β-葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體催化合成紅景天苷的工藝的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供β-葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體催化合成紅景天苷的工藝，其中，紅景天苷合成階段的反應(yīng)條件為：反應(yīng)體系為1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽（C4MIm·PF6）/1,4-二氧六環(huán)/緩沖溶液，β-葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體的單位酶活為1.3~1.6U/ml，C4MIm·PF6與1,4-二氧六環(huán)的體積比為2:3~3:2，緩沖溶液的體積分?jǐn)?shù)為12~18%；反應(yīng)溫度為48~52℃，轉(zhuǎn)速為245~255rpm，反應(yīng)5~9d。本發(fā)明能夠大幅提高產(chǎn)物紅景天苷的濃度，且可保持較高的β-葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體殘余相對(duì)酶活。
【專利說明】β-葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體催化合成紅景天苷的工藝
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于酶催化合成紅景天苷領(lǐng)域，尤其是一種β-葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體(簡(jiǎn)稱:β -葡萄糖苷酶CLEAs)催化合成紅景天苷的工藝。
【背景技術(shù)】
[0002]紅景天苷是具有特殊生理功能的化合物，它在抗細(xì)胞缺氧、抗腫瘤、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等方面均有良好效果。由于生物合成紅景天苷具有選擇性高、反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)物純度較高、產(chǎn)品便于分離純化等優(yōu)點(diǎn)，因此受到普遍關(guān)注。
[0003]鑒于酶催化合成紅景天苷的反應(yīng)時(shí)間比植物組織培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間都要短很多，并且，反應(yīng)過程無需昂貴的糖苷供體和催化劑，避免了化學(xué)合成繁瑣的反應(yīng)步驟，另外，反應(yīng)完成后可以方便的從反應(yīng)液中提取目標(biāo)產(chǎn)物紅景天苷，未反應(yīng)的底物對(duì)羥基苯乙醇可再次循環(huán)使用，降低生產(chǎn)成本，因此，酶催化合成紅景天苷為紅景天苷批量生產(chǎn)具有非常大的經(jīng)濟(jì)意義和現(xiàn)實(shí)意義。
[0004]由于紅景天苷在糖苷酶的存在下極易被水解，而生物合成紅景天苷過程中所需的酶又需要水環(huán)境來保持其活性，即保持較高的紅景天苷合成效率，因此，如何實(shí)現(xiàn)保持酶活性與抑制紅景天苷水解的平衡點(diǎn)，成為了一大難題。陳磊在其碩士學(xué)位論文“西梅籽β_葡萄糖苷酶的分離純化、性質(zhì)及固定化研究”一文中提到了關(guān)于β -葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體在合成紅景天苷中的應(yīng)用，其結(jié)論是:以β_葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體為催化劑催化合成紅景天苷的反應(yīng)中，產(chǎn)物紅景天苷的濃度大約為0.76 g/L，僅比采用粗酶粉催化合成紅景天苷的產(chǎn)物紅景天苷濃度高0.1 g/L。王夢(mèng)亮等人于2009年發(fā)表了一篇“固定化β-葡萄糖苷酶催化合成紅景天苷的研究”的文章，在1- 丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽(C4MIm WF6)離子液體/1，4- 二氧六環(huán)作為反應(yīng)介質(zhì)，C4MIm.PF6 /I, 4- 二氧六環(huán)為99% (ν/ν),經(jīng)過條件優(yōu)化后，紅景天苷產(chǎn)物濃度可達(dá)18.57 g/L，此為現(xiàn)階段國內(nèi)外生物合成紅景天苷領(lǐng)域紅景天苷濃度可達(dá)到的最高值。