豬支原體肺炎疫苗株的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一株豬支原體肺炎疫苗株，其分類命名為豬肺炎支原體（Mycoplasma?hyopneumoniae），菌株號(hào)為NJ，已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)：CCTCC?NO:M2012286，保藏日期：2012年7月16日。本發(fā)明的豬支原體肺炎疫苗株對(duì)豬有一定的致病性，具有良好的免疫原性。
【專利說(shuō)明】豬支原體肺炎疫苗株
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種豬支原體肺炎疫苗株，屬于獸用生物制品領(lǐng)域。
技術(shù)背景
[0002]豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp)是引起豬支原體肺炎(Mycoplasmal pneumoniae of swine, Mps又稱豬氣喘病)的主要病原，也是豬呼吸道疾病綜合癥的一種重要的原發(fā)性病原。Mhp主要感染豬呼吸道，本身致病力不強(qiáng)，臨床癥狀主要以咳嗽和氣喘為主，病變特征主要是肺的尖葉、心葉、中間葉和隔葉前緣呈“肉樣”或“蝦肉樣”實(shí)變。Mhp感染機(jī)體后主要與呼吸道內(nèi)壁的纖毛黏附，引起纖毛細(xì)胞病變和凋亡，導(dǎo)致纖毛斷裂和脫落，引 起機(jī)體發(fā)病，并且會(huì)嚴(yán)重影響豬的生長(zhǎng)發(fā)育和飼料轉(zhuǎn)化率，或者破壞粘膜-纖毛屏障，容易繼發(fā)其他致病菌的感染(特別是對(duì)青年豬)，提高致死率，因而給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前豬支原體肺炎的主要防治措施是疫苗和藥物，但有效的藥物較缺乏，因此，進(jìn)行該病的疫苗研制將為本病的預(yù)防和控制具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種豬支原體肺炎疫苗株，該疫苗株對(duì)豬有一定的致病性，培養(yǎng)滴度高且具有良好的免疫原性。
[0004]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
[0005]—株豬支原體肺炎疫苗株，其分類命名為豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae),菌株號(hào)為NJ,已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心,地址:中國(guó).武漢.武漢大學(xué)，郵編430072，保藏編號(hào)=CCTCC N0:M2012286，保藏日期:2012年7月16日。該菌株是發(fā)明人于2004年8月于南京某豬場(chǎng)自行采集篩選鑒定獲得一株豬支原體肺炎疫苗株。
[0006]有益效果:本發(fā)明具有下列突出的優(yōu)點(diǎn):
[0007]I)新菌株免疫原性好:本發(fā)明的豬支原體肺炎疫苗株為從國(guó)內(nèi)分離培養(yǎng)選育的新菌株，具有良好的免疫原型，保證了疫苗的特異性和免疫效力。
[0008]2)新菌株生產(chǎn)疫苗簡(jiǎn)便:本發(fā)明的豬支原體肺炎疫苗株為經(jīng)過(guò)培育的地方分離菌株，具有高滴度的培養(yǎng)特性，保證了制苗用抗原的高滴度，減少了濃縮步驟；同時(shí)該菌株可用硫柳汞滅活，硫柳汞本身是一種防腐劑，用其來(lái)滅活兼顧了滅活和防腐，減少了用量，減少了對(duì)動(dòng)物的不良反應(yīng)；由于本發(fā)明的菌株具有良好的免疫原性，使的制備的滅活疫苗中免疫佐劑成分簡(jiǎn)單，制苗方法簡(jiǎn)便，簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝，降低了生產(chǎn)污染的風(fēng)險(xiǎn)。
