一種β-葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種能夠獲得高酶活回收率的β-葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體的制備方法，包括以下步驟：（1）將沉降劑加入β-葡萄糖苷酶溶液中，振蕩；（2）加入戊二醛；（3）向混合液中加入還原劑，振蕩后，離心，收集沉淀；整個反應過程的反應溫度控制在4~6℃，pH值為5.0~5.5；其中，步驟（1）的沉降劑為1,4-二氧六環(huán)，1,4-二氧六環(huán)與β-葡萄糖苷酶液的體積比為2~3:1；步驟（2）中戊二醛的濃度為38~43mM，交聯(lián)時間為8~12min；還原劑為硼氫化鈉（NaBH4），NaBH4的濃度為20~25mM。
【專利說明】一種葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體的制備方法【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于固定化酶生產領域，具體涉及一種(6-葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體的制備方法。
【背景技術】
[0002]游離3 -葡萄糖糖苷酶在工業(yè)生產中存在穩(wěn)定性差、重復利用率低等問題，嚴重制約著生物合成紅景天苷的工業(yè)化生產。而交聯(lián)酶聚集體既不需要對酶進行結晶化操作，又能最大限度保留酶活回收率，是無載體固定化酶技術中最優(yōu)良的一種。隨著交聯(lián)聚集體技術在酶固定化領域的迅速發(fā)展，近年來，有人研究了 3-葡萄糖糖苷酶交聯(lián)聚集體的制備方法(詳見:歐杰，交聯(lián)3-葡萄糖糖苷酶聚集體制備及其生產大豆異黃酮活性苷元的研究，合肥工業(yè)大學，碩士論文，2007年6月)，該(6-葡萄糖糖苷酶交聯(lián)聚集體的制備方法為:首先，將沉降劑(乙醇或異丙醇或正丙醇)加入(6-葡萄糖苷酶溶液中，振蕩；然后，加入交聯(lián)劑(戊二醛)交聯(lián)；最后，向混合液中加入還原劑(硼氫化鈉)，振蕩后得到交聯(lián)@ -葡萄糖苷酶聚集體(即(6-葡萄糖苷酶CLEAs)。并分別對(6-葡萄糖苷酶CLEAs制備過程中的制備條件(如沉降劑的選擇、沉降劑與酶液的體積比、PH、溫度、沉降時間等)、交聯(lián)條件(如戊二醛濃度、溫度、交聯(lián)時間等)進行了優(yōu)化，在最優(yōu)的制備條件以及交聯(lián)條件下制得的P -葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率為77.4% (可達到的最高值)，依然較低，無法滿足工廠化經濟利益最大化的要求。

【發(fā)明內容】
[0003]本發(fā)明旨在提供一種P -葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體(P -葡萄糖苷酶CLEAs)的制備方法，通過該方法制得的3 -葡萄糖苷酶CLEAs體能夠解決現(xiàn)有技術的固定化糖苷酶在工業(yè)生產過程中酶活回收率低的問題。
[0004]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案:
一種3 -葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體的制備方法，包括以下步驟:
(1)將沉降劑加入(6-葡萄糖苷酶溶液中，振蕩；
(2)加入戊二醛；
(3)向混合液中加入還原劑,振蕩后,30(T500rpm離心5~10min,收集沉淀，即為(6-葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體；
其中，整個反應過程的反應溫度控制在4~6°C，pH值為5.(T5.5 ;步驟(1)的沉降劑為1，4-二氧六環(huán)，1，4-二氧六環(huán)與(6-葡萄糖苷酶液的體積比為疒3:1，(6-葡萄糖苷酶溶液的3 -葡萄糖苷酶濃度為1.5^2.5mg/ml ;步驟(2)終戊二醛的終濃度為38~43mM，交聯(lián)時間為8~12min ;步驟(3)的還原劑為硼氫化鈉,硼氫化鈉的終濃度為20~25 mM。
[0005]所述的0 -葡萄糖苷酶為杏仁P -葡萄糖苷酶。
[0006]本發(fā)明的優(yōu)點在于:常見的用于酶交聯(lián)聚集體制備方法的沉降劑有:甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、丙酮、N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)和飽和硫酸銨。而，I, 4- 二氧六環(huán)一般被用作色譜分析試劑及乙酸纖維及其衍生物的溶劑來使用，至今為止，未見將其用作酶交聯(lián)聚集體制備方法的沉降劑的報道。本發(fā)明首次以1，4-二氧六環(huán)作為(6-葡萄糖苷酶CLEAs制備方法的沉降劑。再結合優(yōu)化的交聯(lián)條件以及還原條件，使得最終制得的3 -葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率可高達80%以上(最高可達81.78%)，而采用現(xiàn)有技術的制備方法在最優(yōu)反應條件下制得的P -葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率僅為77.4% (此酶活回收率為現(xiàn)有技術所達到的最高值)，即本發(fā)明制得的P -葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率遠遠高于現(xiàn)有技術的最高值。在酶的固定化中不可避免的會出現(xiàn)部分酶殘留在溶液中或酶蛋白部分失活的現(xiàn)象，因此，要想在現(xiàn)有技術酶活回收率最高值77.4%的基礎上繼續(xù)提升，具有非常大的難度。而本發(fā)明所制備的(6-葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率卻可將酶活回收率提高2飛個百分點。