但是，產(chǎn)物紅景天苷的濃度依然較低，無法滿足工業(yè)化生產(chǎn)對(duì)經(jīng)濟(jì)利益最大化的需求，并且，酶活`回收率較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明旨在提供一種能夠大幅提高產(chǎn)物紅景天苷濃度的β_葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體(簡(jiǎn)稱:β -葡萄糖苷酶CLEAs)催化合成紅景天苷的工藝，本發(fā)明反應(yīng)過程無需昂貴的糖苷供體和催化劑，避免了化學(xué)合成繁瑣的反應(yīng)步驟，另外，反應(yīng)完成后可以方便的從反應(yīng)液中提取目標(biāo)產(chǎn)物紅景天苷，未反應(yīng)的底物對(duì)羥基苯乙醇可再次循環(huán)使用，降低生產(chǎn)成本，因此，酶催化合成紅景天苷為紅景天苷批量生產(chǎn)具有非常大的經(jīng)濟(jì)意義和現(xiàn)實(shí)意義。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
β-葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體催化合成紅景天苷的工藝，包括β -葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體的制備和紅景天苷的合成兩個(gè)階段；
β_葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體制備階段，包括以下步驟:(1)將沉降劑加入β-葡萄糖苷酶溶液中，振蕩；
(2)再加入戊二醛；
(3)向混合液中加入硼氫化鈉,振蕩,30(T500rpm離心5~10min,收集沉淀，即為β-葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體；
紅景天苷的合成階段，包括以下步驟:
(4)將β-D-葡萄糖和對(duì)羥基苯乙醇溶解于含β-葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體的pH為
5.5飛.5的緩沖溶液中，再加入1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽和1，4-二氧六環(huán)，形成1- 丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽/1，4- 二氧六環(huán)/緩沖溶液反應(yīng)體系；
(5)密封，保持溫度為48~52°C，轉(zhuǎn)速為245~255rpm，反應(yīng)5~9d，收集反應(yīng)液；
其中，步驟(4)的1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽/1，4_ 二氧六環(huán)/緩沖溶液反應(yīng)體系中，β-D-葡萄糖與對(duì)羥基苯乙醇的摩爾比為1: f 1:3，β-葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體的單位酶活為1.3^1.6U/ml，1- 丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽與1，4- 二氧六環(huán)的體積比為2:3^3:2,緩沖溶液的體積分?jǐn)?shù)為12~18%。
[0007]步驟(1)中所述的沉降劑為1，4-二氧六環(huán)，其中1，4-二氧六環(huán)與β-葡萄糖苷酶液體積比為1.7: f 2.2:1，β-葡萄糖苷酶液含葡萄糖苷酶1.5~2.5mg/ml ;步驟(2)中戊二醛的終濃度為38~43mM，交聯(lián)時(shí)間為8~12min ;步驟(3)中硼氫化鈉的終濃度為20-25πιΜ;β-葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體制備階段整個(gè)反應(yīng)過程的反應(yīng)溫度控制在4~6°C，pH為
5.0~5.5。
