一種用于改良玉米株型和提高玉米產(chǎn)量的基因的獲得方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及植物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，提供了一種用于改良玉米株型和提高玉米產(chǎn)量的基因：玉米細(xì)胞色素氧化酶基因ZmCYP72A，該基因擴(kuò)增自玉米葉片cDNA中，用包含該ZmCYP72A基因的全長片段的DNA序列構(gòu)建過表達(dá)載體，然后將ZmCYP72A基因過表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株，并用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法侵染玉米幼胚，建立了轉(zhuǎn)基因玉米株系。發(fā)明人進(jìn)一步培育后將轉(zhuǎn)基因玉米株系與野生型植株進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)利用該基因所得的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物具有生育期縮短、株型矮小、產(chǎn)量提高等表型，該轉(zhuǎn)基因陽性植株應(yīng)用于生產(chǎn)，改良成熟期、株型、產(chǎn)量等重要農(nóng)藝性狀，用于提高作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，具有重要的經(jīng)濟(jì)價值和社會效益。
【專利說明】—種用于改良玉米株型和提高玉米產(chǎn)量的基因的獲得方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，提供了一種用于改良玉米株型和提高玉米產(chǎn)量的基因的獲得方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]玉米是集糧食、飼料、工業(yè)加工等多種用途于一身的重要作物，其轉(zhuǎn)基因技術(shù)始于1986年(Fromm et al.，Nature, 319:791-793)。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的深入發(fā)展和全基因組測序的完成，玉米已經(jīng)成為基礎(chǔ)性和應(yīng)用性研究的重要單子葉模式作物。近些年來，由于世界人口數(shù)量增加及畜牧產(chǎn)業(yè)和玉米加工產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，全球玉米需求量劇增，提高玉米產(chǎn)量成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和社會經(jīng)濟(jì)的迫切需要。[0003]植物CYP450按照功能主要分為兩大類，生物合成方面主要參與了植物木質(zhì)素中間物、植物激素、留醇、萜類、黃酮類、異黃酮和呋喃香豆素等物質(zhì)的合成。代謝方面則主要是將有毒物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o毒物質(zhì)，包括環(huán)境毒素、農(nóng)藥、有機(jī)染料等(Brazier et al.Phytochem.2002，59:149-156; Chappie, Annu.Rev.Plant Biol.1998，49:311-343)。細(xì)胞色素 P450在植物次生代謝、合成及解毒等方面具有復(fù)雜而廣泛的功能，并且參與激素類物質(zhì)的代謝過程。CYP72是研究較早的一個P450家族，Irmler等發(fā)現(xiàn)(Plant J.2000，24:797-804)CYP72A1能催化吲哚生物堿合成途徑的早期步驟，即由馬錢苷轉(zhuǎn)化為次番木鱉苷的過程。450基因往往以基因簇的形式參與到吲哚生物堿對植物生長發(fā)育和抗逆活動中，這可能與他們的協(xié)同作用有關(guān)(Chappie, Annu.Rev.Plant Biol.1998，49:311-343)。CYP71C家族有4個成員(CYP71C1-4)串聯(lián)形成一個家簇共同作用于玉米重要次生防御物質(zhì)DMBOA (2，4-二羥基-7-甲氧基-1,4-苯并噁嗪-3-酮)合成途徑(Frey et al.Mol.Gen.Genet.1995，246:100-109;Frey et al.Sc1.1997，277:696-699;Baitey et al.PlantPhysiol.1991，95:792-796)。