一種海帶配子體的固相保存方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種海帶配子體的固相保存方法，其步驟是：孢子囊海帶塊的獲取及擦拭；孢子囊海帶塊的無菌處理；海帶孢子的放散、附著及萌發(fā)；海帶單個(gè)配子體的分離與接種；海帶配子體在固體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)及后期保存。本發(fā)明將海帶配子體的無菌采集和固相保存結(jié)合起來，本發(fā)明從源頭就抑制細(xì)菌的污染，降低了海帶配子體污染細(xì)菌的機(jī)會(huì)，也大大簡化了海帶配子體固相保存前期的無菌處理流程，降低固相培養(yǎng)處理海帶配子體所附帶細(xì)菌的難度，容易得到污染較輕甚至無污染的海帶配子體，降低了液相保存海帶配子體后期更換培養(yǎng)液的工作量并節(jié)省有限的保存空間，同時(shí)便于固相保存方法的推廣應(yīng)用。
【專利說明】一種海帶配子體的固相保存方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種固相保存方法，尤其涉及一種海帶配子體的固相保存方法，屬于海洋生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]海帶是中國重要的經(jīng)濟(jì)海藻，20世紀(jì)70年代建立了海帶配子體的采集和克隆技術(shù)，為海帶的種質(zhì)保護(hù)奠定了基礎(chǔ)。利用傳統(tǒng)方法采集的配子體一般要分離到試管中并用棉花塞封口保存，通常每月更新一次培養(yǎng)液，工作量大，操作繁瑣，增加了細(xì)菌污染和種質(zhì)丟失、混雜的機(jī)會(huì)；2005年山東東方海洋科技股份有限公司和煙臺(tái)大學(xué)合作開發(fā)了海帶配子體固相保存技術(shù)，但由于實(shí)驗(yàn)室原有配子體克隆保存時(shí)間的延長、外界環(huán)境及海區(qū)水質(zhì)的變化及液相培養(yǎng)開放性操作等諸多因素的影響，至2008年底保存的海帶配子體克隆多有細(xì)菌污染，部分甚至出現(xiàn)真菌，并且污染菌的組成復(fù)雜，不是單一的一種菌，采用固相培養(yǎng)方法處理污染較重的海帶雌雄配子體克隆，海帶雌雄配子體克隆往往很難達(dá)到無菌狀態(tài)，接種后極易長菌，導(dǎo)致固相培養(yǎng)失敗，影響了固相保存技術(shù)的推廣應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是:提供一種無污染的海帶配子體的固相保存方法。
[0004]本發(fā)明的技術(shù)解決方案是:一種海帶配子體的固相保存方法，其步驟是:
(1)孢子囊海帶塊的獲取及擦拭:在海區(qū)選取性狀優(yōu)良的種海帶，在海帶孢子囊區(qū)剪取孢子囊海帶塊，用滅菌脫脂棉蘸取冷卻的煮沸海水反復(fù)擦拭孢子囊海帶塊，以去除孢子囊海帶塊表面附著物；` (2)孢子囊海帶塊的無菌處理:在移入無菌室前，利用滅菌脫脂棉蘸取高壓滅菌的冷卻海水再次擦拭孢子囊海帶塊，將擦拭后的孢子囊海帶塊移入無菌室超凈工作臺(tái)，首先用濃度為100 ppm (質(zhì)量體積比，克/立方米)的阿奇霉素和濃度為100 ppm的環(huán)丙沙星的雙抗無菌海水浸泡孢子囊海帶塊20分鐘，再用濃度為1.5%碘化鉀無菌海水浸泡孢子囊海帶塊10分鐘，最后用抽濾海水浸泡孢子囊海帶塊5分鐘，重復(fù)一次用抽濾海水浸泡孢子囊海帶塊5分鐘；
(3)海帶孢子的放散、附著及萌發(fā):將無菌處理后的孢子囊海帶塊放入血清瓶，加抽濾的高壓滅菌的冷卻海水進(jìn)行海帶孢子放散，海帶孢子放散到抽濾的高壓滅菌的冷卻海水成為海帶孢子水，使用滅菌的篩絹過濾海帶孢子水中的粘液及雜質(zhì)，最后將海帶孢子水倒入裝有載玻片的立式染色缸中，海帶孢子在載玻片上進(jìn)行附著和萌發(fā)，發(fā)育為海帶配子體；
(4)海帶單個(gè)配子體的分離與接種:在超凈工作臺(tái)內(nèi)，在顯微鏡下，在附有海帶配子體的載玻片上選取狀態(tài)優(yōu)良、特征明顯的海帶配子體，利用毛細(xì)玻璃管將選取的海帶配子體先轉(zhuǎn)移到蓋玻片上，鏡檢確保是一個(gè)海帶配子體，再利用毛細(xì)玻璃管植入培養(yǎng)皿中的固體培養(yǎng)基中，以完成海帶配子體接種，接種后的培養(yǎng)皿合上皿蓋并用封口膜密封；