[0008]本發(fā)明采用β_葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體作為合成紅景天苷的催化劑，在離子液體/有機(jī)溶劑體系中催化直接糖基化反應(yīng)成功合成紅景天苷。本發(fā)明的技術(shù)效果在于:(1)將產(chǎn)物紅景天苷的濃度提高至22g/L以上；(2)采用β -葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體作為催化劑，葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體的殘余相對(duì)酶活高，制作簡(jiǎn)單，同時(shí)，葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體通過離心即可實(shí)現(xiàn)高效回收，酶的回收作業(yè)簡(jiǎn)單、快捷；(3)降低了離子液體(1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽)的使用量，從而降低了生產(chǎn)成本。在酶催化合成紅景天苷領(lǐng)域，由于紅景天苷在糖苷酶存在下極易被水解的特性，使得提高產(chǎn)物紅景天苷的濃度變得十分困難。
[0009]本發(fā)明能夠得到如此高的產(chǎn)物紅景天苷濃度，不僅僅在于β -葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體在離子液體/有機(jī)溶劑體系中的酶催化效率高；還在于，本 申請(qǐng)人:進(jìn)行無數(shù)次試驗(yàn)，得到了紅景天苷合成過程中各個(gè)反應(yīng)條件的較佳值，最終，才使得本發(fā)明的產(chǎn)物紅景天苷濃度達(dá)到22 g/L以上，高于現(xiàn)有的國內(nèi)外所報(bào)道的最高值(18.57g/L)，并且，β-葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體的殘余相對(duì)酶活也保持在較高的水平(90%以上)，另外，葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體的制備過程中采用了 1，4-二氧六環(huán)，而離子液體1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽與沉降劑1，4-二氧六環(huán)的組合使用也產(chǎn)生了意料之外的技術(shù)效果，再加上本 申請(qǐng)人:通過對(duì)β-葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體的制備過程中各個(gè)反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，提高了 β -葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體的酶活回收率。
【具體實(shí)施方式】
[0010]根據(jù)β -葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體(簡(jiǎn)稱β -葡萄糖苷酶CLEAs )催化合成紅景天苷的工藝，進(jìn)行實(shí)施例廣實(shí)施例7。[0011]實(shí)施例1
β -葡萄糖苷酶CLEAs催化合成紅景天苷的工藝，包括β -葡萄糖苷酶CLEAs的制備和紅景天苷合成兩個(gè)階段；
β-葡萄糖苷酶CLEAs的制備階段，包括以下步驟:(I)將2.2ml 1，4-二氧六環(huán)加入Iml含β -葡萄糖苷酶1.5mg/ml的β -葡萄糖苷酶溶液中(1，4- 二氧六環(huán)與β -葡萄糖苷酶液的體積比為2.2:1)，振蕩；(2)再加入戊二醛，至其終濃度為40mM，反應(yīng)lOmin，進(jìn)行交聯(lián)；(3)向混合液中加入硼氫化鈉(NaBH4),至NaBH4的終濃度為20 mM,進(jìn)行還原，振蕩后，300rpm離心8min,收集沉淀，即為β -葡萄糖苷酶CLEAs ;整個(gè)反應(yīng)過程的反應(yīng)溫度控制在4°C, pH為5.5 ;收集沉淀，測(cè)得β -葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率為81.65%。
[0012]紅景天苷的合成階段，包括以下步驟:(4)將0.110 g β-D-葡萄糖和0.169 g對(duì)羥基苯乙醇(β-D-葡萄糖與對(duì)羥基苯乙醇的摩爾比為1:2)溶解在含β-葡萄糖苷酶CLEAs的pH為6.5的緩沖溶液中，再加入376 μ L 1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽(C4MIm.PF6)和564 μ L I, 4_ 二氧六環(huán)(C4MIm.PF6與I, 4- 二氧六環(huán)的體積比為2:3),形成C4MIm.PF6/1, 4- 二氧六環(huán)/緩沖溶液反應(yīng)體系，在C4MIm.PF6/1, 4- 二氧六環(huán)/緩沖溶液反應(yīng)體系中，β -葡萄糖苷酶CLEAs的單位酶活為1.47U/ml，緩沖溶液的體積分?jǐn)?shù)為15% ；