因此如何更好的利用植物CYP450為玉米的轉(zhuǎn)基因開拓新的領(lǐng)域成為本領(lǐng)域的研究方向，特別是如何實現(xiàn)玉米植株的改良和產(chǎn)量的提高，成為亟待解決的問題之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的發(fā)明人針對上述現(xiàn)有技術(shù)的情況，結(jié)合長期研究和探索，提供了一種用于改良玉米株型和提高玉米產(chǎn)量的基因，該基因為玉米細(xì)胞色素氧化酶基因ZmCYP72A，該基因擴(kuò)增自玉米葉片cDNA中，用包含該ZmCYP72A基因的全長片段的DNA序列構(gòu)建過表達(dá)載體，然后將ZmCYP72A基因過表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株，并用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法侵染玉米幼胚，建立了轉(zhuǎn)基因玉米株系。發(fā)明人進(jìn)一步培育后將轉(zhuǎn)基因玉米株系與野生型植株進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)利用該基因所得的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物具有生育期縮短、株型矮小、產(chǎn)量提高等表型，該轉(zhuǎn)基因陽性植株應(yīng)用于生產(chǎn)，改良成熟期、株型、產(chǎn)量等重要農(nóng)藝性狀，用于提高作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，具有重要的經(jīng)濟(jì)價值和社會效益。[0005]發(fā)明人提供一種用于改良玉米株型和提高玉米產(chǎn)量的基因，該基因含有一個保守的P450結(jié)構(gòu)域，屬于CYP450超家族72A亞家族，因此命名為ZmCYP72A基因，其核苷酸序列如SED IDNO:1所示，該基因全長為1584bp，氨基酸序列如SED ID NO: 2所示，編碼527個氨基酸。
[0006]該基因從玉米自交系齊319的葉片cDNA中擴(kuò)增獲得，其具體步驟如下:
[0007]1.玉米RNA的提取和純化 [0008]2cDNA第一鏈的合成
[0009]3ZmCYP72A基因的克隆
[0010]以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，采用以下引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增:
[0011]上游引物:5’-GTGGATCCTGCGGTCAGTAACGAAAGT-3，如 SEQ ID NO:3 所示
[0012]下游引物:5’-GTGGATCCCAAGCCGCCACCAATGGC-3，如 SEQ ID NO:4 所示
[0013]其中劃橫線部分為BamHI酶切位點(diǎn)；
[0014]PCR擴(kuò)增體系為I μ I上游引物(50pmol/μ L), I μ I下游引物(50pmol/μ L),5 μ 110XPCR buffer, 5 μ I dNTP 混合液(10mmol/L)，0.5 μ I Taq DNA 聚合酶(5U)，4 μ IcDNA模板，加ddH20將總體積補(bǔ)充至50 μ I ;
[0015]擴(kuò)增條件為:94°C預(yù)變性3分鐘；94°C變性I分鐘，60°C退火I分鐘，72°C延伸1.5分鐘，循環(huán)33次；72°C延伸10分鐘。
[0016]取4 μ I PCR產(chǎn)物與pMD19-T Simple載體連接，操作步驟按照TaKaRa公司產(chǎn)品pMD19-TSimple Vector說明書進(jìn)行。然后連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，在含有氨芐青霉素(100mg/L)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜。挑取白色菌落，在含有氨芐青霉素(100mg/L)的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。堿法提取質(zhì)粒DNA，酶切鑒定后進(jìn)行序列測定。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序分析，其序列如SEQ ID N0:1所示，表明擴(kuò)增產(chǎn)物為ZmCYP72A基因。
[0017]現(xiàn)有技術(shù)中也有該基因家族其他成員的研究，但是其主要側(cè)重于該類基因在植物次生代謝、合成及解毒等方面的應(yīng)用，并未發(fā)現(xiàn)其具有與本發(fā)明類似的功能，發(fā)明人認(rèn)為這與本發(fā)明的基因與現(xiàn)有基因功能具有較大的不同有關(guān)。
[0018]獲得上述的目標(biāo)基因后，發(fā)明人利用其構(gòu)建了植物表達(dá)載體pZP21 IUB1::ZmCYP72A，該載體為利用限制性內(nèi)切酶BamHI酶切擴(kuò)增得到的ZmCYP72A基因DNA片段，并將其連接在pZP211::UBI空表達(dá)載體獲得；發(fā)明人進(jìn)一步利用獲得的該載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。
