一種利用金色鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)去甲基金霉素的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種利用金色鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)去甲基金霉素的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法，其培養(yǎng)基組成中含有魚油、糖蜜混合物、蚯蚓粉混合物、蛋白胨等。本發(fā)明通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基配方及發(fā)酵工藝，使得去甲基金霉素的平均發(fā)酵單位在13000mg/L以上，同國(guó)內(nèi)常規(guī)發(fā)酵水平相比，提高了10%以上，發(fā)酵周期控制在180h以下，縮短發(fā)酵周期15h以上，節(jié)能降耗，降低生產(chǎn)成本，并且最大限度的降低原輔料來(lái)源不受環(huán)境影響，保證其供應(yīng)充足，實(shí)現(xiàn)去甲基金霉素穩(wěn)定、高效的生產(chǎn)。
【專利說(shuō)明】一種利用金色鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)去甲基金霉素的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于發(fā)酵【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及一種利用金色鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)去甲基金霉素的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]去甲基金霉素是金色鏈霉菌(strepotorrycesame afaciens)的次生代謝產(chǎn)物，主要用于米諾環(huán)素和替加環(huán)索的生產(chǎn)。其鹽酸鹽抗菌性較強(qiáng)，抗菌譜與金霉素相似，其作用比四環(huán)素、土霉素強(qiáng)，比金霉素穩(wěn)定，是四環(huán)素族抗生素的衍生產(chǎn)物。
[0003]目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)于采用三級(jí)發(fā)酵模式生產(chǎn)去甲基金霉素的相關(guān)報(bào)道，其主要碳源是植物油和淀粉，氮源主要是豆餅粉、蛋白胨和酵母粉，存在的主要問(wèn)題是:
1)不同的培養(yǎng)基配方影響其菌種發(fā)酵技 術(shù)水平，國(guó)內(nèi)金色鏈霉菌生產(chǎn)發(fā)酵技術(shù)水平一般在控制在4000~10000mg/L。
[0004]2)發(fā)酵培養(yǎng)周期長(zhǎng)，一般在200h左右，導(dǎo)致出現(xiàn)能耗、發(fā)酵成本較高等一些列問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的就在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種有效提高發(fā)酵單位，縮短發(fā)酵周期，同時(shí)最大限度的降低發(fā)酵生產(chǎn)成本，且原輔料來(lái)源不受環(huán)境影響，保證其供應(yīng)充足，實(shí)現(xiàn)去甲基金霉素穩(wěn)定、高效地生產(chǎn)的利用金色鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)去甲基金霉素的培養(yǎng)基。
[0006]本發(fā)明的另一目的是提供利用上述培養(yǎng)基生產(chǎn)去甲基金霉素的培養(yǎng)方法。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的所采取的技術(shù)方案為:
一種利用金色鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)去甲基金霉素的培養(yǎng)基，包括一級(jí)種子培養(yǎng)基、二級(jí)種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于所述一級(jí)種子培養(yǎng)基組成為:魚油5~15ml/L、糖蜜混合物20~30g/U丘蝴粉混合物20~30g/L、蛋白胨10~15g/L、輕質(zhì)碳酸|丐2~8g/L、硫酸銨1~5g/L ；
所述二級(jí)種子培養(yǎng)基的組成為:魚油10~20ml/L、糖蜜混合物30~40g/L、蚯蚓粉混合物25~35g/L、蛋白胨20~25g/L、磷酸二氫鉀0.2~0.8g/L、輕質(zhì)碳酸|丐5~10g/L、硫酸銨4~10g/L、氯化鈉4~6g/L ；
所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為:魚油25~35ml/L、糖蜜混合物35~45g/L、蚯蚓粉混合物35~45g/L、蛋白胨25~30g/L、磷酸二氫鉀0.6~0.9g/L、輕質(zhì)碳酸|丐6~10g/L、硫酸銨5~10g/L、氯化鈉4~6g/L、硫酸鎂6~9g/L、氯化鐵0.2~0.6g/L、全氟化碳0.01~
