一種甜瓜甜味酸味性狀相關(guān)基因功能性分子標(biāo)記及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種甜瓜甜味酸味性狀相關(guān)基因功能性分子標(biāo)記及應(yīng)用。利用Super-BAS技術(shù)，提供一種甜瓜甜味酸味性狀相關(guān)基因功能性分子標(biāo)記，確定了風(fēng)味甜瓜甜味、酸味性狀相關(guān)基因序列，并在此基礎(chǔ)上成功開發(fā)了出一個甜味性狀相關(guān)基因功能性分子標(biāo)記SLAF18745-S01和三個個酸味性狀相關(guān)基因功能性分子標(biāo)記SLAF36334-S02、SLAF50072-S03和SLAF31212-S04，并通過甜味酸味標(biāo)記輔助選擇將傳統(tǒng)的表型選擇轉(zhuǎn)變?yōu)橹苯舆x擇基因型的應(yīng)用對于甜瓜甜味、酸味性狀的改良和改善具有重要的應(yīng)用價值和意義。
【專利說明】一種甜瓜甜味酸味性狀相關(guān)基因功能性分子標(biāo)記及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物【技術(shù)領(lǐng)域】。具體的說，本發(fā)明涉及一種與甜瓜果實甜味、酸味性狀相關(guān)基因功能性分子標(biāo)記及其應(yīng)用的【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】 [0002]甜瓜Wucumis melo L.)屬葫蘆科甜瓜屬，是一種重要的園藝作物，我國甜瓜的種植面積和產(chǎn)量均居世界第一。甜瓜是一種高多態(tài)性物種，含有各種不同果實風(fēng)味的基因型。成熟甜瓜果實糖、酸組分及其含量對果實內(nèi)在品質(zhì)有著重要的影響，是決定果實風(fēng)味的重要指標(biāo)。甜、酸等風(fēng)味的變化是一個復(fù)雜的過程，受一系列相關(guān)基因的影響和調(diào)控。定位甜瓜甜味、酸味性狀相關(guān)基因并開發(fā)功能性標(biāo)記，為提高甜瓜果實品質(zhì)性狀選育效率及甜瓜分子育種提供思路。
[0003]在現(xiàn)有甜瓜育種實踐中，對甜味、酸味等風(fēng)味性狀大多是通過表現(xiàn)型間接對基因型進(jìn)行選擇，致使育種周期長，效率低，制約著甜瓜品種改良的進(jìn)程。標(biāo)記輔助選擇，尤其是對與目標(biāo)性狀關(guān)聯(lián)的功能性分子標(biāo)記的選擇可極大提高選擇的效率，加速遺傳改良。
[0004]現(xiàn)有技術(shù)中，功能性分子標(biāo)記作為與表型相關(guān)的功能基因基序中功能性單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)開發(fā)而成的分子標(biāo)記。功能標(biāo)記的開發(fā)必須具備以下兩個條件:(I)有確定功能的候選基因并已知等位基因的序列彳目息；(2)在多個材料中對目標(biāo)性狀進(jìn)行調(diào)查， 對目標(biāo)基因進(jìn)行序列分析，結(jié)合性狀和基因序列信息進(jìn)行基于連鎖不平衡(LD)的關(guān)聯(lián)分析。功能基因定位是功能性分子標(biāo)記發(fā)掘的基礎(chǔ)，目前功能基因定位常用的方法有基于傳統(tǒng)遺傳圖譜定位與集群分離分析法(BSA)。Javier #等(2009)基于傳統(tǒng)遺傳圖譜對甜瓜糖、酸性狀進(jìn)行了 QTL定位，但該方法的周期長、密度低、成本高；而基于傳統(tǒng)集群分離分析法(BSA)可快速、有效尋找與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，但混池個數(shù)有限，一般不超過 10個，關(guān)聯(lián)分析假陽性幾率大，標(biāo)記密度低。