一株降解聚乙烯的腸桿菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了降解聚乙烯的腸桿菌及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的菌株為腸桿菌(Enterobacter cancerogenus)YZ1 CGMCC No.6816。本發(fā)明提供的菌劑活性成分為腸桿菌(Enterobacter cancerogenus)YZ1 CGMCC No.6816。本發(fā)明提供的菌株對聚乙烯塑料能夠有效的侵蝕和降解。本發(fā)明提供的菌劑，生產(chǎn)成本低，能夠在60天內(nèi)降解5%(質(zhì)量百分比)的聚乙烯。本發(fā)明所提供的菌株和菌劑可以適用于垃圾填埋場和各種水體和土壤環(huán)境中的聚乙烯廢物，能夠保證聚乙烯能被生物降解。本發(fā)明提供的篩選能夠高效降解塑料的微生物的方法可以快速有效地獲得高純度、高活性的可降解塑料的微生物。本發(fā)明能夠為解決當(dāng)前聚乙烯塑料廢物對環(huán)境的污染和大量占用填埋場填埋容量的問題提供技術(shù)和方法，對于保護環(huán)境和降低垃圾的處理成本具有重要意義。
CGMCC No.6816
2012.11.12
【專利說明】-株降解聚乙烯的腸桿菌及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)和環(huán)境【技術(shù)領(lǐng)域】。具體而言，本發(fā)明涉及篩選可快速降解塑 料的微生物的方法及該微生物的用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 隨著人類社會的不斷發(fā)展，人口的增加及技術(shù)的不斷進步，塑料已經(jīng)應(yīng)用在了人 類生活和生產(chǎn)的各個方面。聚乙烯以其優(yōu)良的性能已成為人們生活生產(chǎn)中使用廣泛，極其 重要的產(chǎn)品，其是合成樹脂中產(chǎn)量最高的品種，約占塑料總產(chǎn)量的四分之一。全球2011年 聚乙烯產(chǎn)量已經(jīng)達到1. 32X 109噸。然而，由于聚乙烯在自然環(huán)境中極難降解，因此如何處 理廢舊聚乙烯已成為了一大難題。
[0003] 目前，焚燒和填埋是最常用的處理方法。焚燒過程中會產(chǎn)生大量二氧化硫、氮氧化 物、二惡英等有害氣體，給環(huán)境帶來二次污染；而填埋處理將會占用大量土地。據(jù)報道，未經(jīng) 前處理過的聚乙烯在土壤中填埋30年，其礦化率不到0. 2%。
[0004] 為了解決由于廢舊塑料引起的環(huán)境污染問題，世界各國研究人員都在努力探尋一 種有效處理塑料的方法。一方面為對聚乙烯塑料進行改性，即向傳統(tǒng)塑料中加入一些促進 降解的添加劑(如過渡金屬絡(luò)合物等光敏劑)，或者共混添加易降解的天然高分子(如淀粉， 纖維素，蛋白質(zhì)等)。但是這種方法成本高，不耐用，聚乙烯的原有性質(zhì)得不到保證。另一方 面采用物理或化學(xué)方法處理聚乙烯，如對其進行減容、切碎、直接熱裂解、催化裂解、超臨界 流體技術(shù)等，處理后使聚乙烯降解成低分子產(chǎn)物，產(chǎn)物可作為化工原料重新利用。然而這種 方法成本高，耗能巨大，降解效果不穩(wěn)定。
[0005] 因此，目前對于廢舊塑料的處理方法還有待進一步改進。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是旨在提供一株降解聚乙烯的腸桿菌株及其應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明提供的腸桿菌（Enterobacter cancerogenus)，名稱為YZ1，屬于生癌腸桿 菌（Enterobacter cancerogenus),已于2012年11月12日保藏于中國微生物菌種保藏管 理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號），保藏 編號為 CGMCC No. 6816。
[0008] 本發(fā)明還保護一種菌劑，它的活性成分為腸桿菌（Enterobacter cancerogenus) YZ1 CGMCC No. 6816。