0.0.05g/L。
[0008]所述糖蜜混合物的組成以重量百分比計(jì)為:生物素0.02~0.09%、泛酸0.02~
0.05%、核黃素0.04~0.07%、蔗糖轉(zhuǎn)化酶0.01~0.02%，其余為甘蔗糖蜜或甜菜糖蜜。[0009]所述蚯蚓粉混合物是由蚯蚓粉、魚粉、骨粉和棉籽餅粉按照6:2:1:1的重量配伍--? 。
[0010]一種利用上述培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)的去甲基金霉素的培養(yǎng)方法，其特征在于其工藝步驟為:將已經(jīng)培養(yǎng)好的金色鏈霉菌母瓶發(fā)酵液接入一級(jí)種子培養(yǎng)基中進(jìn)行一級(jí)種子培養(yǎng)，當(dāng)菌體濃度20~30%、pH值6~7、培養(yǎng)時(shí)間45~55h時(shí)移入二級(jí)種子培養(yǎng)基中進(jìn)行二級(jí)種子培養(yǎng)，至菌體濃度30~40%、pH值6~7、培養(yǎng)時(shí)間20~30h時(shí)移入發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，至化學(xué)效價(jià)≥12000ug/ml、菌體濃度45~55%、pH值5.7~6.3、培養(yǎng)時(shí)間160~180h時(shí)終止發(fā)酵。
[0011]所述一級(jí)種子培養(yǎng)基、二級(jí)種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基在接種培養(yǎng)前首先進(jìn)行滅菌處理，其中
滅菌后一級(jí)種子培養(yǎng)基的質(zhì)量要求:氨基氮30~40mg/100ml、總糖2~3g/100ml、pH6 ~7 ；
滅菌后二級(jí)種子培養(yǎng)基的質(zhì)量要求:氨基氮40~50mg/100ml、總糖4~6g/100ml、pH6 ~7 ；
滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量要求:氨基氮45~55mg/100ml、溶磷100~120ug/ml、總糖 5 ~7g/100ml、pH5 ~7。
[0012]所述一級(jí)種子培養(yǎng)條件為:罐壓0.01~0.05MPa ;罐溫26~28°C;空氣流量:0~5h，采用氣流攪拌代替機(jī)械攪拌，空氣流量控制在lm3/h ;6h~移種:空氣流量控制在2m3/h ；攬拌轉(zhuǎn)速60r/min ；pH6~7。
[0013]所述二級(jí)種子培養(yǎng)條件為:罐壓0.01~0.05MPa;罐溫26~28°C;空氣流量10m3/h ;攪拌轉(zhuǎn)速80r/min ；pH值6~7。
[0014]所述發(fā)酵培養(yǎng)條件為:
a pH控制:發(fā)酵培養(yǎng)初始pH6~7，發(fā)酵過(guò)程中ρΗ5.7~6.3 ;b變溫培養(yǎng)控制:
0~60h:培養(yǎng)溫度26~27°C，
61 ~150h:27 ~28°C，
151h~放罐:26~27°C ；c攪拌和溶氧控制:
0~60h:攪拌轉(zhuǎn)速控制在80r/min,溶氧濃度不得低于60%,
61~160h:攪拌轉(zhuǎn)速控制在100r/min，溶氧濃度控制在20~40%，
161h~放罐:攪拌轉(zhuǎn)速控制在80r/min,溶氧濃度控制在30%以上；d罐壓:罐壓控制在0.04~0.06MPa。
[0015]在發(fā)酵過(guò)程中進(jìn)行補(bǔ)料，包括補(bǔ)魚油、補(bǔ)水、補(bǔ)糖、補(bǔ)酸或堿和補(bǔ)氮源，其中a補(bǔ)魚油:
發(fā)酵前60h不用進(jìn)行補(bǔ)魚油，
61h~150h:脂肪含量低于1%,補(bǔ)入魚油,脂肪含量超過(guò)3%,則停止補(bǔ)油，
151h至發(fā)酵結(jié)束:脂肪含量低于0.5%，補(bǔ)入油，脂肪含量超過(guò)0.8%，則停止補(bǔ)油，b補(bǔ)
水:
發(fā)酵前60h不用進(jìn)行補(bǔ)水，61h~發(fā)酵結(jié)束:當(dāng)發(fā)酵液菌體濃度> 55%，補(bǔ)入已滅菌的飲用水，控制菌體濃度45~
55% ；
c補(bǔ)酸或堿:
發(fā)酵前60h，pH不進(jìn)行控制，
發(fā)酵61h至99h:當(dāng)pH < 6時(shí)，用5~10%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至6~6.5，當(dāng)pH
>6.5時(shí)，用20~30%的硫酸銨溶液調(diào)節(jié)pH至6~6.5，
發(fā)酵100h至發(fā)酵結(jié)束:當(dāng)pH < 5.7，用5~10%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至5.7~6.3，當(dāng)pH > 6.3，用20~30%的硫酸銨溶液調(diào)節(jié)pH至5.7~6.3 ;