[0019]最后發(fā)明人利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化玉米幼胚，并最終篩選獲得了具有抗性的植株，并最終驗證發(fā)現(xiàn)該植株具有生育期縮短、株型矮小、產(chǎn)量提高等表型，該轉(zhuǎn)基因陽性植株應(yīng)用于生產(chǎn)，改良成熟期、株型、產(chǎn)量等重要農(nóng)藝性狀，用于提高作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，具有重要的經(jīng)濟(jì)價值和社會效益。
[0020]上述步驟中，玉米RNA的提取和純化可直接采用現(xiàn)有工藝，也可采用本發(fā)明中所記載的工藝；cDNA第一鏈的合成的也是相同的情況，也可以采用現(xiàn)有的工藝或者試劑盒，但是上述兩者均優(yōu)選采用本發(fā)明所記載的具體工藝。
[0021]綜上所述，本發(fā)明的發(fā)明人首次提供了一種用于改良玉米株型和提高玉米產(chǎn)量的基因:玉米細(xì)胞色素氧化酶基因ZmCYP72A，利用包含該ZmCYP72A基因的全長片段的DNA序列構(gòu)建過表達(dá)載體，然后將ZmCYP72A基因過表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株，并用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法侵染玉米幼胚，建立了轉(zhuǎn)基因玉米株系。發(fā)明人進(jìn)一步培育后將轉(zhuǎn)基因玉米株系與野生型植株進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)利用該基因所得的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物具有生育期縮短、株型矮小、產(chǎn)量提高等表型，該轉(zhuǎn)基因陽性植株應(yīng)用于生產(chǎn)，改良成熟期、株型、產(chǎn)量等重要農(nóng)藝性狀，用于提高作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，具有重要的經(jīng)濟(jì)價值和社會效益。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為植物表達(dá)載體pZP211UB1::ZmCYP72A載體結(jié)構(gòu)圖；
[0023]圖2為轉(zhuǎn)基因玉米植株的獲得過程示意圖，
[0024]圖中A為轉(zhuǎn)基因愈傷組織在篩選培養(yǎng)基的梯度篩選；B為愈傷組織分化候選轉(zhuǎn)基因幼苗；C為候選轉(zhuǎn)基因植株煉苗；D為候選轉(zhuǎn)基因植株移栽育苗基質(zhì)；E為候選轉(zhuǎn)基因植株溫室種植；
[0025]圖3為候選轉(zhuǎn)基因植株的PCR特異性擴(kuò)增結(jié)果示意圖，
[0026]圖中A為篩選標(biāo)記基因NPTII的檢測結(jié)果，B為目的基因ZmCYP72A的檢測結(jié)果；其中，M表示分子量標(biāo)記，PC表示陽性質(zhì)粒，WT表示野生型對照，L表示候選轉(zhuǎn)基因植株；
[0027]圖4為候選轉(zhuǎn)基因植株的實時定量PCR檢測結(jié)果，
[0028]其中，WT表示野生型植株，L表示候選轉(zhuǎn)基因植株；
[0029]圖5為候選轉(zhuǎn)基因植株的Southern雜交結(jié)果，
[0030]其中，PC表示陽性質(zhì)粒，WT表示野生型對照，NC表示陰性對照，L表示候選轉(zhuǎn)基因植株；
[0031]圖6為陽性轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株的株型對比示意圖，
`[0032]圖中左側(cè)WT為野生型植株和右側(cè)L38為陽性轉(zhuǎn)基因植株；
[0033]圖7為陽性轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株株高的數(shù)據(jù)統(tǒng)計數(shù)據(jù)圖，
[0034]圖中A為株高的數(shù)據(jù)統(tǒng)計，B為穗位高度的數(shù)據(jù)統(tǒng)計；C為莖周長的數(shù)據(jù)統(tǒng)計山為棒三葉葉面積的數(shù)據(jù)統(tǒng)計，D中每組柱狀圖從左至右依次為穗下位葉，穗位葉和穗上位葉；
[0035]其中，WT表示野生型對照，L表示候選轉(zhuǎn)基因植株；
[0036]圖8為陽性轉(zhuǎn)基因植株生育期表型示意圖，
[0037]圖中標(biāo)尺左側(cè)野生型植株，標(biāo)尺右側(cè)為陽性轉(zhuǎn)基因植株，可見陽性轉(zhuǎn)基因植株成熟速率明顯加快；