[0009]3)新菌株生產(chǎn)的疫苗安全高效:本發(fā)明的豬支原體肺炎疫苗株為經(jīng)培育的地方分離株，具有培養(yǎng)滴度高、免疫原性好的特點(diǎn)，使用的佐劑為經(jīng)過(guò)篩選獲得的油佐劑具有良好的免疫保護(hù)性，水性佐劑具有具有良好的安全性，保證了疫苗的安全和高效。
[0010]總之，本發(fā)明的滅活疫苗生產(chǎn)簡(jiǎn)便、疫苗安全高效，能較好的滿足目前豬場(chǎng)的迫切需要，易于大范圍推廣應(yīng)用，具有廣闊的市場(chǎng)前景和較大的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)效益?！緦＠綀D】

【附圖說(shuō)明】
[0011]圖1豬支原體肺炎滅活疫苗(NJ株)制備流程圖。
[0012]圖2豬肺炎支原體NJ株與其他菌株16s rRNA基因相似度比較。
[0013]圖3豬肺炎支原體NJ株與其他菌株16s rRNA基因進(jìn)化樹(shù)。
[0014]圖4豬肺炎支原體NJ株與其他菌株P(guān)46基因相似度比較。
[0015]圖5豬肺炎支原體NJ株與其他菌株P(guān)46基因進(jìn)化樹(shù)。
【具體實(shí)施方式】
[0016]下面的實(shí)施例將進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，而不限制本發(fā)明的范圍。
[0017]實(shí)施例1:豬肺炎支原體NJ株的選育
[0018]I菌株分離培養(yǎng)
[0019]將病肺組織進(jìn)行研磨后，加入液體培養(yǎng)基(pH值7.4~7.6)中，置37°C培養(yǎng)3~10日后pH值降為6.6~7.0，輕度均一混濁。再接種固體培養(yǎng)基置37°C培養(yǎng)3~10日后，可見(jiàn)油煎蛋樣菌落，在固體培養(yǎng)基上傳代3次后，接種液體培養(yǎng)基，獲得豬肺炎支原體。
[0020]2 鑒定
[0021]將分離的豬肺炎支原體株置37°C培養(yǎng)3~10日后pH值降為6.6~7.0，輕度均一混濁，進(jìn)行涂片，染色鏡檢見(jiàn)典型的豬肺炎支原體菌體。再接種固體培養(yǎng)基置37°C培養(yǎng)3~10日后，可見(jiàn)油煎蛋樣菌落。符合豬肺炎支原體的培養(yǎng)特性。
[0022]根據(jù)Genbank報(bào)道的豬肺炎支原體16s rRNA和P46基因序列分別設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增后，測(cè)序，測(cè)定的序列與已公布的全基因組序列進(jìn)行ClustalW比對(duì)。
[0023]對(duì)于16s rRNA基因，NJ株與GenBank報(bào)道其他菌株的相似度為99.7%~100.0%,相似度比較見(jiàn)圖2，進(jìn)化樹(shù)如圖3所示，NJ株16s rRNA序列見(jiàn)序列表SEQ ID No:1所示。對(duì)于P46基因，NJ株與GenBank報(bào)道其他菌株的相似度為98.7%~99.9%，相似度比較見(jiàn)圖4，進(jìn)化樹(shù)如圖5所示，NJ株P(guān)46序列見(jiàn)序列表SEQ ID No:2所示。這說(shuō)明豬肺炎支原體NJ株為豬肺炎支原體，且與其他菌株不同。
[0024]經(jīng)培養(yǎng)特性、PCR和測(cè)序鑒定(序列見(jiàn)序列表SEQ ID No:1 )，分離獲得了豬肺炎支原體NJ株。
[0025]3菌株傳代
[0026]分離獲得的豬肺炎支原體NJ株，經(jīng)液體傳代培養(yǎng)，每隔3代進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果含量從 105CCU/mL 上升到 101QCCU/mL。
[0027]4免疫原性測(cè)定