d補(bǔ)入氮源:在 發(fā)酵周期分別在60h、90h和120h時(shí)補(bǔ)入氮源，其補(bǔ)入量為發(fā)酵液體積的0.5%，所述氮源為10%的蛋白胨和15%的魚粉的混合水溶液；e補(bǔ)糖:
發(fā)酵前60h，還原糖含量不進(jìn)行控制，
發(fā)酵61h至120h:當(dāng)還原糖含量< 3%，補(bǔ)入已滅菌的麥芽糖，使還原糖的含量控制在3 ~4%,
發(fā)酵121h至發(fā)酵結(jié)束:當(dāng)還原糖含量< 0.5%，補(bǔ)入已滅菌的麥芽糖，使還原糖的含量控制在0.5~1%。
[0016]本發(fā)明具有以下技術(shù)優(yōu)勢(shì):
1)使用新培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)方法，去甲基金霉素的平均發(fā)酵單位在13000mg/L以上，同國(guó)內(nèi)常規(guī)發(fā)酵水平相比，提高了 10%以上。
[0017]2)使用新培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)方法節(jié)能降耗，去甲基金霉素的發(fā)酵周期控制在180h以下，縮短發(fā)酵周期15h以上，節(jié)能降耗，降低生產(chǎn)成本。
[0018]綜上所述，本發(fā)明通過(guò)優(yōu)化其培養(yǎng)基配方，提高發(fā)酵單位，縮短發(fā)酵周期，解決了發(fā)酵成本問(wèn)題，并且最大限度的降低原輔料來(lái)源不受環(huán)境影響，保證其供應(yīng)充足，實(shí)現(xiàn)去甲基金霉素穩(wěn)定、聞效的生廣。
【具體實(shí)施方式】
[0019]下面用實(shí)例予以說(shuō)明本發(fā)明，應(yīng)該理解的是，實(shí)例是用于說(shuō)明本發(fā)明而不是對(duì)本發(fā)明的限制。本發(fā)明的范圍與核心內(nèi)容依據(jù)權(quán)利要求書加以確定。
[0020]實(shí)施例中使用的金色鏈霉菌的搖瓶效價(jià)一般為3000~5000ug/ml。
[0021]本發(fā)明中一級(jí)種子培養(yǎng)的接種量控制在0.1~0.2%，二級(jí)種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)接種量控制在10~15%。
[0022]實(shí)施例1
一級(jí)種子培養(yǎng)基lm3:魚油5L、糖蜜混合物20kg、蚯蚓粉混合物20kg、蛋白胨10kg、輕質(zhì)碳酸韓2kg、硫酸銨1kg。
[0023]二級(jí)種子培養(yǎng)基10m3:魚油100L、糖蜜混合物300kg、蚯蚓粉混合物250kg、蛋白胨200kg、磷酸二氫鉀2kg、輕質(zhì)碳酸韓50kg、硫酸銨40kg、氯化鈉40kg。
[0024]發(fā)酵培養(yǎng)基100m3:魚油2500L、糖蜜混合物3500kg、蚯蚓粉混合物3500kg、蛋白胨2500kg、磷酸二氫鉀60kg、輕質(zhì)碳酸韓600kg、硫酸銨500kg、氯化鈉400kg、硫酸鎂600kg、氯化鐵20kg、全氟化碳1kg。[0025]一級(jí)種子培養(yǎng)工藝:首先將一級(jí)種子培養(yǎng)基滅菌，冷卻，并用無(wú)菌空氣保壓，然后在火焰保護(hù)下，將已經(jīng)培養(yǎng)好的金色鏈霉菌母瓶發(fā)酵液1L接入一級(jí)種子罐進(jìn)行培養(yǎng)。滅菌后一級(jí)種子培養(yǎng)基的質(zhì)量要求:氨基氮31mg/100ml、總糖2g/100ml、pH6.8。一級(jí)種子培養(yǎng)條件為:罐壓0.01~0.05MPa ;罐溫26~28°C;空氣流量:0~5h，采用氣流攪拌代替機(jī)械攪拌，空氣流量控制在lm3/h ；6h~移種:空氣流量控制在2m3/h ;攪拌轉(zhuǎn)速60r/min ；pH6~7 ;培養(yǎng)時(shí)間45h，菌體濃度21.4% ；pH值6.6 ;無(wú)其它雜菌污染。
[0026]二級(jí)種子培養(yǎng)工藝:先將二級(jí)種子培養(yǎng)基滅菌，冷卻，并用無(wú)菌空氣保壓，然后將一級(jí)種子液全部移入二級(jí)種子罐進(jìn)行培養(yǎng)。滅菌后二級(jí)種子培養(yǎng)基的質(zhì)量要求:氨基氮40.8mg/100ml、總糖 4.lg/100ml、ρΗ6.8 ;二級(jí)種子培養(yǎng)條件為:罐壓 0.01 ~0.05MPa ;罐溫26~28 V ;空氣流量10m3/h ;攪拌轉(zhuǎn)速80r/min ;pH值6~7 ;培養(yǎng)時(shí)間20h，菌體濃度31.8% ;pH值6.7 ;無(wú)其它雜菌污染。