(5)海帶配子體在固體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)及后期保存:將接種海帶配子體的培養(yǎng)皿放入光照培養(yǎng)箱中固相培養(yǎng)4個(gè)月，培養(yǎng)條件是持續(xù)24小時(shí)光照，光照強(qiáng)度1300~2000 Iux，溫度4~10 °C，然后將固相培養(yǎng)后的培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)入光照強(qiáng)度O~100 lux,溫度為4°C的冷藏柜中保存，使海帶配子體進(jìn)入休眠狀態(tài)即可實(shí)現(xiàn)長期保存，根據(jù)培養(yǎng)基表面干燥程度添加培養(yǎng)液。
[0005]上述步驟(4)所述固體培養(yǎng)基的配制方法是:
(1)配制PII金屬液:稱取乙二胺四乙酸二鈉0.1克、三氯化鐵0.001克、硼酸0.02克、氯化錳0.004克、氯化鋅0.0005克、氯化鈷0.0001克溶于去離子水中并定容至100 mL ；
(2)配制PESI母液:硝酸鈉0.35克、乙二胺四乙酸鐵鈉鹽0.0025克、甘油磷酸鈉0.05克、P II金屬液25 mL、Tris 0.5克，碘化鉀0.0001克，利用去離子水定容至IOOmL ; (3)配制PESI液體培養(yǎng)基:每100mL煮沸海水中添加2 mL的PESI母液，使用立式壓力蒸汽滅菌器滅菌，滅菌條件121°C，0.1MPa，30min，滅菌完畢后使用；
(4)配制固體培養(yǎng)基:每100mL的PESI液體培養(yǎng)基中添加0.6~0.8g瓊脂粉，使用立式壓力蒸汽滅菌器滅菌，滅菌條件121°C，0.lMPa，30min，高壓滅菌完畢后，冷卻至60 V后分別添加阿奇霉素、利福平、制霉菌素，使固體培養(yǎng)基中的阿奇霉素、利福平、制霉菌素濃度都達(dá)到lOppm，然后分裝倒入培養(yǎng)皿。
[0006]上述步驟(5)的暗光低溫的條件是光照強(qiáng)度O~100 lux,溫度4°C。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)效果是:本發(fā)明將海帶配子體的無菌采集和固相保存結(jié)合起來，即對(duì)種海帶進(jìn)行擦洗，并立即進(jìn)行無菌采克隆，待海帶游孢子附著萌發(fā)轉(zhuǎn)為海帶配子體，當(dāng)海帶配子體大小適中，密度均勻，雌雄可辨時(shí)，分離單個(gè)配子體并進(jìn)行固相保存。本發(fā)明從源頭就抑制細(xì)菌的污染，降低了海帶配子體污染細(xì)菌的機(jī)會(huì)，也大大簡化了海帶配子體固相保存前期的無菌處理流程，降低固相培養(yǎng)處理海帶配子體所附帶細(xì)菌的難度，容易得到污染較輕甚至無污染的海帶配子體，同時(shí)降低了液相保存海帶配子體后期更換培養(yǎng)液的工作量并節(jié)省有限的保存空間，同時(shí)便于固相保存方法的推廣應(yīng)用。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):
1.節(jié)省空間，利用現(xiàn)有方法試管保存新分離的配子體克隆，占用光照培養(yǎng)箱較大面積，而固相保存，可大大節(jié)省空間面積，并且沒有試管液體保存出現(xiàn)的皮筋老化，試管液體倒、灑等問題。
[0008]比液相保存更省時(shí)省力，保存可長達(dá)三年，不用添加培養(yǎng)基或更換培養(yǎng)基，而液相培養(yǎng)一般一個(gè)月更換一次培養(yǎng)液，并且操作比較開放，種質(zhì)污染、混雜機(jī)會(huì)增加，同時(shí)傾倒培養(yǎng)液的過程也是散播污染菌的過程，也會(huì)造成不同種污染菌之間的交叉污染。
[0009]將海帶配子體的無菌采集和固相保存結(jié)合起來，通過無菌采集海帶配子體，在源頭就抑制細(xì)菌的污染，降低了海帶配子體污染細(xì)菌的機(jī)會(huì)，也大大簡化了海帶配子體固相保存前期的無菌處理流程，降低固相培養(yǎng)前期處理海帶配子體所附帶細(xì)菌的難度。
[0010]現(xiàn)有方法液相保存有可能會(huì)造成種質(zhì)本身的老化，固相保存可使克隆進(jìn)入休眠狀態(tài)，減緩海帶配子體克隆的新陳代謝，延長保存時(shí)間。
