基于rna和dna雙外參實(shí)時(shí)定量pcr的表達(dá)校準(zhǔn)值的檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于RNA和DNA雙外參實(shí)時(shí)定量熒光PCR策略的基因表達(dá)校準(zhǔn)值的檢測(cè)方法，包括：選定外參基因；配制外參基因的RNA與DNA的預(yù)混合液；樣品中加入預(yù)混合液，收集樣品RNA和DNA；實(shí)時(shí)定量熒光PCR，檢測(cè)待測(cè)基因和內(nèi)參基因RNA拷貝數(shù)、內(nèi)參基因DNA拷貝數(shù)以及外參基因RNA和DNA拷貝數(shù)，計(jì)算得到內(nèi)參基因的表觀表達(dá)水平后，再根據(jù)公式得到待測(cè)基因的表達(dá)校準(zhǔn)值。本發(fā)明還公開了上述方法在PCR?array以及表達(dá)譜芯片檢測(cè)分析技術(shù)中的應(yīng)用。本發(fā)明將基因的表觀表達(dá)水平概念和檢測(cè)方法與傳統(tǒng)表達(dá)檢測(cè)體系相結(jié)合，以更少的檢測(cè)反應(yīng)、更低廉的成本實(shí)現(xiàn)更精確的基因表達(dá)水平檢測(cè)，修正由內(nèi)參基因真實(shí)表達(dá)水平在不同樣本間不恒定所造成的檢測(cè)結(jié)果的不準(zhǔn)確。
【專利說明】基于RNA和DNA雙外參實(shí)時(shí)定量PCR的表達(dá)校準(zhǔn)值的檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)及生物信息學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種改進(jìn)的、基于RNA和DNA雙外參實(shí)時(shí)定量熒光PCR的基因表達(dá)校準(zhǔn)值的檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]自從1970年克里克提出分子生物學(xué)的中心法則以來，人們對(duì)于基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)和及其調(diào)控的機(jī)制進(jìn)行了大量的研究。Northern雜交方法是最早用來測(cè)定基因轉(zhuǎn)錄水平的方法。后來,結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)生的RT-PCR(reverse transcription-PCR,即:逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))提供了一種靈敏而又簡(jiǎn)便的半定量測(cè)定方法。近年來，實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(簡(jiǎn)稱為:qPCR)方法由于其靈敏、準(zhǔn)確和重復(fù)性好，因此逐步成為基因表達(dá)的定量測(cè)定的主流方法。
[0003]上述方法為了減少由于RNA不穩(wěn)定和逆轉(zhuǎn)錄的效率問題產(chǎn)生的誤差，通常將待測(cè)基因的轉(zhuǎn)錄水平表示為與一個(gè)參考值(內(nèi)參基因RNA水平、細(xì)胞內(nèi)總RNA水平)的相對(duì)表達(dá)量。內(nèi)參通常為看家基因，如:β-actin、GAPDH以及rRNA等。然而，眾所周知，不同組織、或同一組織在不同條件下，細(xì)胞的總RNA量和/或內(nèi)參的量并不恒定，因此，基于該前提所進(jìn)行的基因轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)往往不夠精確。針對(duì)這一問題，我們?cè)?jīng)提出RNA和DNA雙外參實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)方法[1](專利號(hào):ZL200910049306.5)，檢測(cè)基因在某個(gè)時(shí)刻、某個(gè)細(xì)胞狀態(tài)下的RNA和DNA的比值，確定待測(cè)基因的表觀表達(dá)水平。
[0004]然而在“RNA和DNA雙外參實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)方法”中，針對(duì)每個(gè)待測(cè)基因都需要同時(shí)檢測(cè)其RNA和DNA水平，因此檢測(cè)反應(yīng)需要加倍，成本大大增加，限制了它的可推廣性。如何將“RNA和DNA雙外參實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)方法”與傳統(tǒng)技術(shù)平臺(tái)進(jìn)行整合和改良，以合理的成本獲得更加可靠的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，是目前亟待解決的技術(shù)問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出的基于RNA和DNA雙外參實(shí)時(shí)定量熒光PCR策略的基因表達(dá)校準(zhǔn)值的檢測(cè)方法，是在傳統(tǒng)基因表達(dá)檢測(cè)體系的基礎(chǔ)上，運(yùn)用我們?cè)?jīng)提出的專利“ RNA和DNA雙外參實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)方法” [1](專利號(hào):ZL200910049306.5)，增加檢測(cè)原有體系中內(nèi)參基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物拷貝數(shù)和基因拷貝數(shù)，以及外參基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物拷貝數(shù)和基因拷貝數(shù)，計(jì)算內(nèi)參基因的表觀表達(dá)水平，進(jìn)而對(duì)所有待測(cè)基因的表達(dá)值進(jìn)行校準(zhǔn)，從而得到所有待測(cè)基因的表達(dá)校準(zhǔn)值。