(5)密封，保持溫度為52°C，轉(zhuǎn)速為245~255 rpm，反應(yīng)8d，收集反應(yīng)液。測(cè)得反應(yīng)液中紅景天苷的濃度為24.52g/L ;將反應(yīng)液離心，收集沉淀，測(cè)得反應(yīng)后β -葡萄糖苷酶CLEAs的殘余相對(duì)酶活為92.07%。
[0013]β-葡萄糖苷酶CLEAs的回收處理方式為:反應(yīng)液離心后，將收集得到的葡萄糖苷酶CLEAs沉淀以緩沖溶液(pH為6.0的檸檬酸-Na2HPO4緩沖溶液)洗滌3次，再分別加入ImL緩沖溶液(pH為6.0的檸檬酸-Na2HPO4緩沖溶液)并振蕩使之成為懸濁液，取樣測(cè)定葡萄糖苷酶CLEAs的酶活。以不經(jīng)沉降劑、交聯(lián)劑處理的酶液的酶活為100%，計(jì)算β -葡萄糖苷酶CLEAs制備階段得到的β -葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率。以紅景天苷合成階段前葡萄糖苷酶的相對(duì)水解活力為100%，計(jì)算收集得到的反應(yīng)液沉淀中β-葡萄糖苷酶的殘余相對(duì)酶活。
[0014]β -葡萄糖苷酶的酶活測(cè)定方法為:分別取100 μ L待測(cè)β -葡萄糖苷酶CLEAs溶液與10 mM的2 mL對(duì)硝基苯基-β -D-葡萄糖苷(pNPG)溶液，二者混合后50°C水浴精確保溫10 min，之后立即加入I M的碳酸鈉溶液2 mL以終止反應(yīng)，振蕩均勻后室溫靜置5 min,適當(dāng)稀釋后以紫外分光光度計(jì)測(cè)定樣本在波長(zhǎng)410 nm處的吸光值，代入pNP標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算可得PNP生成量。酶活力單位定義為:每分鐘內(nèi)催化pNPG生成IymoL pNP的酶量。其中，PNP標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程為本領(lǐng)域常見的標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法，在此不做贅述。
[0015] 紅景天苷濃度的測(cè)定方法為:將含有紅景天苷的上清液，以孔徑0.45 μ m的有機(jī)濾膜過濾，濾液以甲醇稀釋一定倍數(shù)后以高效液相色譜儀對(duì)樣本中紅景天苷含量進(jìn)行測(cè)定。所測(cè)定的紅景天苷峰面積代入紅景天苷標(biāo)準(zhǔn)曲線中加以計(jì)算即可得樣本中紅景天苷濃度。其中，紅景天苷標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程為本領(lǐng)域常見的標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法，在此不做贅述。
[0016]實(shí)施例2
β -葡萄糖苷酶CLEAs催化合成紅景天苷的工藝，包括β -葡萄糖苷酶CLEAs的制備和紅景天苷合成兩個(gè)階段；
β -葡萄糖苷酶CLEAs的制備階段，包括以下步驟:(I)將1.7ml I, 4- 二氧六環(huán)加入Iml含β -葡萄糖苷酶2.5mg/ml的β -葡萄糖苷酶溶液中(1，4- 二氧六環(huán)與β -葡萄糖苷酶液的體積比為1.7:1)，振蕩；(2)再加入戊二醛，至其終濃度為38mM，反應(yīng)12min，進(jìn)行交聯(lián)；(3)向混合液中加入硼氫化鈉(NaBH4)，至NaBH4的終濃度為25mM，進(jìn)行還原，振蕩后，500rpm離心5min,收集沉淀，即為β -葡萄糖苷酶CLEAs ;整個(gè)反應(yīng)過程的反應(yīng)溫度控制在6°C,pH為5.2 ;收集沉淀，測(cè)得β -葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率為81.71%。