[0038]圖9為陽性轉(zhuǎn)基因植株綠葉面積的數(shù)據(jù)統(tǒng)計圖，
[0039]其中，WT表示野生型對照，L表示候選轉(zhuǎn)基因植株；
[0040]圖10為陽性轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株考種數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析示意圖；考種數(shù)據(jù)包括穗長、穗粗、穗粒數(shù)、千粒重、單穗產(chǎn)量等，星號表示差異顯著(T檢驗，P〈0.05)，其中，WT表示野生型對照，L表示候選轉(zhuǎn)基因植株。
【具體實施方式】
[0041]以下實施例中進(jìn)一步定義本發(fā)明，根據(jù)以上的描述和這些實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對本發(fā)明作出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件；其中本發(fā)明將上述表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞中，導(dǎo)入方法都是本領(lǐng)域人員熟知的，這些方法包括但不僅限于:農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法、基因槍法、電激法、子房注射法等。本發(fā)明所用選擇標(biāo)記基因為新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(NPTII)，可進(jìn)一步包括其它選擇標(biāo)記基因和報告基因。本發(fā)明選用的篩選抗生素為巴龍霉素，選用卡那霉素和G418等抗生素也可起到相同篩選效果；除此之外，本發(fā)明所采用的均為本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)。
[0042]實施例1、ZmCYP72A基因克隆及植物表達(dá)載體構(gòu)建
[0043]1.1玉米RNA的提取和純化
[0044]取2_3g新鮮的玉米自交系齊319材料在液氮中研磨，迅速將研磨好的樣品移入15mlCTAB 提取液中(2% (ff/V) CTAB,2% (ff/V) PVP, IOOmM Tris-HCl (pH8.0),25mM EDTA,
2.0M NaCl，2% (ff/V) β -巰基乙醇，0.5g/L亞精胺)，立即渦旋震蕩30s，65°C水浴片刻，加與CTAB提取液等體積的氯仿:異戊醇的混合物，其中氯仿:異戊醇的體積比為24:1，振蕩混勻；室溫下1000Orpm離心15分鐘，轉(zhuǎn)移上清液到另一干凈管中，加入與上清液等體積的氯仿:異戊醇混合物(體積比24:1)混勻靜置，重復(fù)抽提一次，室溫下1000Orpm離心15分鐘，轉(zhuǎn)移水相到另一離心管中。根據(jù)溶液體積加入8M LiCl，使LiCl終濃度為2M，4°C過夜沉淀(最多16小時)。4°C離心20分鐘，去掉上清液，用500 μ 170%乙醇漂洗沉淀，用500 μ I SSTE液(1.0M NaCl,0.5% (ff/V) SDS, IOmM Tris-HCl (ρΗ8.0), ImM EDTA (ρΗ8.0))溶解沉淀，將溶液轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，加入等體積的氯仿:異戊醇混合物(體積比24:1)，再抽提一次。上清液中加入2倍體積的乙醇，_70°C沉淀30分鐘或_20°C沉淀2小時，4°C 12000rpm離心20分鐘，沉淀DNA，先用400 μ 170%乙醇漂洗沉淀，再加入400 μ 1100%乙醇漂洗沉淀，干燥沉淀后，用50 μ I DEPC ddH20溶解沉淀。
[0045]為確保RNA質(zhì)量達(dá)到測序要求，分別使用分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測純化后的RNA樣品純度和濃度，其中純度和濃度標(biāo)準(zhǔn)為:RNA純度為0D260/280和0D260/230均在1.8-2.0范圍內(nèi)，RNA濃 度在1.0-2.0 μ g/ μ I范圍內(nèi)。
[0046]1.2cDNA第一鏈的合成
[0047]在0.2ml DEPC處理的離心管中順序加入Iu 150 μ M Oligo dT Primer和15.5 μ I總RNA，70°C變性6分鐘，迅速冰浴10分鐘。在上述離心管中順序加入2 μ I dNTPMixture (IOmM),5 μ 15XPrimerScript Buffer,0.5 μ I RNase Inhibitor (40U),I μ IPrimerScript RTase (200U)，加 DEPC-H20 至 25 μ I。在 PCR 儀上運(yùn)行程序為 25°C，10 分鐘；42°C,90分鐘；95°C，5分鐘。程序結(jié)束后，樣品于_80°C凍存待用。