[0006]本發(fā)明的目的之一是提供一種改進(jìn)的、基于RNA和DNA雙外參實(shí)時(shí)定量熒光PCR策略的基因表達(dá)校準(zhǔn)值的檢測(cè)方法，得到待測(cè)基因的表達(dá)校準(zhǔn)值，包括步驟如下:
[0007]I)選定外參基因，制備外參基因的RNA與DNA，配制外參基因的RNA與DNA的預(yù)混合液；其中，所述外參基因的選定原則及預(yù)混液的配制原則與專利“RNA和DNA雙外參實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)方法及其應(yīng)用”(專利號(hào):ZL200910049306.5)中的原則一致。[0008]2)將步驟I)制備的預(yù)混合液與待測(cè)樣品混合，分別抽提總RNA和總DNA ；
[0009]3)總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成第一條cDNA鏈；
[0010]4)對(duì)cDNA組分和總DNA組分分別進(jìn)行實(shí)時(shí)定量熒光PCR擴(kuò)增。除測(cè)定待測(cè)基因和原有檢測(cè)體系中內(nèi)參基因的RNA拷貝數(shù)外，進(jìn)一步測(cè)定內(nèi)參基因的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的拷貝數(shù)、以及外參基因的RNA和DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的拷貝數(shù)，根據(jù)如下公式計(jì)算得到內(nèi)參基因的表觀
表達(dá)水平:
[0011]
【權(quán)利要求】
1.基于RNA和DNA雙外參實(shí)時(shí)定量PCR的表達(dá)校準(zhǔn)值的檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下步驟: 1)選定外參基因，配制外參基因的RNA與DNA的預(yù)混合液； 2)將步驟I)制備的預(yù)混合液與待測(cè)樣品混合，分別抽提總RNA和總DNA； 3)總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成第一條cDNA鏈； 4)對(duì)cDNA組分和總DNA組分分別進(jìn)行實(shí)時(shí)定量熒光PCR擴(kuò)增，測(cè)定擴(kuò)增后的待測(cè)基因的RNA擴(kuò)增產(chǎn)物拷貝數(shù)、內(nèi)參基因的RNA擴(kuò)增產(chǎn)物拷貝數(shù)、內(nèi)參基因的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的拷貝數(shù)、以及外參基因的RNA和DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的拷貝數(shù)； 根據(jù)如下公式計(jì)算得到內(nèi)參基因的表觀表達(dá)水平:
2.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，應(yīng)用于芯片檢測(cè)平臺(tái)，其特征在于，包括如下步驟: 1)選定外參基因，配制外參基因的RNA與DNA的預(yù)混合液； 2)將步驟I)制備的預(yù)混合液與待測(cè)樣品混合，分別抽提總RNA和總DNA； 3)總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成第一條cDNA鏈； 4)對(duì)總RNA組分進(jìn)行芯片表達(dá)譜實(shí)驗(yàn)； 5)使用實(shí)時(shí)定量熒光PCR加測(cè)芯片檢測(cè)體系中內(nèi)參基因的RNA和DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的拷貝數(shù)，以及新增外參基因的RNA和DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的拷貝數(shù)，按權(quán)利要求1中的公式計(jì)算得到內(nèi)參基因的表觀表達(dá)水平，進(jìn)一步得到表達(dá)譜檢測(cè)平臺(tái)產(chǎn)生的所有待測(cè)基因的表達(dá)校準(zhǔn)值。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103571964SQ201310594531
【公開日】2014年2月12日 申請(qǐng)日期:2013年11月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月21日
【發(fā)明者】陸長德, 李園園 申請(qǐng)人:上海生物信息技術(shù)研究中心