[0027]發(fā)酵培養(yǎng):先將發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌，冷卻，并用無(wú)菌空氣保壓，然后將二級(jí)種子液全部移入發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)。滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量要求:氨基氮46.2mg/100ml、溶磷103.6ug/ml、總糖 5.2g/100ml、pH6.7。0 ~60h:培養(yǎng)溫度 26 ~27。。；61 ~150h:培養(yǎng)溫度27~28°C。151h~放罐:培養(yǎng)溫度26~27°C ；0~60h:攪拌轉(zhuǎn)速控制在80r/min ;溶氧濃度不得低于60% ；61~160h:攪拌轉(zhuǎn)速控制在100r/min，溶氧濃度控制在20~40% ；161h~放罐:攪拌轉(zhuǎn)速控制在80r/min，溶氧濃度控制在30%以上；發(fā)酵過(guò)程中pH5.7~
6.7 ;無(wú)其它雜菌；罐壓控制在0.04~0.06`MPa。發(fā)酵培養(yǎng)160h，化學(xué)效價(jià)12138ug/ml、菌體濃度 46.3% ；pH6.3。
[0028]實(shí)施例2
一級(jí)種子培養(yǎng)基lm3:魚油7L、糖蜜混合物22kg、蚯蚓粉混合物23kg、蛋白胨11kg、輕質(zhì)碳酸韓4kg、硫酸銨2kg。
[0029]二級(jí)種子培養(yǎng)基10m3:魚油130L、糖蜜混合物330kg、蚯蚓粉混合物280kg、蛋白胨210kg、磷酸二氫鉀4kg、輕質(zhì)碳酸韓60kg、硫酸銨60kg、氯化鈉45kg。
[0030]發(fā)酵培養(yǎng)基100m3:魚油2700L、糖蜜混合物3800kg、蚯蚓粉混合物3700kg、蛋白胨2600kg、磷酸二氫鉀70kg、輕質(zhì)碳酸鈣700kg、硫酸銨600kg、氯化鈉450kg、硫酸鎂700kg、氯化鐵30kg、全氟化碳2kg。
[0031]一級(jí)種子培養(yǎng)工藝:首先將一級(jí)種子培養(yǎng)基滅菌，冷卻，并用無(wú)菌空氣保壓，然后在火焰保護(hù)下，將已經(jīng)培養(yǎng)好的金色鏈霉菌母瓶發(fā)酵液1.2L接入一級(jí)種子罐進(jìn)行培養(yǎng)。滅菌后一級(jí)種子培養(yǎng)基的質(zhì)量要求:氨基氮32.8mg/100ml、總糖2.3g/100ml、pH6.6。一級(jí)種子培養(yǎng)條件為:罐壓0.01~0.05MPa ;罐溫26~28°C;空氣流量:0~5h，采用氣流攪拌代替機(jī)械攪拌，空氣流量控制在lm3/h ;6h~移種:空氣流量控制在2m3/h ;攪拌轉(zhuǎn)速60r/min ；PH6~7 ;培養(yǎng)時(shí)間47h，菌體濃度23.8% ；pH值6.5 ;無(wú)其它雜菌污染。
[0032]二級(jí)種子培養(yǎng)工藝:先將二級(jí)種子培養(yǎng)基滅菌，冷卻，并用無(wú)菌空氣保壓，然后將一級(jí)種子液全部移入二級(jí)種子罐進(jìn)行培養(yǎng)。滅菌后二級(jí)種子培養(yǎng)基的質(zhì)量要求:氨基氮
43.2mg/100ml、總糖 4.4g/100ml、ρΗ6.5 ;二級(jí)種子培養(yǎng)條件為:罐壓 0.01 ~0.05MPa ;罐溫26~28V ;空氣流量10m3/h ;攪拌轉(zhuǎn)速80r/min ;pH值6~7 ;培養(yǎng)時(shí)間23h，菌體濃度33.1% ；pH值6.6 ;無(wú)其它雜菌污染。
[0033]發(fā)酵培養(yǎng):先將發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌，冷卻，并用無(wú)菌空氣保壓，然后將二級(jí)種子液全部移入發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)。滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量要求:氨基氮48.5mg/100ml、溶磷106.3ug/ml、總糖 5.8g/100ml、pH6.4。0 ~60h:培養(yǎng)溫度 26 ~27。。。61 ~150h:培養(yǎng)溫度27~28°C。151h~放罐:培養(yǎng)溫度26~27°C ;0~60h:攪拌轉(zhuǎn)速控制在80r/min ;溶氧濃度不得低于60% ；61~160h:攪拌轉(zhuǎn)速控制在100r/min，溶氧濃度控制在20~40% ;161h~放罐:攪拌轉(zhuǎn)速控制在80r/min，溶氧濃度控制在30%以上；發(fā)酵過(guò)程中pH5.7~6.7，無(wú)其它雜菌；罐壓控制在0.04~0.06MPa。發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間165h，化學(xué)效價(jià)12319ug/ml ;菌體濃度 48.5% ；pH6.1 ；
實(shí)施例3
一級(jí)種子培養(yǎng)基lm3:魚油10L、糖蜜混合物25kg、蚯蚓粉混合物25kg、蛋白胨12kg、輕質(zhì)碳酸韓5kg、硫酸銨3kg。
[0034]二級(jí)種子培養(yǎng)基10m3:魚油150L、糖蜜混合物350kg、蚯蚓粉混合物300kg、蛋白胨22kg、磷酸二氫鉀5kg、輕質(zhì)碳酸韓75kg、硫酸銨70kg、氯化鈉5kg。