近年來發(fā)展的選擇性基因型鑒定和集群分離分 |lf (.Super BSA), SLAFseq {Specific Location Amplified Fragments seg,特定位置擴(kuò)增片段測序)，選擇均勻分布在整個基因組、且避開重復(fù)序列區(qū)域的特異片段進(jìn)行高深度測序，通過比較SNP標(biāo)記的不同基因型在兩個混池中出現(xiàn)頻率的差異，確定與性狀緊密相關(guān)的分子標(biāo)記。Super BSA分子標(biāo)記密度高，30-200個體的混池，保證了基因定位的功效和準(zhǔn)確性。同時，由于SLAF標(biāo)簽中的多態(tài)性位點(diǎn)已經(jīng)定位在基因組上，可以根據(jù)基因組的位置使用引物設(shè)計軟件進(jìn)行引物設(shè)計，開發(fā)功能標(biāo)記。這些近幾年發(fā)展起來的分子標(biāo)記技術(shù)，通過分子標(biāo)記輔助選擇可以將傳統(tǒng)的表型選擇轉(zhuǎn)變?yōu)橹苯舆x擇基因型都具有重要的意義，但是至今未見開展甜瓜甜味酸味性狀相關(guān)基因功能性分子標(biāo)記方面的研究和報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的旨在針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，利用Super-VAS技術(shù)，提供一種甜瓜甜味酸味性狀相關(guān)基因功能性分子標(biāo)記，確定了風(fēng)味甜瓜甜味、酸味性狀相關(guān)基因序列，并在此基礎(chǔ)上成功開發(fā)了出一個甜味性狀相關(guān)基因功能性分子標(biāo)記SLAF18745-S01和三個個酸味性狀相關(guān)基因功能性分子標(biāo)記SLAF36334-S02、SLAF50072-S03和SLAF31212-S04，并通過甜味酸味標(biāo)記輔助選擇將傳統(tǒng)的表型選擇轉(zhuǎn)變?yōu)橹苯舆x擇基因型的應(yīng)用對于甜瓜甜味、酸味性狀的改良和改善具有重要的應(yīng)用價值和意義。
[0006]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的:通過對甜味、酸味性狀極端群體進(jìn)行基于簡化基因組測序(5ZA^-Seq)的選擇性基因型鑒定和集群分離分析(5i//7ar-BAS)，結(jié)合生物信息學(xué)方法定位與甜味、酸味性狀關(guān)聯(lián)緊密的候選區(qū)域，獲得性狀相關(guān)候選基因，針對該候選基因開發(fā)出甜瓜甜味、酸味性狀基因的功能性分子標(biāo)記，達(dá)到選育甜酸味品系、縮短育種周期、提高選擇準(zhǔn)確率良好的技術(shù)效果。
[0007]本發(fā)明具體提供了一種甜瓜甜味酸味性狀相關(guān)基因功能性分子標(biāo)記，包括以下步
驟獲得。[0008]( I)鑒定“風(fēng)味四號”甜瓜的父本、母本、F1及F2群體單株果實風(fēng)味。
[0009](2)對“風(fēng)味四號”甜瓜父本、母本、F2群體中只甜不酸、只酸不甜、既不酸又不甜單株DNA分別等量混池建庫，進(jìn)行簡化基因組測序，獲得SLAF標(biāo)簽，并對SLAF標(biāo)簽進(jìn)行單核苷酸(SNP)多態(tài)性分析。
[0010](3)根據(jù)多態(tài)性標(biāo)記與甜味、酸味性狀的關(guān)聯(lián)性定位甜味、酸味性狀侯選區(qū)域，并對候選區(qū)域基因進(jìn)行功能注釋。
[0011](4)根據(jù)定位的功能基因的SLAF標(biāo)簽序列，設(shè)計引物，開發(fā)甜味、酸味性狀功能性標(biāo)記。
[0012]進(jìn)一步，本發(fā)明詳細(xì)提供了一種甜瓜甜味酸味性狀相關(guān)基因功能性分子標(biāo)記，包括以下步驟獲得。
[0013](I)對“風(fēng)味四號”甜瓜的父本、母本、F1及F2代每個單株果實的甜酸味通過儀器測量結(jié)合品嘗鑒定，獲得只酸不甜、只甜不酸、既酸又甜、既不酸又不甜4種風(fēng)味。