[0011]另外，本發(fā)明所采用的阿奇霉素和環(huán)丙沙星對(duì)所能分離出的菌株都有效，且多為高敏或極高敏，二者結(jié)合抑菌效果更好。本發(fā)明海帶配子體接種是在無菌操作臺(tái)中的顯微鏡下利用毛細(xì)玻璃管挑取狀態(tài)優(yōu)良，特征明顯的配子體，利用毛細(xì)玻璃管將選取的海帶配子體先轉(zhuǎn)移到蓋玻片上，鏡檢確保是一個(gè)海帶配子體，再利用毛細(xì)玻璃管重新吸入，植入培養(yǎng)皿中的固體培養(yǎng)基中，而不是放入海水培養(yǎng)液中，使海帶配子體接種成功率更高?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0012]、圖1為本發(fā)明附著海帶配子體的載玻片照片。
[0013]、圖2為本發(fā)明固相保存3個(gè)月后長出海帶雌配子體的照片。
[0014]、圖3為本發(fā)明固相保存3個(gè)月后長出海帶雄配子體的照片。
[0015]、圖4為本發(fā)明從載玻片上分離的海帶雌配子體照片。
[0016]、圖5為本發(fā)明圖4的海帶雌配子體在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3個(gè)月，肉眼可見后， 用牙簽挑出并在無菌海水中洗滌后的狀態(tài)照片。
[0017]、圖6為本發(fā)明圖4的海帶雌配子體在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3個(gè)月后，在無菌的PESI培養(yǎng)液中復(fù)蘇64天的狀態(tài)照片。
[0018]、圖7為本發(fā)明從載玻片上分離的海帶雄配子體照片。
[0019]、圖8為本發(fā)明圖7的海帶雄配子體在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3個(gè)月，肉眼可見后，用牙簽挑出并在無菌海水中洗滌后的狀態(tài)照片。
[0020]、圖9為本發(fā)明圖7的海帶雄配子體在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3個(gè)月后，在無菌的PESI培養(yǎng)液中復(fù)蘇60天的狀態(tài)照片。
[0021]、圖10為2216E培養(yǎng)液添加有細(xì)菌后海帶克隆體上附著的細(xì)菌菌膜的照片。
[0022]、圖11為本發(fā)明沙堡培養(yǎng)液添加有霉菌后海帶克隆體上附著的霉菌菌絲的照片。
`[0023]、圖12為本發(fā)明固相保存海帶配子體克隆系的無菌檢測(cè)對(duì)比照片。
【具體實(shí)施方式】
[0024]下面結(jié)合實(shí)施例詳細(xì)說明:
本發(fā)明實(shí)施例用到如下溶液、試劑和器材:
(O煮沸海水，天然海水利用燃?xì)庠畲蠡饘⒑Ｋ蠓校笥眯』鸨３址序v5分鐘，即可獲得煮沸海水，然后用冷藏箱冷卻至4~12°C作為冷卻煮沸海水備用，用來擦洗剛從海區(qū)采集來的海帶時(shí)使用。
[0025](2)抽濾海水，在煮沸海水中加入已使用立式壓力蒸汽滅菌器滅菌的氮和磷營養(yǎng)鹽(KH2PO4-P:1ppm和NaNO3-N:1Oppm),混勻后使用立式不銹鋼抽濾器過濾除菌，在無菌室的超凈工作臺(tái)中處理準(zhǔn)備放散的海帶孢子囊塊時(shí)使用。
[0026](3)高壓滅菌的冷卻海水，煮沸海水在溫度121°C，壓力0.1MPa條件下滅菌時(shí)間30分鐘，然后冷卻至4~12V ;在無菌室外間擦洗海帶時(shí)使用。
[0027](4)抽濾的高壓滅菌冷卻海水，對(duì)高壓滅菌的冷卻海水使用立式不銹鋼抽濾器過濾除菌；在無菌室的超凈工作臺(tái)中海帶孢子囊放散時(shí)使用。
[0028](5)滅菌脫脂棉:脫脂棉先利用牛皮紙包裝好，使用立式壓力蒸汽滅菌器滅菌，滅菌條件:溫度121°C，壓力0.1MPa，滅菌時(shí)間30分鐘，滅菌完畢后使用鼓風(fēng)干燥箱在溫度120°C下烘干2小時(shí)。
[0029](6)配制100 ppm的阿奇霉素和100 ppm的環(huán)丙沙星的雙抗無菌海水:
a、配制濃度為10000 ppm的阿奇霉素母液，配制方法是稱取I克阿奇霉素，溶于100 mL去離子水中，獲得濃度為10000 ppm的阿奇霉素母液，然后利用5 mL的一次性無菌注射器和一次性抽濾器抽濾除菌，分裝每管5 mL ；
b、配制濃度為10000 ppm的環(huán)丙沙星母液，配制方法是稱取I克環(huán)丙沙星，溶于100 mL去離子水中，獲得濃度為10000 ppm的環(huán)丙沙星母液，然后利用5 mL的一次性無菌注射器和一次性抽濾器抽濾除菌，分裝每管5 mL ；