[0048]1.3ZmCYP72A 基因的克隆
[0049]以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，采用以下引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增:
[0050]上游引物:5’-GTGGATCCTGCGGTCAGTAACGAAAGT-3，如 SEQ ID NO:3 所示
[0051]下游引物:5’-GTGGATCCCAAGCCGCCACCAATGGC-3，如 SEQ ID NO:4 所示
[0052]劃橫線部分為BamHI酶切位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增體系為1μ I上游引物(50pmol/μ L)，I μ I 下游引物(50ρ--θ1/μ υ，5μ 110XPCR buffer, 5 μ I dNTP 混合液(10mmol/L)，0.5 μ ITaqDNA聚合酶(5υ)，4μ I cDNA模板，加ddH20將總體積補(bǔ)充至50 μ I。擴(kuò)增條件為:94°C預(yù)變性3分鐘；94°C變性I分鐘，60°C退火I分鐘，72°C延伸1.5分鐘，循環(huán)33次；72°C延伸10分鐘。
[0053]取4 μ I PCR產(chǎn)物與pMD19-T Simple載體連接，操作步驟按照TaKaRa公司產(chǎn)品pMD19-TSimple Vector說明書進(jìn)行。然后連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，在含有氨芐青霉素(lOOmg/L)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜。挑取白色菌落，在含有氨芐青霉素(100mg/L)的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。堿法提取質(zhì)粒DNA，酶切鑒定后進(jìn)行序列測定。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序分析，其序列如SEQ ID N0:1所示，表明擴(kuò)增產(chǎn)物為ZmCYP72A基因。
[0054]1.4 植物表達(dá)載體 pZP211UB1:: ZmCYP72A 的構(gòu)建
[0055]用限制性內(nèi)切酶BamHI酶切擴(kuò)增得到的ZmCYP72A基因的DNA片段；用BamHI單酶切PZP211::UBI空表達(dá)載體，二者均通過電泳檢測并回收目的片段。利用T4連接酶連接酶切后的片段，操作步驟按照Fermentas公司產(chǎn)品T4DNA Iigase說明書進(jìn)行。然后連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，在含有壯觀霉素(50mg/L)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜。挑取白色菌落，在含有壯觀霉素(50mg/L)的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。堿法提取質(zhì)粒DNA并進(jìn)行酶切鑒定。將酶切鑒定正確的表達(dá)載體PZP211UB1::ZmCYP72A轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞，并獲得可供轉(zhuǎn)化使用的農(nóng)桿菌菌株。本發(fā)明采用的是電擊法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。
[0056]實施例2、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米幼胚轉(zhuǎn)化及抗性植株的獲得
[0057]侵染前一天挑取農(nóng)桿菌(攜帶重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌單菌落)接種于含有50mg/L壯觀霉素的YEP培養(yǎng)基中，28°C，220rpm搖菌過夜，第二天一早沉淀并用AB誘導(dǎo)培養(yǎng)基重懸，培養(yǎng)5小時后沉淀菌體，侵染液重懸菌體備用。
[0058]收集自交系齊319授粉后10-13d的幼胚(長度在1.0mm-1.5mm之間)放在預(yù)侵染培養(yǎng)基中，收集完全后，2700rpm離心5秒，棄去培養(yǎng)基，加預(yù)侵染培養(yǎng)基2ml重新懸浮，2700rpm離心5秒，46°C水浴3分鐘，冰浴I分鐘，2700rpm離心5秒，棄去培養(yǎng)基。加2ml預(yù)侵染培養(yǎng)基，4°C 2700rpm離心IOmin,棄去培養(yǎng)基,加入Iml農(nóng)桿菌懸浮菌液到離心管中，2700rpm離心30s,室溫放置5min。