[0028]豬肺炎支原體NJ株的不同代次制備疫苗，然后各肌肉注射免疫7~15日齡健康易感豬，14日后再加強(qiáng)免疫；首免35日后，連同條件相同的對(duì)照豬，用豬肺炎支原體Js組織強(qiáng)毒氣管內(nèi)注射攻毒，攻毒28日后剖檢，計(jì)算免疫組豬支原體肺炎肺病變指數(shù)減少率。結(jié)果各代次菌株制備的疫苗免疫組豬支原體肺炎肺病變指數(shù)減少率無(wú)差異。由此獲得的具有培養(yǎng)滴度高，免疫原性好的豬肺炎支原體NJ株。
[0029]實(shí)施例2:豬支原體肺炎滅活疫苗(NJ株)的制備方法。
[0030]I菌株培養(yǎng)
[0031]菌株選用豬肺炎支原體NJ株，該菌株由我們分離鑒定，傳代培育后獲得，本菌株已于2012年7月16日送中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏號(hào)為:CCTCCM2012286。
[0032]2菌株特性
[0033]2.1形態(tài)和生化特性本菌為革蘭氏陰性多形態(tài)微生物，有環(huán)狀、球狀、點(diǎn)狀、桿狀和兩極狀，不易著色，無(wú)細(xì)胞壁。生化特性應(yīng)符合細(xì)菌分類學(xué)中本菌的特性。
[0034]2.2培養(yǎng)特性在液體培養(yǎng)基(pH值7.4~7.6)中，置37°C培養(yǎng)3~7日后pH值降為6.6~7.0，輕度均一混濁，活菌滴度可達(dá)到IOkiCXUAiL以上。接種固體培養(yǎng)基，置37°C培養(yǎng)3~10日后,可見(jiàn)油煎蛋樣菌落。
[0035]液體培養(yǎng)基配方為=Eagles氏液1000mL,水解乳蛋白10.0g，豬血清200~400mL，鮮酵母浸出汁10~20mL，磷酸鹽緩沖液600mL，青霉素200~1000萬(wàn)單位，0.4%酚紅
3.5mL，用 10g/L NaOH 調(diào) pH 值為 7.4 ~7.6。
[0036]固體培養(yǎng)配方:在液體培養(yǎng)基中添加Noble Agar。
[0037]2.3血清學(xué)特性用代謝抑制試驗(yàn)鑒定，接種到加有抗豬肺炎支原體血清的液體培養(yǎng)基中，在37°C下培養(yǎng)10日，與培養(yǎng)基對(duì)照相比不變色。
[0038]2.4毒力將菌株培養(yǎng)物經(jīng)氣管內(nèi)注射7~15日齡健康易感5mL，28日后剖檢，可見(jiàn)接種豬肺部出現(xiàn)典型的豬支原體肺炎病變。
[0039]2.5免疫原性按本發(fā)明制成疫苗，肌肉注射免疫7~15日齡健康易感豬，14日后再加強(qiáng)免疫；首免35日后，連同條件相同的對(duì)照豬，用豬肺炎支原體Js組織強(qiáng)毒氣管內(nèi)注射攻毒，攻毒28日后剖檢，可`見(jiàn)免疫豬可顯著減少豬支原體肺炎肺病變。
[0040]3生產(chǎn)菌種的制備
[0041]取豬肺炎支原體NJ株凍干菌種，用液體培養(yǎng)基稀釋后，接種固體培養(yǎng)基，在37°C下培養(yǎng)3~10日，選擇生長(zhǎng)良好的菌落，純粹檢驗(yàn)合格后，作為一級(jí)種子。再取一級(jí)種子接種液體培養(yǎng)基，在37°C下培養(yǎng)3~7日后pH值降為6.6~7.0收獲，經(jīng)純粹檢驗(yàn)合格后，作為二級(jí)種子。
[0042]4制苗用菌液的制備
[0043]取二級(jí)種子接種液體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)3~7日，待培養(yǎng)物變色后進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，繼代不超過(guò)6代，待pH值降為6.6~7.0時(shí)收獲，按照中國(guó)獸藥典的規(guī)定進(jìn)行純粹檢驗(yàn)和含量測(cè)定。
[0044]5抗原的滅活