[0035]發(fā)酵培養(yǎng)基100m3:魚油3000L、糖蜜混合物4000kg、蚯蚓粉混合物4000kg、蛋白胨2700kg、磷酸二氫鉀75kg、輕質(zhì)碳酸鈣800kg、硫酸銨750kg、氯化鈉500kg、硫酸鎂750kg、氯化鐵40kg、全氟化碳3kg。[0036]一級(jí)種子培養(yǎng)工藝:首先將一級(jí)種子培養(yǎng)基滅菌，冷卻，并用無(wú)菌空氣保壓，然后在火焰保護(hù)下，將已經(jīng)培養(yǎng)好的金色鏈霉菌母瓶發(fā)酵液1.5L接入一級(jí)種子罐進(jìn)行培養(yǎng)。滅菌后一級(jí)種子培養(yǎng)基的質(zhì)量:氨基氮35mg/100ml、總糖2.51g/100ml、pH6.5。一級(jí)種子培養(yǎng)條件為:罐壓0.01~0.05MPa ;罐溫26~28°C;空氣流量:0~5h，采用氣流攪拌代替機(jī)械攪拌，空氣流量控制在lm3/h ；6h~移種:空氣流量控制在2m3/h ;攪拌轉(zhuǎn)速60r/min ；pH6~7 ;培養(yǎng)時(shí)間50h，其菌體濃度24.9% ；pH值6.4 ;無(wú)其它雜菌污染。
[0037]二級(jí)種子培養(yǎng)工藝:先將二級(jí)種子培養(yǎng)基滅菌，冷卻，并用無(wú)菌空氣保壓，然后將一級(jí)種子液全部移入二級(jí)種子罐進(jìn)行培養(yǎng)。滅菌后二級(jí)種子培養(yǎng)基的質(zhì)量:氨基氮
44.2mg/100ml、總糖4.7g/100ml、pH6.7 ;二級(jí)種子培養(yǎng)條件為:罐壓0.01~0.05MPa ;罐溫26~28°C ;空氣流量10m3/h ;攪拌轉(zhuǎn)速80r/min ;pH值6~7。二級(jí)種子培養(yǎng)結(jié)束，培養(yǎng)時(shí)間25h，菌體濃度34.6% ；pH值6.4 ;無(wú)其它雜菌污染。
[0038]發(fā)酵培養(yǎng):先將發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌，冷卻，并用無(wú)菌空氣保壓，然后將二級(jí)種子液全部移入發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)。滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量要求:氨基氮50.lmg/100ml、溶磷lllug/ml、總糖6g/100ml、pH6.4。變溫培養(yǎng)控制:0~60h:培養(yǎng)溫度26~27 °C。61~150h:27~28°C。151h~放罐:26~27°C ;攪拌和溶氧控制:0~60h:攪拌轉(zhuǎn)速控制在80r/min ；0~60h:溶氧濃度不得低于60% ；61~160h:攪拌轉(zhuǎn)速控制在100r/min,溶氧濃度控制在20~40% ；161h~放罐:攪拌轉(zhuǎn)速控制在80r/min，溶氧濃度控制在30%以上；發(fā)酵過(guò)程中罐壓控制在0.04~0.06MPa, pH5.7~6.7，無(wú)其它雜菌。培養(yǎng)時(shí)間170h，化學(xué)效價(jià) 12563ug/ml ;菌體濃度 51% ；pH 值 6.1。
[0039]實(shí)施例4
一級(jí)種子培養(yǎng)基lm3:魚油12L、糖蜜混合物28kg、蚯蚓粉混合物27kg、蛋白胨14kg、輕質(zhì)碳酸韓7kg、硫酸銨4kg。
[0040]二級(jí)種子培養(yǎng)基10m3:魚油180L、糖蜜混合380kg、蚯蚓粉混合物320kg、蛋白胨230kg、磷酸二氫鉀6kg、輕質(zhì)碳酸韓90kg、硫酸銨80kg、氯化鈉55kg。[0041]發(fā)酵培養(yǎng)基100m3:魚油3300L、糖蜜混合物4350kg、蚯蚓粉混合物4400kg、蛋白胨2800kg、磷酸二氫鉀80kg、輕質(zhì)碳酸鈣900kg、硫酸銨900kg、氯化鈉550kg、硫酸鎂800kg、氯化鐵50kg、全氟化碳4kg。
[0042]一級(jí)種子培養(yǎng)工藝:首先將一級(jí)種子培養(yǎng)基滅菌，冷卻，并用無(wú)菌空氣保壓，然后在火焰保護(hù)下，將已經(jīng)培養(yǎng)好的金色鏈霉菌母瓶發(fā)酵液1.7L接入一級(jí)種子罐進(jìn)行培養(yǎng)。滅菌后一級(jí)種子培養(yǎng)基的質(zhì)量:氨基氮37mg/100ml、總糖2.7g/100ml、pH6.4。一級(jí)種子培養(yǎng)條件為:罐壓0.01~0.05MPa ;罐溫26~28°C;空氣流量:0~5h，采用氣流攪拌代替機(jī)械攪拌，空氣流量控制在lm3/h ；6h~移種:空氣流量控制在2m3/h ;攪拌轉(zhuǎn)速60r/min ；pH6~7 ;培養(yǎng)時(shí)間52h。一級(jí)種子培養(yǎng)結(jié)束，菌體濃度27.6% ；pH值6.3 ;無(wú)其它雜菌污染。
[0043]二級(jí)種子培養(yǎng)工藝:先將二級(jí)種子培養(yǎng)基滅菌，冷卻，并用無(wú)菌空氣保壓，然后將一級(jí)種子液全部移入二級(jí)種子罐進(jìn)行培養(yǎng)。滅菌后二級(jí)種子培養(yǎng)基的質(zhì)量:氨基氮47mg/100ml、總糖5.4g/100ml、ρΗ6.3 ;二級(jí)種子培養(yǎng)條件為:罐壓0.01~0.05MPa ;罐溫26~28°C;空氣流量10m3/h ;攪拌轉(zhuǎn)速80r/min ;pH值6~7。。 二級(jí)種子培養(yǎng)結(jié)束，培養(yǎng)時(shí)間28h，其菌體濃度37.8% ；pH值6.2 ;無(wú)其它雜菌污染。