[0014](2)通過CTAB法提取父本、母本A1及F2代每個單株基因組DNA，分別等量混合父本、母本、只酸不甜、只甜不酸、既不酸又不甜每個單株基因組DNA，形成5個混池，分別對5 個混池基因組進(jìn)行酶切，每個混池各單株同一位點(diǎn)處的DNA片段序列，經(jīng)過PCR擴(kuò)增、測序， Blat比對軟件進(jìn)聚類、Cap snp軟件檢測單核苷酸多態(tài)性，獲得多態(tài)性的SLAF標(biāo)簽。
[0015](3)根據(jù)多態(tài)性標(biāo)記與甜味、酸味性狀的關(guān)聯(lián)性使用比值關(guān)聯(lián)法進(jìn)行定位。分別計算群體既不酸又不甜的ac與甜不酸的ab之間和既不酸又不甜的ac與酸不甜的aa之間來源于不同基因型的差異比值，得到差異標(biāo)記。將與甜味、酸味性狀關(guān)聯(lián)的差異標(biāo)記通過blat 軟件比對，在雙親基因組上定位，根據(jù)標(biāo)記物理位置提取出標(biāo)記所在的基因，與Swissprot 及Kegg數(shù)據(jù)庫比對，得到與甜味性狀、酸味性狀相關(guān)的基因功能注釋，挑選出處于功能基因外顯子的SLAF標(biāo)簽。
[0016](4)根據(jù)定位的并處于外顯子的一個甜味性狀相關(guān)功能基因MEL03C011944T1 所在的標(biāo)簽SLAF18745的多態(tài)性序列、3個酸味性狀相關(guān)功能基因MEL03C020002T1、 MEL03C025794T1、MEL03C026251T1 所在標(biāo)簽 SLAF36334、SLAF50072、SLAF51212 的多態(tài)性序列，利用Primer Primer5.0軟件設(shè)計引物，以父本、母本、F1^ F2只甜不酸、只酸不甜、 既不酸又不甜材料為材料，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，發(fā)展出一個甜味性狀相關(guān)基因功能性分子標(biāo)記 SLAF18745-S01和三個酸味性狀相關(guān)基因功能性分子標(biāo)記SLAF36334-S02、SLAF50072-S03 和 SLAF31212-S04。
【權(quán)利要求】
1.一種甜瓜甜味酸味性狀相關(guān)基因功能性分子標(biāo)記的獲得方法，其特征在于，所述的獲得方法包括以下步驟:(1)將高糖甜瓜自交系“壽星”為母本與自交系“酸甜瓜”為父本進(jìn)行雜交，得到雜種F1 即“風(fēng)味4號”;由雜種F1自花授粉獲得F2代群體，對每個F2代單株果實的甜酸味通過儀器測量結(jié)合品嘗進(jìn)行鑒定，獲得只酸不甜、只甜不酸、既酸又甜、既不酸又不甜4種風(fēng)味；(2)通過CTAB法提取父本、母本、F1及F2代每個單株基因組DNA，分別等量混合父本、 母本、只酸不甜、只甜不酸、既不酸又不甜每個單株基因組DNA，形成5個混池，分別對5個混池基因組進(jìn)行酶切，每個混池各單株同一位點(diǎn)處的DNA片段序列，經(jīng)過PCR擴(kuò)增、測序，Blat 比對軟件進(jìn)行聚類、Cap snp軟件檢測單核苷酸多態(tài)性，獲得多態(tài)性的SLAF標(biāo)簽；(3)根據(jù)多態(tài)性標(biāo)記與甜味、酸味性狀的關(guān)聯(lián)性使用比值關(guān)聯(lián)法進(jìn)行定位:分別計算群體既不酸又不甜的ac與甜不酸的ab之間和既不酸又不甜的ac與酸不甜的aa之間來源于不同基因型的差異比值，得到差異標(biāo)記；將與甜味、酸味性狀關(guān)聯(lián)的差異標(biāo)記通過blat軟件比對，在雙親基因組上定位，根據(jù)標(biāo)記物理位置提取出標(biāo)記所在的基因，與Swissprot及 Kegg數(shù)據(jù)庫比對，得到與甜味性狀、酸味性狀相關(guān)的基因功能注釋，挑選出處于功能基因外顯子的SLAF標(biāo)簽；(4 )根據(jù)定位的并處于外顯子的一個甜味性狀相關(guān)功能基因MEL03C011944TI所在的標(biāo)簽SLAF18745的多態(tài)性序列、3個酸味性狀相關(guān)功能基因MEL03C020002T1、 MEL03C025794T1、MEL03C026251T1 的所在標(biāo)簽 SLAF36334、SLAF50072、SLAF51212 的多態(tài)性序列，利用Primer Primer5.0軟件設(shè)計引物，以父本、母本、只甜不酸、只酸不甜、既不酸又不甜材料為材料，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，發(fā)展出一個甜味性狀相關(guān)基因功能性分子標(biāo)記 SLAF18745-S01和三個酸味性狀相關(guān)基因功能性分子標(biāo)記SLAF36334-S02、SLAF50072-S03 和 SLAF31212-S04。
2.如權(quán)利要求1所述甜瓜甜味酸味性狀相關(guān)基因功能性分子標(biāo)記的獲得方法，其特征在于，所述的一個甜味、三個酸味性狀相關(guān)基因的功能性分子標(biāo)記相應(yīng)的DNA序列分別為:
3.一種甜味性狀相關(guān)基因功能性分子標(biāo)記SLAF18745-S01，其特征在于，甜味性狀相關(guān)基因功能性分子標(biāo)記SLAF18745-S01特異引物名稱為SLAF_N0.1，序列為:
4.一種酸味性狀相關(guān)基因功能性分子標(biāo)記SLAF36334-S02、SLAF50072-S03和 SLAF31212-S04,其特征在于，酸味性狀相關(guān)基因功能性分子標(biāo)記SLAF36334-S02、 SLAF50072-S03 和 SLAF31212-S04 特異引物名稱分別為 SLAF_N0.2、SLAF_N0.3、SLAF_N0.4， 其引物序列分別為:
5.一種如權(quán)利要求3所述的甜瓜甜味性狀相關(guān)基因功能性分子標(biāo)記的應(yīng)用，其特征在于，將甜瓜甜味性狀相關(guān)基因功能性分子標(biāo)記SLAF18745-S01用于甜瓜品種或品系的甜味基因型檢測中的應(yīng)用，具體包括以下步驟:(1)以甜瓜自交系“壽星”與其他甜瓜雜交并繁衍至F2代以上；(2)對通過步驟(1)獲得的甜瓜單個植株，提取基因組DNA，檢測提取基因組的DNA 中是否存在與甜味性狀相關(guān)功能基因MEL03C011944T1相連鎖的分子標(biāo)記；如有甜味性狀功能性分子標(biāo)記SLAF36334-S01出現(xiàn)，預(yù)測甜瓜植株是否具有甜味。
6.一種如權(quán)利要求4所述的甜瓜酸味性狀相關(guān)基因功能性分子標(biāo)記的應(yīng)用，其特征在于，酸味性狀相關(guān)基因功能性分子標(biāo)記SLAF36334-S02、SLAF50072-S03和SLAF31212-S04 用于甜瓜品種或品系的酸味基因型檢測中的應(yīng)用，具體包括以下步驟:(1)以甜瓜自交系“酸甜瓜”與其他甜瓜雜交并繁衍至F2代以上；(2)對通過步驟(1)獲得的甜瓜單個植株，提取基因組DNA，檢測提取基因組的DNA 中是否存在與酸味性狀相關(guān)功能基因MEL03C020002T1、MEL03C025794T1、MEL03C026251T1 相連鎖的分子標(biāo)記；如有酸味性狀功能性分子標(biāo)記SLAF36334-S02、SLAF50072-S03和 SLAF31212-S04出現(xiàn)，預(yù)測甜瓜植株是否具有酸味。
【文檔編號】C12N15/10GK103555717SQ201310575600
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月18日
【發(fā)明者】張紅, 吳明珠, 張永兵, 張學(xué)軍, 吳海波, 伊鴻平 申請人:新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈密瓜研究中心