[0045]將檢驗(yàn)合格的制苗用菌液加入終濃度為0.005%的硫柳汞，37°C進(jìn)行滅活。取滅活樣品ImL加入到50mL的液體培養(yǎng)基中，置37°C培養(yǎng)，觀察5日，再取0.5mL接種到4.5mL液體培養(yǎng)基中，置37°C培養(yǎng)，觀察10日，如兩次培養(yǎng)均不變色，判為滅活檢驗(yàn)合格。
[0046]6配苗與混合
[0047]每頭份含滅活前豬肺炎支原體不少于2.86X IO8CXU,配苗比例由所用佐劑決定，抗原不足部分用PBS補(bǔ)足。
[0048]6.1注射用白油的配苗及混合取注射用白油94份(重量比)，司本-806份，加入油相罐中，攪拌均勻，經(jīng)121°C滅菌30分鐘，冷卻至室溫備用。取滅活檢驗(yàn)合格的菌液96份，吐溫-804份，加入水相罐中，攪拌混勻備用。將油相2~3份加入乳化罐中，先低速攪拌30分鐘，再緩慢加入1份水相，繼續(xù)攪拌均勻，用高速剪切機(jī)進(jìn)行乳化，在乳化結(jié)束前加入終濃度為0.005% (g/mL)的硫柳汞溶液，制成油包水型乳液。[0049]6.2ISA206VG(SEPPIC)、ISA201VG(SEPPIC)、Gel01ST(SEPPIC)、ISAllRVG(SEPPIC)的配苗及混合按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行配苗和混合。如ISA201VG，按抗原和佐劑重量比50:50配苗，將佐劑預(yù)熱至31 °C，用低剪切力攪拌，維持在30°C，加抗原(水相)到佐劑中，攪拌均一即可。如ISAllR VG，按佐劑和抗原重量比15:85的比例配比，在室溫或更低溫度下將抗原水相加入佐劑中用低剪切力攪拌器攪拌均一即可。如GelOlST，佐劑按5%~20%配苗，在室溫或更低溫度下將抗原水相加入佐劑中用低剪切力攪拌器攪拌均一即可。
[0050]7成品檢驗(yàn)
[0051]7.1性狀應(yīng)符合所屬劑型。如用注射用白油應(yīng)為油包水型，如用ISA201VG應(yīng)為水包油再包水型，如用ISAllR VG應(yīng)為水包油型，如用GelOlST應(yīng)為水劑型。
[0052]7.2穩(wěn)定性吸取疫苗IOmL加入離心管，以3000r/min離心15分鐘，管底析出的水相應(yīng)不超過(guò)0.5mL。
[0053]7.3黏度按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，不超過(guò)200cP。
[0054]7.4無(wú)菌檢驗(yàn)按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，無(wú)菌生長(zhǎng)。
[0055]7.5安全檢驗(yàn)用7~15日齡健康易感豬5頭，各肌肉注射疫苗2mL，觀察14日后，除出現(xiàn)一過(guò)性體溫升高外，無(wú)由注射疫苗引起的其他局部和全身不良反應(yīng)。
[0056]7.6效力檢驗(yàn)用7~15日齡健康易感豬15頭，分為3組，分別為攻毒對(duì)照組、健康對(duì)照組和疫苗免疫組，每組5頭。疫苗免疫組各肌肉注射疫苗I頭份，14日后，再各肌肉注射疫苗I頭份。首免后35日，連同攻毒對(duì)照豬5頭，用生理鹽水稀釋的豬肺炎支原體Js株組織強(qiáng)毒，經(jīng)氣管內(nèi)注射攻 毒，每頭5mL。攻毒28日后，剖檢所有試驗(yàn)豬，觀察記錄肺組織左尖葉、左心葉、左膈葉、右尖葉、右心葉、右膈葉、副葉病變百分比率，將O~25%記為I ;26~50%記為2 ；51~75%記為3 ；76~100%記為4，統(tǒng)計(jì)每個(gè)試驗(yàn)豬病肺病變指數(shù)(最高為28)。肺病變指數(shù)減少率=(攻毒對(duì)照組肺病變指數(shù)平均值一免疫組肺病變指數(shù)平均值)/ (攻毒對(duì)照組肺病變指數(shù)平均值一健康對(duì)照組肺病變指數(shù)平均值)X100%，按上述公式計(jì)算豬支原體肺炎疫苗免疫組豬肺病變指數(shù)減少率。