[0007]
【具體實施方式】
[0008]實施例1
一種3 -葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體(3 -葡萄糖苷酶CLEAs)的制備方法，包括以下步驟:(I)將2.5ml 1,4-二氧六環(huán)加入到I mL含0 -葡萄糖苷酶1.5mg/ml的P -葡萄糖苷酶溶液中(即1，4-二氧六環(huán)與(6-葡萄糖苷酶液的體積比為2.5:1)，振蕩；(2)加入25%戊二醛的，至戊二醛的終濃度為43mM，交聯(lián)時間IOmin ; (3)再加入硼氫化鈉(NaBH4),至NaBH4的終濃度為25 mM,進行還原,振蕩后，400rpm離心5min,收集沉淀，即為P -葡萄糖苷酶CLEAs ;整個反應過程的反應溫度控制在5°C，pH值為5.5。
[0009]^ -葡萄糖苷酶CLEAs的回收處理方式為:反應液離心后，將收集得到的P -葡萄糖苷酶CLEAs沉淀以緩沖溶液洗滌3次，再分別加入ImL緩沖溶液并振蕩使之成為懸濁液，各組分別取樣測定P -葡萄糖苷·酶CLEAs的水解活力，以不經沉降劑、交聯(lián)劑處理的酶液的酶活為100%，計算P -葡萄糖苷酶CLEAs的相對水解活力(即P -葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率)。
[0010](6-葡萄糖苷酶的水解活力測定方法為:分別取100 UL待測(6-葡萄糖苷酶CLEAs溶液與10 mM的2 mL對硝基苯基-0 -D-葡萄糖苷(pNPG)溶液，二者混合后50°C水浴精確保溫10 min，之后立即加入I M的碳酸鈉溶液2 mL以終止反應，振蕩均勻后室溫靜置5 min，適當稀釋后以紫外分光光度計測定樣本在波長410 nm處的吸光值，代入pNP標準曲線計算可得pNP生成量。酶活力單位定義為:每分鐘內催化pNPG生成I iimoL pNP的酶量。其中，PNP標準曲線制作過程為本領域常見的標準曲線制作方法。
[0011]P -葡萄糖苷酶的水解活力測定方法為:分別取100 UL待測(6-葡萄糖苷酶CLEAs溶液與10 mM的2 mL對硝基苯基-0 -D-葡萄糖苷(pNPG)溶液，二者混合后50°C水浴精確保溫10 min，之后立即加入I M的碳酸鈉溶液2 mL以終止反應，振蕩均勻后室溫靜置5 min，適當稀釋后以紫外分光光度計測定樣本在波長410 nm處的吸光值，代入pNP標準曲線計算可得pNP生成量。酶活力單位定義為:每分鐘內催化pNPG生成I iimoL pNP的酶量。其中，PNP標準曲線制作過程為本領域常見的標準曲線制作方法。其中，緩沖溶液一般選用pH為5.0的檸檬酸-Na2HPO4緩沖溶液。
[0012]實施例1中0 -葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率為81.65%。[0013]實施例2
實施例2與實施例1不同的是:整個反應過程中pH值為5.0，其中，步驟(1)中1,4-二氧六環(huán)的體積為2ml (即1，4-二氧六環(huán)與(6-葡萄糖苷酶液的體積比為2:1)，(6-葡萄糖苷酶溶液含P -葡萄糖苷酶2.5mg/ml ;步驟(2)中戊二醛的終濃度為40 mM;步驟(3)中NaBH4的終濃度為23 mM, 300rpm離心IOmin ;測得P -葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率為81.78%o
[0014]實施例3
實施例3與實施例1不同的是:整個反應過程中pH值為5.2，其中，步驟(1)中1,4-二氧六環(huán)的體積為3ml(即1，4-二氧六環(huán)與(6-葡萄糖苷酶液的體積比為3:1)，(6-葡萄糖苷酶溶液含P -葡萄糖苷酶2.0mg/ml ;步驟(2)中戊二醛的終濃度為38 mM ;步驟(3)中NaBH4的終濃度為20mM，500rpm離心5min，測得P -葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率為80.11%。
[0015]實施例4
實施例4與實施例1不同的是:整個反應過程中pH值為5.4，其中，步驟(1)中1,4-二氧六環(huán)的體積為3ml (即1，4-二氧六環(huán)與(6-葡萄糖苷酶液的體積比為3:1)，(6-葡萄糖苷酶溶液含P -葡萄糖苷酶2mg/ml ;步驟(2)中戊二醛的終濃度為10 mM ;步驟(3)中NaBH4的終濃度為20 mM，測得P -葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率為13.21%。
[0016]實施例5
實施例5與實施例1不同的是:整個反應過程中pH值為5.0，其中，步驟(1)中1,4-二氧六環(huán)的體積為3ml (即1，4-二氧六環(huán)與P -葡萄糖苷酶液的體積比為3:1)，(6-葡萄糖苷酶溶液含葡萄糖苷酶1.5mg/ml ;步驟(2)中戊二醛的終濃度為50 mM;步驟(3)中NaBH4的終濃度為25 mM, 400rpm離心5min，測得P -葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率為72.37%。
[0017]實施例6