[0017]紅景天苷的合成階段，包括以下步驟:(4)將0.220 g β-D-葡萄糖和0.169 g對(duì)羥基苯乙醇(β-D-葡萄糖與對(duì)羥基苯乙醇的摩爾比為1:1)溶解在含葡萄糖苷酶CLEAs的pH為5.5的緩沖溶液中，再加入470 μ L C4MIm.PF6和470 μ L 1，4-二氧六環(huán)(C4MIm.PF6與I, 4- 二氧六環(huán)的體積比為1:1)，形成C4MIm.PF6/1, 4- 二氧六環(huán)/緩沖溶液反應(yīng)體系，在C4MIm.PF6/1, 4- 二氧六環(huán)/緩沖溶液反應(yīng)體系中，β _葡萄糖苷酶CLEAs的單位酶活為1.35U/ml，緩沖溶液的體積分?jǐn)?shù)為18% ; (5)密封，保持溫度為48°C，轉(zhuǎn)速為245^255 rpm,反應(yīng)9d，收集上清液。測(cè)得反應(yīng)液中紅景天苷的濃度為22.91 g/L ;將反應(yīng)液離心，收集沉淀，測(cè)得反應(yīng)后β -葡萄糖苷酶CLEAs的殘余相對(duì)酶活為90.01%。
[0018]實(shí)施例3
β -葡萄糖苷酶CLEAs催化合成紅景天苷的工藝，包括β -葡萄糖苷酶CLEAs的制備和紅景天苷合成兩個(gè)階段；
β-葡萄糖苷酶CLEAs的制備階段，包括以下步驟:(I)將2.0ml 1，4-二氧六環(huán)加入Iml含β -葡萄糖苷酶1.5mg/ml的β -葡萄糖苷酶溶液中(1，4- 二氧六環(huán)與β -葡萄糖苷酶液的體積比為2:1)，振蕩；(2)再加入戊二醛，至其終濃度為43mM，反應(yīng)8min，進(jìn)行交聯(lián)；(3)向混合液中加入硼氫化鈉(NaBH4),至NaBH4的終濃度為23 mM,進(jìn)行還原，振蕩后，300rpm離心IOmin,收集沉淀，即為β -葡萄糖苷酶CLEAs ;整個(gè)反應(yīng)過程的反應(yīng)溫度控制在4~6°C，pH為5.0 ;收集沉淀，測(cè)得β -葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率為80.59%。
`[0019]紅景天苷的合成階段，包括以下步驟:(4)將0.110 g β-D-葡萄糖和0.254 g對(duì)羥基苯乙醇(β-D-葡萄糖與對(duì)羥基苯乙醇的摩爾比為1:3)溶解在含β-葡萄糖苷酶CLEAs的pH為6.0的緩沖溶液中，再加入564 μ L C4MIm^PFdPSTeyL 1，4-二氧六環(huán)(C4MIm *PF6與1，4- 二氧六環(huán)的體積比為3:2)，形成C4MIm *PF6/1, 4- 二氧六環(huán)/緩沖溶液反應(yīng)體系，在C4MIm.PF6/1, 4- 二氧六環(huán)/緩沖溶液反應(yīng)體系中，β _葡萄糖苷酶CLEAs的單位酶活為1.64U/ml，緩沖溶液的體積分?jǐn)?shù)為12% ; (5)密封，保持溫度為50°C，轉(zhuǎn)速為250rpm,反應(yīng)5d,收集反應(yīng)液。測(cè)得反應(yīng)液中紅景天苷的濃度為24.11 g/L,離心,收集沉淀,測(cè)得反應(yīng)后β -葡萄糖苷酶CLEAs的殘余相對(duì)酶活為90.38%。
[0020]實(shí)施例4
β -葡萄糖苷酶CLEAs催化合成紅景天苷的工藝，包括β -葡萄糖苷酶CLEAs的制備和紅景天苷合成兩個(gè)階段；
β-葡萄糖苷酶CLEAs的制備階段，包括以下步驟:(I)將4.0ml 1，4-二氧六環(huán)加入Iml含β -葡萄糖苷酶1.25mg/ml的β -葡萄糖苷酶溶液中(1，4- 二氧六環(huán)與β -葡萄糖苷酶液的體積比為4:1)，振蕩；(2)再加入戊二醛，至其終濃度為30mM，反應(yīng)lOmin，進(jìn)行交聯(lián)；(3)向混合液中加入硼氫化鈉(NaBH4)，至NaBH4的終濃度為30mM，進(jìn)行還原，振蕩后，400rpm離心5min,收集沉淀，即為β -葡萄糖苷酶CLEAs ;整個(gè)反應(yīng)過程的反應(yīng)溫度控制在5°C，pH為5.0 ;收集沉淀，測(cè)得β -葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率為74.37%。[0021]紅景天苷的合成階段，包括以下步驟:(4)將0.110 g β-D-葡萄糖和0.254 g對(duì)羥基苯乙醇(β-D-葡萄糖與對(duì)羥基苯乙醇的摩爾比為1:3)溶解在含β-葡萄糖苷酶CLEAs的pH為6.0的緩沖溶液中，再加入564 μ L C4MIm^PFdPSTeyL 1，4-二氧六環(huán)(C4MIm *PF6與1，4- 二氧六環(huán)的體積比為3:2)，形成C4MIm *PF6/1, 4- 二氧六環(huán)/緩沖溶液反應(yīng)體系，在C4MIm.PF6/1, 4- 二氧六環(huán)/緩沖溶液反應(yīng)體系中，β _葡萄糖苷酶CLEAs的單位酶活為1.64U/ml，緩沖溶液的體積分?jǐn)?shù)為12% ; (5)密封，保持溫度為50°C，轉(zhuǎn)速為250rpm,反應(yīng)5d，收集反應(yīng)液。測(cè)得反應(yīng)液中紅景天苷的濃度為23.24 g/L,離心，收集沉淀，測(cè)得反應(yīng)后β -葡萄糖苷酶CLEAs的殘余相對(duì)酶活為90.62%。