C、向煮沸海水中加入20 mL濃度為10000 ppm的阿奇霉素母液和20 mL濃度為10000ppm的環(huán)丙沙星母液,定容至2000mL,混勻，使用立式不銹鋼抽濾器中的0.22 Mm的濾菌膜過濾除菌，接入規(guī)格為250mL滅菌的藍(lán)蓋血清瓶中，得到的即為100 ppm的阿奇霉素和100ppm的環(huán)丙沙星的雙抗無菌海水。
[0030](7)配制硝酸鈉母液:稱取242.4克硝酸鈉，溶于1000 mL去離子水中，氮元素母液濃度為4X104 ppm，使用立式壓力蒸汽滅菌器滅菌，滅菌條件121 °C，0.1MPa，30分鐘，冷卻至室溫，每4000 mL的煮沸海水中加入ImL硝酸鈉母液,氮元素濃度為10 ppm。
[0031](8)配制磷酸二氫鉀母液:稱取17.5g磷酸二氫鉀，溶于1000 mL去離子水中，磷元素母液濃度為4.5 X IO3 ppm，使用立式壓力蒸汽滅菌器滅菌，滅菌條件121°C，0.1MPa，30分鐘，冷卻至室溫，每4000 mL的煮沸海水中加入ImL磷酸二氫鉀母液，磷元素濃度為Ippm。
[0032](9)配制5%碘化鉀的無菌海水:稱取1.5克碘化鉀KI溶于100 mL煮沸的海水中，溶解后使用立式不銹鋼抽濾器過濾除菌。
[0033](10)配制0.6~0.8 %瓊脂的PESI固體培養(yǎng)基:
a、配制PESI母液配方:稱取硝酸鈉0.35克、乙二胺四乙酸鐵鈉鹽0.0025克、甘油磷酸鈉0.05克，量取P II金屬液25毫升，稱取Tris 0.5克，碘化鉀0.0001克，去離子水100毫升，混勻備用；
b、配制PESI液體培養(yǎng)基，量取2mL的PESI母液，利用未加營養(yǎng)鹽的煮沸海水定容至100 mL，使用立式壓力蒸汽滅菌器滅菌，滅菌條件121°C，0.1MPa，30分鐘，滅菌完畢后使用；
C、配制PESI固體培養(yǎng)基，每100 mL的PESI液體培養(yǎng)基中添加0.6~0.8克瓊脂粉，使用立式壓力蒸汽滅菌器滅菌，滅菌條件121°C，0.1MPa ,30分鐘，滅菌完畢后分裝到培養(yǎng)皿中冷凝后使用。
[0034]其中P II金屬液配制方法:稱取乙二胺四乙酸二鈉0.1克、三氯化鐵0.001克、硼酸0.02克、氯化錳0.004克、氯化鋅0.0005克、氯化鈷0.0001克溶于去離子水中并定容至100 mL 。
[0035](11)配制2216E培養(yǎng)液:稱取酵母浸粉l.0g，蛋白胨5.0g，磷酸鐵0.lg，量取煮沸未加營養(yǎng)鹽的海水1000 mL，若為固體培養(yǎng)基應(yīng)加入1.5%瓊脂粉，pH 7.6~7.8，如果pH值不符合要求，加濃度為lmol/L的鹽酸或濃度為lmol/L的氫氧化鈉來調(diào)節(jié)，本實(shí)驗(yàn)中由于用的煮沸海水配制培養(yǎng)液，PH在要求范圍內(nèi)，使用立式壓力蒸汽滅菌器滅菌，滅菌條件121。。，0.1MPa, 30 分鐘。
[0036](12)沙堡培養(yǎng)液:稱取無水葡萄糖40克，蛋白胨10克，量取煮沸未加營養(yǎng)鹽的海水1000 mL，若為固體培養(yǎng)基應(yīng)加入1.5%瓊脂粉，使用立式壓力蒸汽滅菌器滅菌，滅菌條件121。。，0.1MPa, 30 分鐘。
[0037](13)立式染色缸:玻璃材質(zhì)，可放5片載玻片，5(T60ml的容量。[0038](14)立式壓力蒸汽滅菌器:上海申安醫(yī)療器械廠，型號(hào)為LDZX-75KB。
[0039](15)超凈工作臺(tái):蘇州凈化設(shè)備有限公司，型號(hào)為SW-CJ-1D。
[0040](16)0.22um濾膜:上海市新亞凈化器件廠，混合纖維膜。
[0041](17)筒式正壓過濾器:上海市新亞凈化器件廠，規(guī)格為I升，直徑100mm，材質(zhì)為不銹鋼。
[0042](18)鼓風(fēng)干燥箱，即電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱:上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司，型號(hào)為 0HG-924385-1II。
[0043](19)阿奇霉素，大連美侖生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品編號(hào)MB1024，分子量785.01,945-1030 ug /mg，二水物。