[0059]將侵染的幼胚轉(zhuǎn)移至帶濾紙的滅菌空培養(yǎng)皿中，吸干菌液后轉(zhuǎn)移至共培養(yǎng)培養(yǎng)基中28°C暗培養(yǎng)3天，移至梯度篩選培養(yǎng)基中(見圖2A)，每2周更換一次培養(yǎng)基，梯度篩選3次(巴龍霉素三個濃度梯 度分別為25mg/L、50mg/L、100mg/L);篩選后的愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基(見圖2B)。2周后，將分化得到的幼苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基(見圖2C)，將長出3根以上壯根的幼苗煉苗(見圖2D)，經(jīng)過7天左右的煉苗期后，移栽至溫室(見圖2E)。
[0060]本實施例中的預(yù)侵染培養(yǎng)基為添加了 1.5mg/L2, 4-D的MS培養(yǎng)基(Murashige andSkoog, 1962)，篩選培養(yǎng)基為添加了 2.0mg/L2，4-D的N6培養(yǎng)基(朱志清等，1974)，其中的2，4-D為2，4- 二氯苯氧乙酸。
[0061]實施例3、候選轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測
[0062]3.1候選轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測
[0063]米用CTAB法(Sambrook and Russell,分子克隆實驗指南,2001)提取轉(zhuǎn)基因玉米植株基因組DNA，分別設(shè)計引物檢測標(biāo)記基因NPTII和目的基因ZmCYP72A，引物對序列如下:
[0064]標(biāo)記基因NPTII基因引物對如下:
[0065]上游引物:5’-GTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTG-3’，如 SEQ ID NO:5 所示；
[0066]下游引物:5’-AGCTCTTCAGCAATATCACGGGTAGC-3’，如 SEQ ID NO:6 所示；
[0067]標(biāo)記基因NPTII擴(kuò)增序列長度為650bp，擴(kuò)增條件:擴(kuò)增條件為:94°C預(yù)變性5分鐘；94°C變性I分鐘，59°C退火I分鐘，72°C延伸50秒，循環(huán)35次；72°C延伸10分鐘。
[0068]目的基因ZmCYP72A引物對如下:[0069]上游引物:5’-TTTAGCCCTGCCTTCATACG-3’，如 SEQ ID NO:7 所示；
[0070]下游引物:5’-ACTTTCGTTACTGACCGCA-3’，如 SEQ ID NO:8 所示；
[0071]目的基因ZmCYP72A擴(kuò)增序列長度為660bp，擴(kuò)增條件:擴(kuò)增條件為:94°C預(yù)變性3分鐘；94°C變性I分鐘，61°C退火I分鐘，72°C延伸50秒，循環(huán)35次；72°C延伸10分鐘
[0072]如圖3中A所示為對篩選標(biāo)記基因NPT II基因的檢測結(jié)果，該基因擴(kuò)增序列長度為650bp ;圖3中B為目的基因ZmCYP72A的檢測結(jié)果，擴(kuò)增序列長度為660bp。
[0073]3.2利用Southern雜交技術(shù)對候選轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行鑒定
[0074]以候選轉(zhuǎn)基因植株功能期葉片為實驗材料，參照CTAB法提取總基因組DNA，按照Roche公司地高辛試劑盒的說明書步驟進(jìn)行Southern雜交檢測,檢測結(jié)果如圖5所示，WT(野生型對照)中只能檢測到一條內(nèi)源帶，部分轉(zhuǎn)基因株系L65、L47、L38中內(nèi)源帶和目的基因ZmCYP72A均能檢測到，目的基因ZmCYP72A為單拷貝插入，確定為陽性轉(zhuǎn)基因植株。
[0075]檢測探針引物對序列為:
[0076]上游引物:5’-AATGGCAAGAGAGAGCAAG-3’，如 SEQ ID NO:9 所示；
[0077]下游引物:5’-GCGGTCAGTAACGAAAGTA-3’，如 SEQ ID NO:10 所示；
[0078]3.3實時定量PCR分析ZmCYP72A基因在陽性轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)水平
[0079]提取分子檢測為陽性轉(zhuǎn)基因植株的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。
[0080]設(shè)計內(nèi)參基因Actin的引物，標(biāo)定內(nèi)參。
[0081]上游引物:5’-GCCACCGATCCAGAC`ACTGTACTTCC-3’，如 SEQ ID NO:11 所示；
[0082]下游引物:5’-ATTCAGGTGATGGTGTGAGCCACAC-3’，如 SEQ ID NO:12 所示；