[0044]發(fā)酵培養(yǎng):先將發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌，冷卻，并用無(wú)菌空氣保壓，然后將二級(jí)種子液全部移入發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)。滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量:氨基氮52.6mg/100ml、溶磷114.7ug/ml、總糖6.4g/100ml、pH6.1。變溫培養(yǎng)控制:0~60h:培養(yǎng)溫度26~27°C。61~150h:27~28°C。151h~放罐:26~27°C ;攪拌和溶氧控制:0~60h:攪拌轉(zhuǎn)速控制在80r/min ；0~60h:溶氧濃度不得低于60% ；61~160h:攪拌轉(zhuǎn)速控制在100r/min,溶氧濃度控制在20~40% ；161h~放罐:攪拌轉(zhuǎn)速控制在80r/min，溶氧濃度控制在30%以上；發(fā)酵過(guò)程中罐壓控制在0.04~0.06MPa，pH控制在5.7~6.7，無(wú)其它雜菌。發(fā)酵培養(yǎng)175h，化學(xué)效價(jià)12413ug/ml，菌體濃度52% ；pH值5.9。
[0045]實(shí)施例5
一級(jí)種子培養(yǎng)基lm3:魚油15L、糖蜜混合物30kg、il丘蝴粉混合物30kg、蛋白胨15kg、輕質(zhì)碳酸韓8kg、硫酸銨5kg。
[0046]二級(jí)種子培養(yǎng)基10m3:魚油200L、糖蜜混合物400kg、蚯蚓粉混合物350kg、蛋白胨250kg、磷酸二氫鉀8kg、輕質(zhì)碳酸|丐100kg、硫酸銨100kg、氯化鈉60kg。
[0047]發(fā)酵培養(yǎng)基100m3:魚油3500L、糖蜜混合物4500kg、蚯蚓粉混合物4500kg、蛋白胨3000kg、磷酸二氫鉀90kg、輕質(zhì)碳酸鈣1000kg、硫酸銨1000kg、氯化鈉600kg、硫酸鎂900kg、氯化鐵60kg、全氟化碳5kg。
[0048]一級(jí)種子培養(yǎng)工藝:首先將一級(jí)種子培養(yǎng)基滅菌，冷卻，并用無(wú)菌空氣保壓，然后在火焰保護(hù)下，將已經(jīng)培養(yǎng)好的金色鏈霉菌母瓶發(fā)酵液2L入一級(jí)種子罐進(jìn)行培養(yǎng)。滅菌后一級(jí)種子培養(yǎng)基的質(zhì)量:氨基氮39mg/100ml、總糖3g/100ml、pH6。一級(jí)種子培養(yǎng)條件為:罐壓0.01~0.05MPa ;罐溫26~28 °C ;空氣流量:0~5h，采用氣流攪拌代替機(jī)械攪拌，空氣流量控制在lm3/h ；5h~移種:空氣流量控制在2m3/h ;攪拌轉(zhuǎn)速60r/min ；pH6~7。一級(jí)種子培養(yǎng)結(jié)束，培養(yǎng)時(shí)間55h，其菌體濃度30%，pH值6，無(wú)其它雜菌污染。
[0049]二級(jí)種子培養(yǎng)工藝:先將二級(jí)種子培養(yǎng)基滅菌，冷卻，并用無(wú)菌空氣保壓，然后將一級(jí)種子液全部移入二級(jí)種子罐進(jìn)行培養(yǎng)。滅菌后二級(jí)種子培養(yǎng)基的質(zhì)量:氨基氮50mg/100ml、總糖5.9g/100ml、ρΗ6.1。二級(jí)種子培養(yǎng)條件為:罐壓0.01~0.05MPa ;罐溫26~28°C ;空氣流量10m3/h ;攪拌轉(zhuǎn)速80r/min ;pH值6~7。二級(jí)種子培養(yǎng)結(jié)束，培養(yǎng)時(shí)間30h，其菌體濃度39% ;pH值6.2 ;無(wú)其它雜菌污染。
[0050]發(fā)酵培養(yǎng):先將發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌，冷卻，并用無(wú)菌空氣保壓，然后將二級(jí)種子液全部移入發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)。滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量:氨基氮54mg/100ml、溶磷118ug/ml、總糖6.8g/100ml、pH5.7。發(fā)酵培養(yǎng)條件為:變溫培養(yǎng)控制:0~60h:培養(yǎng)溫度26~27°C。61~150h:27~28°C。151h~放罐:26~27°C ;攪拌和溶氧控制:0~60h:攪拌轉(zhuǎn)速控制在80r/min ；0~60h:溶氧濃度不得低于60% ；61~160h:攪拌轉(zhuǎn)速控制在100r/min,溶氧濃度控制在20~40% ；161h~放罐:攪拌轉(zhuǎn)速控制在80r/min，溶氧濃度控制在30%以上；發(fā)酵過(guò)程中PH5.7~6.7，罐壓控制在0.04~0.06MPa,無(wú)其它雜菌。發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束，培養(yǎng)時(shí)間180h ;化學(xué)效價(jià)12457ug/ml ;菌體濃度53% ；pH5.8。