[0022]實(shí)施例5
β -葡萄糖苷酶CLEAs催化合成紅景天苷的工藝，包括β -葡萄糖苷酶CLEAs的制備和紅景天苷合成兩個(gè)階段；
β -葡萄糖苷酶CLEAs的制備階段，包括以下步驟:(I)將1.5mll, 4-二氧六環(huán)加入Iml含β -葡萄糖苷酶3.0mg/ml的β -葡萄糖苷酶溶液中(1，4- 二氧六環(huán)與β -葡萄糖苷酶液的體積比為1.5:1)，振蕩；(2)再加入戊二醛，至其終濃度為20mM，反應(yīng)12min，進(jìn)行交聯(lián)；
(3)向混合液中加入硼氫化鈉(NaBH4),至NaBH4的終濃度為15mM，進(jìn)行還原，振蕩后，500rpm離心8min，收集沉淀，即為β -葡萄糖苷酶CLEAs ;整個(gè)反應(yīng)過程的反應(yīng)溫度控制在4°C，pH為5.0 ;收集沉淀，測(cè)得β -葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率為69.57%。
[0023]紅景天苷的合成階段，包括以下步驟:(4)將0.110 g β-D-葡萄糖和0.169 g對(duì)羥基苯乙醇(β-D-葡萄糖與對(duì)羥基苯乙醇的摩爾比為1:2)溶解在含β-葡萄糖苷酶CLEAs的pH為6.0的緩沖溶液中，再加入470 μ L C4MIm.PF6和470 μ L 1，4-二氧六環(huán)(C4MIm *PF6與1，4- 二 氧六環(huán)的體積比為1:1)，形成C4MIm *PF6/1, 4- 二氧六環(huán)/緩沖溶液反應(yīng)體系，在C4MIm.PF6/1, 4- 二氧六環(huán)/緩沖溶液反應(yīng)體系中，β _葡萄糖苷酶CLEAs的單位酶活為1.47U/ml，緩沖溶液的體積分?jǐn)?shù)為15% (v: v); (5)密封，保持溫度為50°C，轉(zhuǎn)速為255 rpm，反應(yīng)8d，收集反應(yīng)液。測(cè)得反應(yīng)液中紅景天苷的濃度為22.97 g/L，離心，收集沉淀，測(cè)得反應(yīng)后β -葡萄糖苷酶CLEAs的殘余相對(duì)酶活為91.32%。
[0024]實(shí)施例6
β -葡萄糖苷酶CLEAs催化合成紅景天苷的工藝，包括β -葡萄糖苷酶CLEAs的制備和紅景天苷合成兩個(gè)階段；
β -葡萄糖苷酶CLEAs的制備階段，包括以下步驟:(I)將4.0ml異丙醇加入Iml含β -葡萄糖苷酶1.25mg/ml的β -葡萄糖苷酶溶液中(1，4- 二氧六環(huán)與β -葡萄糖苷酶液的體積比為4:1)，振蕩；(2)再加入戊二醛，至其終濃度為30mM，反應(yīng)lOmin，進(jìn)行交聯(lián)；(3)向混合液中加入硼氫化鈉(NaBH4),至NaBH4的終濃度為30mM，進(jìn)行還原，振蕩后，400rpm離心5min，收集沉淀，即為β-葡萄糖苷酶CLEAs ;整個(gè)反應(yīng)過程的反應(yīng)溫度控制在5 °C，pH為
5.0 ;收集沉淀，測(cè)得β -葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率為72.53%。
[0025]紅景天苷的合成階段，包括以下步驟:(4)將0.110 g β-D-葡萄糖和0.254 g對(duì)羥基苯乙醇(β-D-葡萄糖與對(duì)羥基苯乙醇的摩爾比為1:3)溶解在含β-葡萄糖苷酶CLEAs的pH為6.0的緩沖溶液中，再加入564 μ L C4MIm^PFdPSTeyL 1，4-二氧六環(huán)(C4MIm *PF6與1，4- 二氧六環(huán)的體積比為3:2)，形成C4MIm *PF6/1, 4- 二氧六環(huán)/緩沖溶液反應(yīng)體系，在C4MIm.PF6/!, 4- 二氧六環(huán)/緩沖溶液反應(yīng)體系中，β _葡萄糖苷酶CLEAs的單位酶活為1.64U/ml，緩沖溶液的體積分?jǐn)?shù)為12% ; (5)密封，保持溫度為50°C，轉(zhuǎn)速為250rpm,反應(yīng)5d，收集反應(yīng)液。測(cè)得反應(yīng)液中紅景天苷的濃度為22.01 g/L,離心，收集沉淀，測(cè)得反應(yīng)后β -葡萄糖苷酶CLEAs的殘余相對(duì)酶活為89.12%。
[0026]實(shí)施例7
β -葡萄糖苷酶CLEAs催化合成紅景天苷的工藝，包括β -葡萄糖苷酶CLEAs的制備和紅景天苷合成兩個(gè)階段；