[0044](20)環(huán)丙沙星，大連美侖生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品編號(hào)MB1283，分子量33 L 34，含量 99%。 [0045](21)硝酸鈉，分析純，分子量84.99，純度≥99.0%，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。
[0046](22)磷酸二氫鉀，分析純，分子量136.09，純度> 99.5%，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。
[0047](23)碘化鉀，分析純，分子量166.00，純度≥ 99.0%，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。
[0048](24)乙二胺四乙酸鐵鈉鹽，分子量367.05，純度≥99.0%，青島生工生物科技有限公司(MDBio)生產(chǎn)。
[0049](25)甘油磷酸鈉，成都科龍化學(xué)試劑廠生產(chǎn)。
[0050](26)乙二胺四乙酸二鈉，分析純，分子量372.24，純度> 99.0%，天津市大茂化學(xué)試劑廠。
[0051](27)Tris (三羥甲基氨基甲烷XC4H11NO3，分子量121.1，純度≥99.5%，廈門興隆達(dá)化學(xué)試劑有限公司。
[0052](28)三氯化鐵，分析純，分子量270.29，純度> 99.0%，天津市紅巖化學(xué)試劑廠。
[0053](29)硼酸，分析純，分子量61.83，純度≥99.5%，天津市瑞金特化學(xué)品有限公司。
[0054](30)氯化錳，分析純，分子量197.91，純度≥99.0%，天津市博迪化工有限公司。
[0055](31)氯化鋅，分析純，分子量136.30，純度≥98.0%。
[0056](32)氯化鈷，分析純，分子量237.93，純度> 99.0%，天津市紅巖化學(xué)試劑廠。
[0057](33)瓊脂粉，北京康倍斯科技有限公司。
[0058](34)利福平，大連美侖生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品編號(hào)MB1769，含量不小于98.5%，分子量822.95。
[0059](35)制霉菌素，大連美侖生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品編號(hào)MB1170，4400u/mg，含量不小于98.5%,分子量926.10。
[0060](36)酵母浸粉，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)。
[0061](37)磷酸鐵，上海潤捷化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，分子量222.87，純度≥98.0%。
[0062](38)無水葡萄糖，天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠生產(chǎn)，分子量180.16。
[0063](39)蛋白胨，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)。
[0064](40)濾膜:上海新亞凈化器件廠，混合纖維素微孔濾膜，水系，直徑IOOmm，孔徑0.22Mm。
[0065](41)去離子水，通過青島紫泉儀器有限公司購買的FMN1001-R0型純水機(jī)制備。
[0066](42)配制利福平母液:稱取I克利福平，溶解于100 mL甲醇中，配制成濃度為10000 ppm的母液。
[0067](43)配制霉菌素母液:稱取0.5克制霉菌素，溶解于100 mL 二甲基亞砜中，配制成濃度為5000 ppm的母液。
[0068](44) parafilm 封口膜，美國 BEMIS 公司生產(chǎn)，貨號(hào) PM-996。
[0069](45)光照培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠，型號(hào)GXZ-280B，容積300L。
[0070](46) pH計(jì):廠家Sartorius,德國賽多利斯公司，型號(hào)PB-100。
[0071](47) 一次性抽濾器:一次性針頭過濾器，混合纖維素膜，水系，直徑25mm，孔徑
0.22Mm，上海市新亞凈化器件廠。
[0072]本發(fā)明實(shí)施例海帶配子體的固相保存方法步驟如下:
1、孢子囊海帶塊的獲取及洗刷:在海區(qū)選取性狀優(yōu)良，具有成熟孢子囊的種海帶運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，在海帶孢子囊區(qū)剪取2cmX3cm左右的長條，利用冷卻的煮沸海水和滅菌脫脂棉反復(fù)擦拭，去除藻體上所附著的雜藻、附泥及粘液。
[0073]、孢子囊海帶塊的無菌處`理:在無菌室外間，海帶塊利用高壓滅菌的冷卻海水(高壓滅菌海水可以殺死海水中所有的藻類、細(xì)菌和真菌)和滅菌脫脂棉再次擦拭后，移入無菌室超凈工作臺(tái)內(nèi)，首先利用含有100 ppm的阿奇霉素和100 ppm的環(huán)丙沙星的雙抗無菌海水浸泡20分鐘,再利用濃度為1.5%碘化鉀KI的無菌海水浸泡10分鐘,抽濾海水浸泡5分鐘，重復(fù)一次抽濾海水浸泡5分鐘。
[0074]經(jīng)試驗(yàn)對(duì)比，阿奇霉素和環(huán)丙沙星對(duì)所能分離出的菌株都有效，且多為高敏或極高敏。
[0075]、海帶孢子的放散、附著及萌發(fā):將無菌處理的海帶塊直接放入藍(lán)蓋血清瓶，加抽濾的高壓滅菌的冷卻海水進(jìn)行孢子放散，成熟度差的海帶塊需在8~10 V的冰箱中陰干2小時(shí)，再放散；如果海帶成熟度好，直接放入藍(lán)蓋血清瓶中放散，不需要陰干。取6~8滴海帶孢子水在顯微鏡下觀察，看海帶游孢子的活力和數(shù)量，海帶孢子體活力較強(qiáng)，一個(gè)視野下的游孢子數(shù)在8~10個(gè)，密度過大，加抽濾的煮沸海水稀釋，直至一個(gè)視野下的海帶游孢子數(shù)在3~5個(gè)，本實(shí)施例海帶游孢子密度每視野(160倍鏡下)達(dá)5個(gè)左右時(shí)，移出海帶塊，停止放散。鏡檢合格后，使用300目篩絹過濾海帶孢子液中的粘液及雜質(zhì)，將海帶孢子水倒入裝有載玻片的立式染色缸中，海帶孢子水要覆蓋過載玻片，不要溢滿，然后將裝有海帶孢子水的立式染色缸放入培養(yǎng)箱進(jìn)行海帶孢子體的附著、萌發(fā)，培養(yǎng)條件:光照強(qiáng)度控制在1200^1500 lux, 24小時(shí)光照，溫度10~12 °C，待48小時(shí)海帶孢子體附著牢靠后，更換染色缸中的抽濾的高壓滅菌的冷卻海水，5~7天鏡檢一次。培養(yǎng)7~10天，在顯微鏡下雌雄配子體可辨時(shí)，可行單個(gè)配子體的分離。在顯微鏡下，海帶孢子體轉(zhuǎn)化為海帶配子體雌雄可辨時(shí)，即可挑取分離海帶雌雄配子體。從染色缸中挑選形態(tài)規(guī)整，大小適中，色素優(yōu)良，密度均勻的附有海帶配子體的載玻片，放入事先備好的培養(yǎng)皿中備用，海帶配子體培養(yǎng)24天左右即可分離挑取，采集時(shí)密度比較合適也可等海帶配子體再長大些挑取，這樣可增加海帶配子體成活率。
[0076]固相培養(yǎng)基的配制:配制0.6~0.8 %瓊脂的PESI培養(yǎng)基。[0077]首先，配制PESI母液，稱取硝酸鈉0.35g、乙二胺四乙酸鐵鈉鹽0.0025 g、甘油磷酸鈉0.05 g、P II金屬液25 mL、Tris 0.5g，碘化鉀0.0OOlg，去離子水lOOmL，混勻裝至200 mL監(jiān)蓋瓶中；
其次，配制PESI液體培養(yǎng)基，量取2 mL PESI母液，利用未加營養(yǎng)鹽的煮沸海水定容至100 mL，使用立式壓力蒸汽滅菌器滅菌，滅菌條件121°C，0.1MPa，30分鐘，滅菌；
再次，配制PESI固體培養(yǎng)基，每100 mL的PESI液體培養(yǎng)基中添加0.6~0.8g瓊脂粉，使用立式壓力蒸汽滅菌器滅菌，在121°C，0.1MPa, 30分鐘條件下高溫滅菌；
最后，PESI固體培養(yǎng)基高溫滅菌后冷卻至60 °C后分別添加阿奇霉素、利福平、制霉菌素，使PESI固體培養(yǎng)中的阿奇霉素濃度為lOppm、利福平濃度為lOppm、制霉菌素濃度為IOppm (即抗生素的最終濃度)，混勻后分裝入9 cm直徑的培養(yǎng)皿中作為PESI固體培養(yǎng)板，即用9 cm直徑的培養(yǎng)皿倒平板，冷凝備用。
[0078]經(jīng)試驗(yàn)對(duì)比，阿奇霉素和利福平對(duì)95 %以上的海帶配子體污染菌都有效；對(duì)污染的真菌也進(jìn)行了分離純化，制霉菌素比較好用；為了防止周圍環(huán)境中的真菌尤其是夏天培養(yǎng)箱潮濕環(huán)境中的真菌污染，本發(fā)明在培養(yǎng)基中添加制霉菌素。