[0051]對(duì)比實(shí)施例
配置一級(jí)種子培養(yǎng)基組lm3,淀粉18kg、葡萄糖24kg、黃豆餅粉25kg、酵母粉23kg、蛋白胨12kg、輕質(zhì)碳酸韓6kg、硫酸銨4kg。
[0052]配置二級(jí)種子培養(yǎng)基10m3:淀粉200kg、葡萄糖280kg、黃豆餅粉250kg、酵母粉230kg、蛋白胨120kg、磷酸二氫鉀5kg、輕質(zhì)碳酸韓50kg、硫酸銨50kg、氯化鈉45kg、氯化鉀70kg。
[0053]配置發(fā)酵培養(yǎng)基100m3:淀粉2300kg、葡萄糖2000kg、黃豆餅粉2100kg、酵母粉1800kg、蛋白胨1500kg、磷酸二氫鉀70kg、輕質(zhì)碳酸|丐700kg、硫酸銨600kg、氯化鈉450kg、氯化鈷15kg、硫酸鎂700kg。
[0054]一級(jí)種子培養(yǎng)條件:溫度26~28°C 培養(yǎng)時(shí)間:60~72h
二級(jí)種子培養(yǎng):溫度26~28°C、罐壓控制在0.03~0.05MPa、空氣進(jìn)氣量控制在10~20m3、攪拌轉(zhuǎn)速控制在80~100r/min、溶氧大于lppm、培養(yǎng)時(shí)間36~48h。
[0055]發(fā)酵條件:溫度26~28°C、罐壓控制在0.04~0.06MPa、空氣進(jìn)氣量控制在300~500m3、攪拌轉(zhuǎn)速 控制在100~150r/min、溶氧大于3ppm、發(fā)酵時(shí)間9天。發(fā)酵過(guò)程中進(jìn)行補(bǔ)料，分別補(bǔ)入葡萄糖、水和乳酸。發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束，其化學(xué)效價(jià)為10231ug/ml。
【權(quán)利要求】
1.一種利用金色鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)去甲基金霉素的培養(yǎng)基，包括一級(jí)種子培養(yǎng)基、二級(jí)種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于所述一級(jí)種子培養(yǎng)基組成為:魚油5~15ml/L、糖蜜混合物20~30g/U丘蝴粉混合物20~30g/L、蛋白胨10~15g/L、輕質(zhì)碳酸|丐2~8g/L、硫酸銨1~5g/L ；所述二級(jí)種子培養(yǎng)基的組成為:魚油10~20ml/L、糖蜜混合物30~40g/L、蚯蚓粉混合物25~35g/L、蛋白胨20~25g/L、磷酸二氫鉀0.2~0.8g/L、輕質(zhì)碳酸|丐5~10g/L、硫酸銨4~10g/L、氯化鈉4~6g/L ；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為:魚油25~35ml/L、糖蜜混合物35~45g/L、蚯蚓粉混合物35~45g/L、蛋白胨25~30g/L、磷酸二氫鉀0.6~0.9g/L、輕質(zhì)碳酸|丐6~10g/L、硫酸銨5~10g/L、氯化鈉4~6g/L、硫酸鎂6~9g/L、氯化鐵0.2~0.6g/L、全氟化碳0.01~0.0.05g/L。
2.按照權(quán)利要求1所述的利用金色鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)去甲基金霉素的培養(yǎng)基，其特征在于所述糖蜜混合物的組成以重量百分比計(jì)為:生物素0.02~0.09%、泛酸0.02~0.05%、核黃素0.04~0.07%、蔗糖轉(zhuǎn)化酶0.01~0.02%，其余為甘蔗糖蜜或甜菜糖蜜。
3.按照權(quán)利要求1所述的利用金色鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)去甲基金霉素的培養(yǎng)基，其特征在于所述蚯蚓粉混合物是由蚯蚓粉、魚粉、骨粉和棉籽餅粉按照6:2:1:1的重量配伍而成。
4.一種利用權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)的去甲基金霉素的培養(yǎng)方法，其特征在于其工藝步驟為:將已經(jīng)培養(yǎng)好的金色鏈霉菌母瓶發(fā)酵液接入一級(jí)種子培養(yǎng)基中進(jìn)行一級(jí)種子培養(yǎng)，當(dāng)菌體濃度20~30%、pH值6~7、培養(yǎng)時(shí)間45~55h時(shí)移入二級(jí)種子培養(yǎng)基中進(jìn)行二級(jí)種子培養(yǎng)，至菌體濃度30~40%、pH值6~7、培養(yǎng)時(shí)間20~30h時(shí)移入發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培 養(yǎng)，至化學(xué)效價(jià)≥12000ug/mU菌體濃度45~55%、pH值5.7~6.3、培養(yǎng)時(shí)間160~180h時(shí)終止發(fā)酵。
