°C，轉速為250 rpm，反應5d，收集反應液。
[0025]測得反應液中紅景天苷的濃度為23.25g/L，離心，收集沉淀，測得反應后β -葡萄糖苷酶CLEAs的殘余相對酶活為87.62%。
[0026]實施例5
β -葡萄糖苷酶CLEAs催化合成紅景天苷的工藝，包括β -葡萄糖苷酶CLEAs的制備和紅景天苷合成兩個階段；
β-葡萄糖苷酶CLEAs的制備階段，包括以下步驟:(I)將1.5ml 1，4-二氧六環(huán)加入Iml含β -葡萄糖苷酶3.0mg/ml的β -葡萄糖苷酶溶液中(1，4- 二氧六環(huán)與β -葡萄糖苷酶液體積比為1.5:1)，振蕩；(2)再加入戊二醛，至其終濃度為20mM，反應lOmin，進行交聯(lián)；
(3)向混合液中加入硼氫化鈉(NaBH4),至NaBH4的終濃度為15mM，進行還原，振蕩后，300rpm離心lOmin，收集沉淀，即為β -葡萄糖苷酶CLEAs ;整個反應過程的反應溫度控制在5°C，pH為5.0 ;收集沉淀，測得β -葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率為69.57%。
[0027]紅景天苷的合成階段，包括以下步驟:(4)將0.110 g β-D-葡萄糖和0.169 g對羥基苯乙醇(β-D-葡萄糖與對羥基苯乙醇的摩爾比為1:2)溶解在含β-葡萄糖苷酶CLEAs的pH為6.0的緩沖溶液中，再加入235 μ L C4MIm.PF6、235y L乙酸乙酯和470 μ L1,4-二氧六環(huán)(C4MIm^PF6:乙酸乙酯:1，4-二氧六環(huán)的體積比為2.5: 2.5: 5),形成C4MIm *PF6/乙酸乙酯(仿水溶劑)/1，4- 二氧六環(huán)/緩沖溶液反應體系,其中，緩沖溶液體積分數(shù)為15% ; (5)密封，保持溫度為50°C，轉速為250 rpm，反應8d，收集反應液。
[0028]測得反應液中紅景天苷的濃度為23.llg/L，離心，收集沉淀，測得反應后β -葡萄糖苷酶CLEAs的殘余相對酶活為86.94%。
[0029]實施例6
β -葡萄糖苷酶CLEAs催化合成紅景天苷的工藝，包括β -葡萄糖苷酶CLEAs的制備和紅景天苷合成兩個階段；
β -葡萄糖苷酶CLEAs的制備階段，包括以下步驟:(I)將4.0ml異丙醇加入Iml含β -葡萄糖苷酶1.25mg/ml的β -葡萄糖苷酶溶液中(1，4- 二氧六環(huán)與β -葡萄糖苷酶液體積比為4:1)，振蕩；(2)再加入戊二醛，至其終濃度為30mM，反應lOmin，進行交聯(lián)；(3)向混合液中加入硼氫化鈉(NaBH4),至NaBH4的終濃度為30mM，進行還原，振蕩后，400rpm離心IOmin,收集沉淀，即為β -葡萄糖苷酶CLEAs ;整個反應過程的反應溫度控制在4°C，pH為
5.0 ；收集沉淀，測得β -葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率為73.15%。
[0030]紅景天苷的合成階段，包括以下步驟:(4)將0.110 g β-D-葡萄糖和0.254 g對羥基苯乙醇(β-D-葡萄糖與對羥基苯乙醇的摩爾比為1:3)溶解在含β-葡萄糖苷酶CLEAs的pH為6.0的緩沖溶液中，再加入113 μ L C4MIm.PF6,251 μ L乙酸乙酯和376 μ L
1,4-二氧六環(huán)(C4MIm.PF6:乙酸乙酯:1，4-二氧六環(huán)體積比為0.6: 2.4: 2)，形成C4MIm.PF6/乙酸乙酯(仿水溶劑)/I, 4- 二氧六環(huán)/緩沖溶液反應體系其中，緩沖溶液體積分數(shù)為12% ; (5)密封，保持溫度為50°C，轉速為250 rpm，反應5d，收集反應液。
[0031]測得反應液中紅景天苷的濃度為21.31g/L，離心，收集沉淀，測得反應后β-葡萄糖苷酶CLEAs的殘余相對酶活為85.27%。
[0032]另外，本 申請人:還將實施例1中的乙酸乙酯替換為乙腈或N，N-二甲基甲酰胺等常見的仿水溶劑進行試驗，結果為:與實施例1相比，采用乙腈作為仿水溶劑，在相同條件下，紅景天苷的濃度為19.27 g/L (下降了 6.05 g/L),反應后β -葡萄糖苷酶CLEAs的殘余相對酶活為75.56 (下降了 9.05%);而采用二甲基甲酰胺作為仿水溶劑，紅景天苷的濃度為15.74 g/L (下降了 9.58 g/L),反應后β -葡萄糖苷酶CLEAs的殘余相對酶活為72.58 (下降了 12.03%)ο
[0033]本發(fā)明的pNPG、pNP、杏仁β -葡萄糖苷酶(6 U/mg)購自上海源葉生物科技有限公司。
[0034]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【權利要求】
1.一種β-葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體催化合成紅景天苷的工藝，其特征在于:包括β -葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體的制備和紅景天苷的合成兩個階段；β -葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體制備階段，包括以下步驟: (1)將沉降劑加入β-葡萄糖苷酶溶液中，振蕩； (2)再加入戊二醛； (3)向混合液中加入硼氫化鈉，振蕩后，300~500rpm離心5~IOmin,收集沉淀，即為β-葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體； 紅景天苷的合成階段，包括以下步驟: (4)將β-D-葡萄糖和對羥基苯乙醇溶解于含β-葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體的pH為5.5^6.5的緩沖溶液中，再加入1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽、仿水溶劑和1,4-二氧六環(huán)，形成1- 丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽/仿水溶劑/1，4- 二氧六環(huán)/緩沖溶液反應體系，仿水溶劑為乙酸乙酯；(5)密封，保持溫度為48~52°C，轉速為245~255 rpm，反應5~9d，收集反應液； 其中，步驟(4)的1- 丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽/仿水溶劑/1，4- 二氧六環(huán)/緩沖溶液反應體系中，β-D-葡萄糖與對羥基苯乙醇的摩爾比為1: f 1:3，1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽的單位酶活為1.3^1.6U/ml，1- 丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽與乙酸乙酯的體積和與1，4-二氧六環(huán)的體積比為2:3~3:2，緩沖溶液的體積分數(shù)為12~18%。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種β_葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體催化合成紅景天苷的工藝，其特征在于:步驟(1)中沉降劑為1，4-二氧六環(huán)，1，4-二氧六環(huán)與β-葡萄糖苷酶液體積比為1.7: f 2.2:1，β-葡萄糖苷酶液含葡萄糖苷酶1.5~2.5mg/ml ;步驟(2)中戊二醛的終濃度為38~43m M，交聯(lián)時間為8~12min ;步驟(3)中硼氫化鈉的終濃度為20-25πιΜ;β-葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體制備階段整個反應過程的反應溫度控制在4~6°C，pH為5.0~5.5。
3.根據(jù)權利要求1所述一種β_葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體催化合成紅景天苷的工藝，其特征在于:紅景天苷合成階段的步驟(4)中乙酸乙酯與1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽體積比為50%~80%。
【文檔編號】C12P19/44GK103642880SQ201310664233
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月11日 優(yōu)先權日:2013年12月11日
【發(fā)明者】石賢愛, 薛原楷 申請人:福州大學