[0079]單個(gè)配子體的分離與接種:在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行；在顯微鏡下，在事先備好的附有海帶配子體的載玻片上挑取狀態(tài)優(yōu)良，特征明顯的配子體；海帶雌配子體細(xì)胞大，由細(xì)胞分裂形成的分支少；海帶雄配子體細(xì)胞明顯小，分支多；利用毛細(xì)玻璃管將挑取的海帶配子體先移到蓋玻片上，鏡檢確保是一個(gè)雌配子體或是一個(gè)雄配子體后，再利用毛細(xì)管重新吸入植入固體培養(yǎng)基中，完成此操作后需要鏡檢蓋玻片和毛細(xì)玻管，看是否有海帶配子體殘留，每個(gè)PESI固體培養(yǎng)板接10~15個(gè)海帶配子體,接種后利用parafilm封口膜密封。
[0080]固相保存的培養(yǎng):將接種的PESI固體培養(yǎng)板放入光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24小時(shí)光照，光強(qiáng)120(Tl500 lux ,10` °C左右，保存2個(gè)月左右，可見培養(yǎng)基中長出的海帶配子體克隆系藻斑1.0~1.5毫米左右，肉眼可見，此時(shí)將其轉(zhuǎn)入暗光低溫冷藏柜中保存(光照強(qiáng)度O~100 lux, 4°C左右)，使海帶配子體細(xì)胞進(jìn)入休眠狀態(tài)，進(jìn)行長期保存，根據(jù)培養(yǎng)基表面干燥程度添加一次滅菌的PESI培養(yǎng)液(一般是一年添加一次滅菌的PESI培養(yǎng)液)。
[0081]固相保存海帶克隆的復(fù)蘇:用滅菌牙簽從PESI固體培養(yǎng)板上挑取肉眼可見的海帶配子體克隆系藻斑接種于滅菌的PESI培養(yǎng)液，在溫度8~12 °C，在光照強(qiáng)度1000~1500 lux，24小時(shí)光照，50~60天即可長成簇狀的海帶配子體克隆系。本實(shí)施例滅菌的PESI培養(yǎng)液使用立式壓力蒸汽滅菌器滅菌，滅菌條件121°C，0.1MPa，30min，滅菌完畢后冷卻至4~IO0C0
[0082]固相保存配子體克隆系的無菌檢測(cè)，即固相保存海帶配子體克隆系是否為細(xì)菌或真菌污染的檢測(cè):在超凈工作臺(tái)中按下面附表設(shè)置檢驗(yàn)，28 1:搖菌培養(yǎng)3天，看各個(gè)培養(yǎng)液是否渾濁、澄清。
[0083]檢測(cè)目的是利用本發(fā)明方法進(jìn)行配子體保存以及其后所進(jìn)行的固相保存海帶配子體的復(fù)蘇過程是否會(huì)造成海帶配子體為細(xì)菌和真菌所污染，因?yàn)楹渥芋w保存根本不可能達(dá)到食品級(jí)別的無菌，采用搖菌的方法進(jìn)行初步判定。檢測(cè)方法是設(shè)置陽性和陰性對(duì)照，陽性對(duì)照即為已分別接種細(xì)菌的細(xì)菌液體培養(yǎng)基一2216E培養(yǎng)液和已接種真菌的真菌液體培養(yǎng)基一沙堡培養(yǎng)液，陽性對(duì)照28°C在搖床中搖菌，培養(yǎng)液肯定會(huì)變渾濁；陰性對(duì)照即為未添加任何污染物的細(xì)菌培養(yǎng)液2216E培養(yǎng)液和真菌培養(yǎng)液一沙堡培養(yǎng)液，陰性對(duì)照28°C在搖床中搖菌，正常操作下培養(yǎng)液是澄清的；將被檢測(cè)物分別加入細(xì)菌培養(yǎng)液和真菌培養(yǎng)液中，和陽性、陰性對(duì)照在相同條件下?lián)u菌，看渾濁或澄清狀況來判斷是否為細(xì)菌或真菌污染，在此實(shí)驗(yàn)中被檢測(cè)物為雌性海帶配子體早、雄性海帶配子體?復(fù)蘇培養(yǎng)液，如果搖菌結(jié)果渾濁表明海帶配子體有菌污染，如果搖菌結(jié)果澄清表明海帶配子體無菌污染。本發(fā)明海帶配子體是否為細(xì)菌或真菌污染的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見如下附表:
圖12為本發(fā)明固相保存海帶配子體克隆系的無菌檢測(cè)對(duì)比照片，其中a圖為細(xì)菌陽性對(duì)照照片，b圖為真菌陽性對(duì)照，c圖為細(xì)菌陰性對(duì)照，d圖為真菌陰性對(duì)照，e圖為雌性海帶配子體細(xì)菌培養(yǎng)液照片，f圖為雌性海帶配子體真菌培養(yǎng)液照片，g圖為雄性配子體細(xì)菌培養(yǎng)液照片，h圖為雄性配子體真菌培養(yǎng)液照片。
[0084] 附表
【權(quán)利要求】