實施例6與實施例1不同的是:整個反應過程中pH值為5.5，其中，步驟(1)中1,4-二氧六環(huán)的體積為1.5ml (即，4-二氧六環(huán)與(6-葡萄糖苷酶液的體積比為1.5:1)，(6-葡萄糖苷酶溶液含(6-葡萄糖苷酶1.5mg/ml ;步驟(2)中戊二醛的終濃度為38 mM ;步驟(3)中NaBH4的終濃度為25 mM, 300rpm離心IOmin ;測得P -葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率為 69.15%。
[0018]實施例7
實施例7與實施例1不同的是:整個反應過程中pH值為5.2，其中，步驟(1)中1,4-二氧六環(huán)的體積為2.5ml (即1，4-二氧六環(huán)與(6-葡萄糖苷酶液的體積比為2.5:1)，(6-葡萄糖苷酶溶液含P -葡萄糖苷酶2.0mg/ml ;步驟(2)中戊二醛的終濃度為40 mM ;步驟(3)中NaBH4的終濃度為23mM，400rpm離心5min，測得P -葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率為77.37%。
[0019]實施例8
按照現(xiàn)有技術的最優(yōu)制備條件，具體為:取2.0 mg/mLP -葡萄糖苷酶溶液IOml,在4°C條件下，向其中緩慢加入90%的硫酸銨飽和溶液90ml，待沉淀30min后，離心，用pH為
5.0的緩沖液溶解；再向溶解液中加入IOmM的戊二醛溶液，在30°C條件下，交聯(lián)15min ;最后，加入NaBH4進行還原， 300rpm離心lOmin，測得P -葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率為77.51±0.03。
[0020]根據(jù)上述實施例廣3與實施例8的對比，可知，本發(fā)明所得到的的P -葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率遠遠高于現(xiàn)有技術(實施例8)的酶活回收率，原因在于:不同的沉降劑使游離酶發(fā)生沉淀后，損失的酶活不同，而本發(fā)明的采用1，4-二氧六環(huán)為沉降劑可使葡萄糖苷酶在沉降過程中保持最大的酶活。上述實施例4中的戊二醛濃度采用的是現(xiàn)有技術的交聯(lián)劑最佳濃度值(戊二醛的濃度為10 mM)，但是，對應的(6-葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率僅為13.21%，可見，以1，4- 二氧六環(huán)為沉降劑所制備的P -葡萄糖苷酶CLEAs在戊二醛交聯(lián)過程中對交聯(lián)作用影響較大。因此，本發(fā)明具有可制得高酶活回收率@ -葡萄糖苷酶CLEAs的技術效果并不僅僅在于沉降劑種類選擇上的突破性改變，而且，還要有匹配此特殊沉降劑(1，4- 二氧六環(huán))的戊二醛濃度，同時，從實施例4~7也可看出，本發(fā)明的1，4- 二氧六環(huán)與0 -葡萄糖苷酶液的體積比以及NaBH4的濃度對P -葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率也有一定的影響，因此，本發(fā)明人需要經過無數(shù)次試驗后方可得出一系列相互匹配的最佳組合以及 最佳范圍值，使得(6-葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率可以達到80%以上。
[0021]本發(fā)明的(6-葡萄糖苷酶為杏仁(6-葡萄糖苷酶，當然也可采用其他的(6-葡萄糖苷酶，如現(xiàn)有技術中的西梅籽葡萄糖苷酶等。
[0022]本發(fā)明的對pNPG、pNP、杏仁P -葡萄糖苷酶(6 U/mg)均購自上海源葉生物科技有限公司；本發(fā)明的1，4-二氧六環(huán)、25%戊二醛、NaBH4等均購自國藥集團有限公司。
[0023]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【權利要求】
1.一種3 -葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體的制備方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)將沉降劑加入(6-葡萄糖苷酶溶液中，振蕩； (2)加入戊二醛； (3)向混合液中加入還原劑,振蕩后,30(T500rpm離心5~10min,收集沉淀，即為(6-葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體； 整個反應過程的反應溫度控制在4~6°C，pH值為5.(T5.5 ;步驟(1)的沉降劑為1,4-二氧六環(huán)，1，4-二氧六環(huán)與(6-葡萄糖苷酶液的體積比為疒3:1，(6-葡萄糖苷酶溶液的^ -葡萄糖苷酶濃度為1.5^2.5mg/ml ;步驟(2)終戊二醛的終濃度為38~43mM，交聯(lián)時間為8~12min ;步驟(3)的還原劑為硼氫化鈉,硼氫化鈉的終濃度為20~25 mM。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種3-葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體的制備方法，其特征在于:所述的(6-葡萄 糖苷酶為杏仁(6-葡萄糖苷酶。
【文檔編號】C12N9/42GK103667219SQ201310664188
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月11日 優(yōu)先權日:2013年12月11日
【發(fā)明者】石賢愛, 薛原楷 申請人:福州大學