[0057]7.7硫柳汞殘留量測(cè)定按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行測(cè)定，應(yīng)符合獸用生物制品通則的規(guī)定。
[0058]8肌肉注射仔豬每頭肌肉注射I頭份。
[0059]實(shí)施例3:免疫效果觀察。
[0060]I 疫苗
[0061 ] 豬支原體肺炎滅活疫苗(NJ株)油佐劑，豬支原體肺炎滅活疫苗(NJ株)ISAl 1RVG,豬支原體肺炎滅活疫苗(NJ株)GelOlST,國(guó)外某公司生產(chǎn)的豬支原體肺炎滅活疫苗。
[0062]2檢驗(yàn)用強(qiáng)毒
[0063]豬肺炎支原體Js株組織強(qiáng)毒，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所制備。
[0064]3試驗(yàn)豬
[0065]7~15日齡健康易感豬30頭，來(lái)源于江蘇省明天農(nóng)牧科技有限公司。
[0066]4試驗(yàn)設(shè)計(jì)
[0067]用豬支原體肺炎滅活疫苗(NJ株)油佐劑，豬支原體肺炎滅活疫苗(NJ株)ISAl 1RVG，豬支原體肺炎滅活疫苗(NJ株)GelOlST，進(jìn)口豬支原體肺炎滅活疫苗各I批，每批疫苗用7~15日齡仔豬5頭，每頭肌注ImL的疫苗，14日后以同等劑量加強(qiáng)免疫一次。同時(shí)設(shè)立條件相同的豬作攻毒對(duì)照組和健康對(duì)照組各5頭。疫苗免疫組首免后28日內(nèi)觀察臨床反應(yīng)。在首免后35日，疫苗免疫組和攻毒對(duì)照組試驗(yàn)豬進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，攻毒28日后剖檢，統(tǒng)計(jì)肺部病變記分，計(jì)算肺病變指數(shù)減少率。
[0068]5臨床反應(yīng)觀察
[0069]試驗(yàn)豬在注射疫苗后觀察28日，結(jié)果3個(gè)免疫組的試驗(yàn)豬均在免疫后出現(xiàn)一過(guò)性發(fā)熱，但在免疫后三日內(nèi)均恢復(fù)正常。未見(jiàn)其它異常臨床反應(yīng)。
[0070]6效力比較試驗(yàn)
[0071]試驗(yàn)豬攻毒28日后內(nèi)，觀察發(fā)現(xiàn)5頭攻毒對(duì)照組豬中有4頭出現(xiàn)不同程度的咳嗽，3個(gè)免疫組中各有I~2頭出現(xiàn)輕微咳嗽，健康對(duì)照未見(jiàn)咳嗽等豬支原體肺炎特征性癥狀。攻毒28日后剖檢，各組肺病變指數(shù)，計(jì)算肺病變指數(shù)減少率，效力比較試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。有結(jié)果可見(jiàn)，豬支原體肺炎滅活疫苗(NJ)的3個(gè)不同佐劑的免疫組肺病變指數(shù)均顯著低于攻毒對(duì)照組和進(jìn)口疫苗組。
[0072]表1同類疫苗效力比較試驗(yàn)結(jié)果
[0073]
【權(quán)利要求】
1.一株豬支原體肺炎疫苗株，其分類命名為豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae),菌株號(hào)為NJ,已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào):CCTCCN0:M2012286，保藏日期:201`2年7月16日。
【文檔編號(hào)】C12R1/93GK103602637SQ201310608564
【公開(kāi)日】2014年2月26日 申請(qǐng)日期:2013年11月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月25日
【發(fā)明者】劉茂軍, 邵國(guó)青 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院