β-葡萄糖苷酶CLEAs的制備階段，包括以下步驟:(I)將1.5ml 1，4-二氧六環(huán)加入Iml含β -葡萄糖苷酶3.0mg/ml的β -葡萄糖苷酶溶液中(1，4- 二氧六環(huán)與β -葡萄糖苷酶液的體積比為1.5:1)，振蕩；(2)再加入戊二醛，至其終濃度為20mM，反應(yīng)8min，進(jìn)行交聯(lián)；(3)向混合液中加入硼氫化鈉(NaBH4)，至NaBH4的終濃度為15mM，進(jìn)行還原，振蕩后，400rpm離心5min,收集沉淀，即為β -葡萄糖苷酶CLEAs ;整個(gè)反應(yīng)過程的反應(yīng)溫度控制在6°C，pH為5.0 ;收集沉淀，測(cè)得β -葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率為69.57% ；
紅景天苷的合成階段，包括以下步驟:(4)將0.110 g β-D-葡萄糖和0.169 g對(duì)羥基苯乙醇(β-D-葡萄糖與對(duì)羥基苯乙醇的摩爾比為1:2)溶解在含β-葡萄糖苷酶CLEAs的pH為6.0的緩沖溶液中，再加入855 μ L C4MIm.PF6和85 μ L I，4-二氧六環(huán)(C4MIm.PF6與1，4- 二氧六環(huán)的體 積比為10:1)，形成C4MIm.PF6/1, 4- 二氧六環(huán)/緩沖溶液反應(yīng)體系，在C4MIm.ΡΡ6/1，4- 二氧六環(huán)/緩沖溶液反應(yīng)體系中，β _葡萄糖苷酶CLEAs的單位酶活為
1.47U/ml，緩沖溶液的體積分?jǐn)?shù)為15% ;(5)密封，保持溫度為50°C，轉(zhuǎn)速為250 rpm，反應(yīng)8d，收集反應(yīng)液。測(cè)得反應(yīng)液中紅景天苷的濃度為18.31 g/L，離心，收集沉淀，測(cè)得β-葡萄糖苷酶CLEAs的殘余相對(duì)酶活為87.43%。
[0027]上述實(shí)施例7的步驟(4)中的C4MIm *PF6: 1，4_ 二氧六環(huán)為10:1 (V: V),遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于實(shí)施例1飛的步驟(4)中C4MIm.PF6/1, 4-二氧六環(huán)(V: V)的比值,而對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，一般認(rèn)為C4MIm -PF6的濃度越高，底物的溶解性越好，糖苷酶(即β -葡萄糖苷酶)的熱穩(wěn)定性或是有機(jī)溶劑耐受性就越好，因此，產(chǎn)物紅景天苷的濃度也就越高，因此，現(xiàn)有技術(shù)中C4MIm.PF6: 1，4-二氧六環(huán)均在4:1 (v: V)以上,但是,本 申請(qǐng)人:突破常規(guī)思維，降低了 C4MIm ^PF6所占的比例，得到了未意料到的技術(shù)效果，不僅提高了產(chǎn)物紅景天苷的濃度，維持了較高的葡萄糖苷酶CLEAs的殘余相對(duì)酶活，并且，還大大降低了生產(chǎn)成本。另外，實(shí)施例6與實(shí)施例4的不同之處在于:步驟(1)中沉降劑為異丙醇，而非實(shí)施例4的1，4- 二氧六環(huán)，從實(shí)施例6與實(shí)施例4的試驗(yàn)結(jié)果可看出:在其他條件不變的情況下，選用1，4-二氧六環(huán)作為沉降劑時(shí)，β-葡萄糖苷酶CLEAs的酶活回收率更高，并且，由于在葡萄糖苷酶CLEAs的制備階段中，β-葡萄糖苷酶對(duì)1，4-二氧六環(huán)產(chǎn)生了耐受，使得實(shí)施例4中所得到的反應(yīng)液的紅景天苷濃度和β -葡萄糖苷酶CLEAs的殘余相對(duì)酶活相對(duì)于實(shí)施例6分別提高了 1.23 g/L和1.5%。
[0028]本發(fā)明能夠得到如此高的產(chǎn)物紅景天苷濃度，不僅僅在于β -葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體在離子液體/有機(jī)溶劑體系中的酶催化效率高；還在于，本 申請(qǐng)人:進(jìn)行無數(shù)次的試驗(yàn)，得到了紅景天苷合成過程中各個(gè)反應(yīng)條件的較佳值，最終，才使得本發(fā)明的產(chǎn)物紅景天苷濃度達(dá)到22 g/L以上，高于現(xiàn)有的國內(nèi)外所報(bào)道的最高值(18.57g/L)，并且，β-葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體的殘余相對(duì)酶活也保持在較高的水平(89%以上)；另外，β-葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體的制備過程中采用了 