1.一種海帶配子體的固相保存方法，其步驟是: (1)孢子囊海帶塊的獲取及擦拭:在海區(qū)選取性狀優(yōu)良的種海帶，在海帶孢子囊區(qū)剪取孢子囊海帶塊，用滅菌脫脂棉蘸取冷卻后的煮沸海水反復(fù)擦拭孢子囊海帶塊，以去除孢子囊海帶塊表面附著物； (2)孢子囊海帶塊的無菌處理:在移入無菌室前，利用滅菌脫脂棉蘸取高壓滅菌的冷卻海水再次擦拭孢子囊海帶塊，將擦拭后的孢子囊海帶塊移入無菌室超凈工作臺(tái)，首先用濃度為100 ppm的阿奇霉素和濃度為100 ppm的環(huán)丙沙星的雙抗無菌海水浸泡孢子囊海帶塊20分鐘，再用濃度為1.5%碘化鉀無菌海水浸泡孢子囊海帶塊10分鐘，最后用抽濾海水浸泡孢子囊海帶塊5分鐘，重復(fù)一次用抽濾海水浸泡孢子囊海帶塊5分鐘； (3)海帶孢子的放散、附著及萌發(fā):將無菌處理后的孢子囊海帶塊放入血清瓶，加抽濾的高壓滅菌冷卻海水進(jìn)行海帶孢子放散，海帶孢子放散到抽濾的高壓滅菌冷卻海水成為海帶孢子水，使用滅菌的篩絹過濾海帶孢子水中的粘液及雜質(zhì)，最后將海帶孢子水倒入裝有載玻片的立式染色缸中，海帶孢子在載玻片上進(jìn)行附著和萌發(fā)，發(fā)育為海帶配子體； (4)海帶單個(gè)配子體的分離與接種:在超凈工作臺(tái)內(nèi)，在顯微鏡下，在附有海帶配子體的載玻片上選取狀態(tài)優(yōu)良、特征明顯的海帶配子體，利用毛細(xì)玻璃管將選取的海帶配子體先轉(zhuǎn)移到蓋玻片上，鏡檢確保是一個(gè)海帶配子體，再利用毛細(xì)玻璃管重新吸入，植入培養(yǎng)皿中的固體培養(yǎng)基中，以完成海帶配子體接種，接種后的培養(yǎng)皿合上皿蓋并用封口膜密封； (5)海帶配子體在固體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)及后期保存:將接種海帶配子體的培養(yǎng)皿放入光照培養(yǎng)箱中固相培養(yǎng)4個(gè)月，培養(yǎng)條件是持續(xù)24小時(shí)光照，光照強(qiáng)度1300~2000 Iux，溫度4~10 °C，然后將固相培養(yǎng)后的培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)入暗光低溫保存，使海帶配子體進(jìn)入休眠狀態(tài)即可實(shí)現(xiàn)長期保存，根據(jù)培養(yǎng)基表面干燥程度添加培養(yǎng)液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種海帶配子體的固相保存方法，其特征在于:步驟(4)所述固體培養(yǎng)基的配制方法是: (1)配制PII金屬液:稱取乙二胺四乙酸二鈉0.1克、三氯化鐵0.001克、硼酸0.02克、氯化錳0.004克、氯化鋅0.0005克、氯化鈷0.0001克溶于去離子水中并定容至100 mL ； (2)配制PESI母液:硝酸鈉0.35克、乙二胺四乙酸鐵鈉鹽0.0025克、甘油磷酸鈉0.05克、P II金屬液25 mL、Tris 0.5克，碘化鉀0.0001克，利用去離子水定容至IOOmL ; (3)配制PESI液體培養(yǎng)基:每100mL煮沸海水中添加2 mL的PESI母液，使用立式壓力蒸汽滅菌器滅菌，滅菌溫度121°C，滅菌壓力0.1MPa，滅菌時(shí)間30分鐘，滅菌完畢后使用； (4)配制固體培養(yǎng)基:每100mL的PESI液體培養(yǎng)基中添加0.6~0.8g瓊脂粉，使用立式壓力蒸汽滅菌器滅菌，滅菌溫度121°C，滅菌壓力0.1MPa，滅菌時(shí)間30分鐘，高壓滅菌完畢后，冷卻至60 °C后分別添加阿奇霉素、利福平、制霉菌素，使固體培養(yǎng)基中的阿奇霉素濃度為lOppm、利福平濃度為lOppm、制霉菌素濃度為IOppm,然后分裝倒入培養(yǎng)皿。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種海帶配子體的固相保存方法，其特征在于:步驟(5)的暗光低溫的條件是光照強(qiáng)度O~100 lux,溫度4°C。
【文檔編號(hào)】C12N5/04GK103555649SQ201310600181
【公開日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2013年11月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月25日
【發(fā)明者】李言, 羅世菊, 王娜, 王利芹, 趙聚萍, 賽珊, 錢瑞, 武瑞娜, 陳書秀, 崔翠菊 申請(qǐng)人:山東東方海洋科技股份有限公司