[0083]設(shè)計目的基因的檢測引物:
[0084]上游引物:5’-CTCCCAATGCGGTTACTCC-3’，如 SEQ ID NO:13 所示；
[0085]下游引物:5’-CTATCGTTCACCTGGTTCGG-3’，如 SEQ ID NO:14 所示；
[0086]擴(kuò)增條件:94°C預(yù)變性3分鐘；94°C變性15s, 56 °C (Actin基因)或63 °C (巨的基因)退火30秒，72°C延伸30秒，40個循環(huán)；95°C變性15秒，60°C退火30秒，95°C延伸15秒，繪制曲線。
[0087]由圖4結(jié)果可以看出，陽性轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)ZmCYP72A基因的表達(dá)量均高于野生型植株，說明ZmCYP72A基因不僅整合到陽性轉(zhuǎn)基因植株的基因組內(nèi)，而且在陽性轉(zhuǎn)基因玉米體內(nèi)轉(zhuǎn)錄水平得到有效表達(dá)。
[0088]實施例4、陽性轉(zhuǎn)基因植株的表型分析和考種數(shù)據(jù)
[0089]使用卷尺測量授粉10天的陽性轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株的高度(圖6)，并統(tǒng)計株高(圖7A)、穗位高(圖7B)、莖周長(圖7C)、棒三葉葉面積(圖7D)等相關(guān)表型數(shù)據(jù)。由圖7可以看出，陽性轉(zhuǎn)基因植株株高和穗位高明顯降低，莖周長和棒三葉葉面積均略有降低。
[0090]觀察陽性轉(zhuǎn)基因植株生育期表型示意圖(圖8)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株(標(biāo)尺右側(cè))頂部3-4片葉呈現(xiàn)綠色，三分之一葉尖處干枯，同一生長時期的野生型(標(biāo)尺左側(cè))植株底部3-4片葉完全干枯，其余部位大都呈現(xiàn)綠色，可見陽性轉(zhuǎn)基因植株成熟速率明顯加快。
[0091]陽性轉(zhuǎn)基因植株綠葉面積的數(shù)據(jù)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)(圖9)，生育期第102天-105天(葉片開始衰老)，轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株的綠葉面積百分比基本相同，隨著植株生育期的延長，轉(zhuǎn)基因植株中綠葉面積百分比下降迅速，觀察發(fā)現(xiàn)陽性轉(zhuǎn)基因植株成熟速率明顯加快，與野生型相比差異顯著，但轉(zhuǎn)基因植株間比較差異不明顯?？傮w來說，轉(zhuǎn)基因植株生育期比野生型植株生育期提前3天。
[0092]對玉米果穗的穗長、穗粗、穗粒數(shù)、千粒重和單穗產(chǎn)量等性狀進(jìn)行測定，并統(tǒng)計結(jié)果(圖10)。陽性轉(zhuǎn)基因玉米果穗穗長顯著增長，穗粗基本不變，轉(zhuǎn)基因植株的單穗穗粒數(shù)相比于野生型增多26.3%。雖然陽性轉(zhuǎn)基因植株的千粒重相比于野生型有所降低，但是單穗產(chǎn)量卻有一定的提高，總體來說，陽性轉(zhuǎn)基因植株比野生型具有更高的產(chǎn)量和更高的應(yīng)用價值。
[0093]除此之外本發(fā)明中ZmCYP72A基因及含有該基因的植物表達(dá)載體也可以用于生產(chǎn)其它可以改良農(nóng)藝性狀的轉(zhuǎn)基因植物，如小麥、水稻、高粱等作物，包括此類轉(zhuǎn)基因植物的器官、組織、細(xì)胞及其 種子和后代。
【權(quán)利要求】
1.玉米細(xì)胞色素氧化酶基因ZmCYP72A在改良玉米株型和提高玉米產(chǎn)量的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，利用該基因獲得一種植物表達(dá)載體PZP211UB1::ZmCYP72A。
3.一種用于改良玉米株型和提高玉米產(chǎn)量的基因，其特征在于，該基因為玉米細(xì)胞色素氧化酶基因ZmCYP72A，其核苷酸序列如SED ID NO:1所示，其編碼的氨基酸序列如SED IDNO:2所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于:所述的基因從玉米自交系齊319的葉片cDNA中擴(kuò)增獲得。
【文檔編號】C12N15/82GK103627716SQ201310653350
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年12月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月6日
【發(fā)明者】趙翔宇, 張憲省, 別曉敏, 張偉楊, 劉娜 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)