1，4-二氧六環(huán)，而離子液體1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽與沉降劑1，4-二氧六環(huán)的組合使用也產(chǎn)生了意料之外的技術(shù)效果；再加上本 申請(qǐng)人:通過對(duì)β_葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體的制備過程中各個(gè)反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，提高了 β_葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體的酶活回收率。
[0029]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范·圍。
【權(quán)利要求】
1.β-葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體催化合成紅景天苷的工藝，其特征在于:包括β-葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體的制備和紅景天苷的合成兩個(gè)階段； β -葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體制備階段，包括以下步驟: (1)將沉降劑加入β-葡萄糖苷酶溶液中，振蕩； (2)再加入戊二醛； (3)向混合液中加入硼氫化鈉,振蕩,30(T500rpm離心5~10min,收集沉淀，即為β-葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體； 紅景天苷的合成階段，包括以下步驟: (4)將β-D-葡萄糖和對(duì)羥基苯乙醇溶解于含β-葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體的pH為5.5飛.5的緩沖溶液中，再加入1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽和1，4-二氧六環(huán)，形成1- 丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽/1，4- 二氧六環(huán)/緩沖溶液反應(yīng)體系； (5)密封，保持溫度為48~52°C，轉(zhuǎn)速為245~255rpm，反應(yīng)5~9d，收集反應(yīng)液； 其中，步驟(4)的1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽/1，4_ 二氧六環(huán)/緩沖溶液反應(yīng)體系中，β-D-葡萄糖與對(duì)羥基苯乙醇的摩爾比為1: f 1:3，β-葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體的單位酶活為1.3^1.6U/ml，1- 丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽與1，4- 二氧六環(huán)的體積比為2:3^3:2,緩沖溶液的體積分?jǐn)?shù)為12~18%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種β_葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體催化合成紅景天苷的工藝，其特征在于:步驟(1)中所述的沉降劑為1，4-二氧六環(huán)，其中1，4-二氧六環(huán)與β-葡萄糖苷酶液體積比為1.7: f 2.2:1，β-葡萄糖苷酶液含葡萄糖苷酶1.5~2.5mg/ml ;步驟(2)中戊二醛的終濃度為38~43mM，交聯(lián)時(shí)間為8~12min ;步驟(3)中硼氫化鈉的終濃度為20-25 πΜ；β-葡萄糖苷酶交聯(lián)聚集體制備階段整個(gè)反應(yīng)過程的反應(yīng)溫度控制在4-6?，pH為 5.0~5.5。
【文檔編號(hào)】C12P19/44GK103710412SQ201310664189
【公開日】2014年4月9日 申請(qǐng)日期:2013年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月11日
【發(fā)明者】石賢愛, 薛原楷 申請(qǐng)人:福州大學(xué)