5.按照權(quán)利要求4所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述一級(jí)種子培養(yǎng)基、二級(jí)種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基在接種培養(yǎng)前首先進(jìn)行滅菌處理，其中滅菌后一級(jí)種子培養(yǎng)基的質(zhì)量要求:氨基氮30~40mg/100ml、總糖2~3g/100ml、pH6 ~7 ；滅菌后二級(jí)種子培養(yǎng)基的質(zhì)量要求:氨基氮40~50mg/100ml、總糖4~6g/100ml、pH6 ~7 ；滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量要求:氨基氮45~55mg/100ml、溶磷100~120ug/ml、總糖 5 ~7g/100ml、pH5 ~7。
6.按照權(quán)利要求4所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述一級(jí)種子培養(yǎng)條件為:罐壓0.01~0.05MPa ;罐溫26~28 °C ;空氣流量:0~5h，采用氣流攪拌代替機(jī)械攪拌，空氣流量控制在lm3/h ；6h~移種:空氣流量控制在2m3/h ;攪拌轉(zhuǎn)速60r/min ；pH6~7。
7.按照權(quán)利要求4所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述二級(jí)種子培養(yǎng)條件為:罐壓0.01~0.05MPa ;罐溫26~28°C ;空氣流量10m3/h ;攪拌轉(zhuǎn)速80r/min ;pH值6~7。
8.按照權(quán)利要求4所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)條件為:a pH控制:發(fā)酵培養(yǎng)初始pH6~7，發(fā)酵過(guò)程中ρΗ5.7~6.3 ;b變溫培養(yǎng)控制:0~60h:培養(yǎng)溫度26~27°C，`61 ~150h:27 ~28°C，`151h~放罐:26~27°C ；c攪拌和溶氧控制:`0~60h:攪拌轉(zhuǎn)速控制在80r/min,溶氧濃度不得低于60%,`61~160h:攪拌轉(zhuǎn)速控制在100r/min，溶氧濃度控制在20~40%，`161h~放罐:攪拌轉(zhuǎn)速控制在80r/min,溶氧濃度控制在30%以上；d罐壓:罐壓控制在0.04~0.06MPa。
9.按照權(quán)利要求4所述的培養(yǎng)方法，其特征在于在發(fā)酵過(guò)程中進(jìn)行補(bǔ)料，包括補(bǔ)魚油、補(bǔ)水、補(bǔ)糖、補(bǔ)酸或堿和補(bǔ)氮源，其中a補(bǔ)魚油:發(fā)酵前60h不用進(jìn)行補(bǔ)魚油，`61h~150h:脂肪含量低于1%,補(bǔ)入魚油,脂肪含量超過(guò)3%,則停止補(bǔ)油，`151h至發(fā)酵結(jié)束:脂肪含量低于0.5%，補(bǔ)入油，脂肪含量超過(guò)0.8%，則停止補(bǔ)油，b補(bǔ)水:發(fā)酵前60h不用進(jìn)行補(bǔ)水，`61h~發(fā)酵結(jié)束:當(dāng)發(fā)酵液菌體濃度> 55%，補(bǔ)入已滅菌的飲用水，控制菌體濃度45~`55% ；c補(bǔ)酸或堿:發(fā)酵前60h，pH不進(jìn)行控制，發(fā)酵61h至99h:當(dāng)pH < 6時(shí)，用5~10%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至6~6.5，當(dāng)pH>6.5時(shí)，用20~30%的硫酸銨溶液調(diào)節(jié)pH至6~6.5，發(fā)酵100h至發(fā)酵結(jié)束:當(dāng)pH < 5.7，用5~10%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至`5.7~6.3，當(dāng)pH > 6.3，用20~30%的硫酸銨溶液調(diào)節(jié)pH至5.7~6.3 ;d補(bǔ)入氮源:在發(fā)酵周期分別在60h、90h和120h時(shí)補(bǔ)入氮源，其補(bǔ)入量為發(fā)酵液體積的0.5%，所述氮源為10%的蛋白胨和15%的魚粉的混合水溶液；e補(bǔ)糖:發(fā)酵前60h，還原糖含量不進(jìn)行控制，發(fā)酵61h至120h:當(dāng)還原糖含量< 3%，補(bǔ)入已滅菌的麥芽糖，使還原糖的含量控制在`3 ~4%,發(fā)酵121h至發(fā)酵結(jié)束:當(dāng)還原糖含量< 0.5%，補(bǔ)入已滅菌的麥芽糖，使還原糖的含量控制在0.5~1%。
【文檔編號(hào)】C12P29/00GK103642886SQ201310575478
【公開(kāi)日】2014年3月19日 申請(qǐng)日期:2013年11月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月18日
【發(fā)明者】任勇, 王 義 申請(qǐng)人:寧夏泰瑞制藥股份有限公司