[0009] 所述菌株和/或菌劑在降解聚乙烯塑料中的應(yīng)用屬于本發(fā)明的保護范圍；所述聚 乙烯包括各種規(guī)格和形狀的聚乙烯塑料的至少一種。
[0010] 本發(fā)明還保護一種所述菌株和菌劑在降解聚乙烯塑料廢物中的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明還保護一種降解聚乙烯塑料廢物的方法，該方法包括：在將上述的菌株和 /或菌劑與塑料接觸，由此可以利用生物降解的方法處理聚乙烯塑料廢物。
[0012] 所述的應(yīng)用，其特征在于：所述聚乙烯塑料廢物存在于垃圾填埋場中和/或各種 水體環(huán)境中的至少一種。
[0013] 本發(fā)明的一個目的在于提出一種具有快速有效地篩選可降解塑料菌株的方法，通 過該方法篩選得到的菌株能夠高效降解塑料。
[0014] 所述篩選可降解塑料菌株的方法包括：以塑料為碳源，對嚙噬塑料昆蟲的鞘翅目 擬步甲蟲科昆蟲（Coleoptera:Tenebrionidae)的腸道菌群進行培養(yǎng)，以便獲得所述可降 解塑料菌株。
[0015] 所述篩選可降解塑料菌株的方法進一步包括：獲得所述嚙噬塑料昆蟲的腸道內(nèi)容 物；將所述腸道內(nèi)容物與生理鹽水混合，以便獲得腸道菌懸液；以及利用無機鹽培養(yǎng)基，并 且采用聚乙烯塑料作為唯一碳源，對所述獲得腸道菌懸液的至少一部分進行富集培養(yǎng)，以 便獲得含有所述可降解塑料微生物的培養(yǎng)液。利用固體培養(yǎng)基，對所述含有所述可降解塑 料微生物的培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，以便獲得所述可降解塑料的微生物的單菌落。
[0016] 生產(chǎn)菌劑的工藝為：斜面種-搖瓶種-種子罐-生產(chǎn)罐-產(chǎn)品（包裝劑型為液體 菌劑或固體吸附菌劑）。
[0017] 用所述菌株制備所述菌劑具體可采用如下步驟：
[0018] 1、將菌株YZ1 (原種）在培養(yǎng)皿上活化，并測定降解性能，接種于試管斜面上備用。
[0019] 2、將試管種接種于2000ml搖瓶（含400ml肉湯培養(yǎng)基）中，恒溫振蕩培養(yǎng)至對數(shù) 期，準(zhǔn)備接種種子罐。
[0020] 3、配制發(fā)酵培養(yǎng)基（葡萄糖 1%，ΚΗ2Ρ040· 2% ;Κ2ΗΡ040· 2% ;ΝΗ4Ν030· 1% ; MgS04 · 7Η200· 05% ;NaC10. 01% ;FeS04 · 7Η200· 03% ;ZnS04 · 7Η200· 03% ;MnS04 · 7Η200· 03% ;酵 母膏0. 03% ;pH值7. 2?7. 5)，將400升發(fā)酵培養(yǎng)基加入500升種子罐，121°C高壓濕熱滅 菌，冷卻至33°C后，將搖瓶菌種按10% (體積百分比）的接種量接種入種子罐，培養(yǎng)至對數(shù)生 長期，攪拌速度為200轉(zhuǎn)/分，無菌空氣通入量為1:0. 6 (體積比）。
[0021] 4、生產(chǎn)罐（生產(chǎn)量為4噸）所采用培養(yǎng)基成分與發(fā)酵培養(yǎng)基相同（投料量3. 5 噸），投料后的生產(chǎn)罐1. lkg/cm2的壓力下，121°C高壓濕熱滅菌，滅菌后冷卻至室溫。通無 菌空氣后,將對數(shù)期的種子液按10%(體積百分比）的接種量加入生產(chǎn)罐，接種后生產(chǎn)罐的 溫度控制在28?35°C，生產(chǎn)罐培養(yǎng)過程中無菌空氣的通氣量為1:0. 6,攪拌速度為180轉(zhuǎn) /分，整個工藝流程培養(yǎng)時間為24?35小時；發(fā)酵結(jié)束后菌體數(shù)量達到109個/ml以上。
[0022] 5、發(fā)酵完成后培養(yǎng)液出罐直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑型。
[0023] 本發(fā)明提供了一種聚乙烯降解菌株和菌劑，在60天內(nèi)最大降解率為5%，這為利用 生物降解聚乙烯塑料廢物提供了 一種可行的技術(shù)手段。將該菌株和/菌劑應(yīng)用到垃圾填埋 場，能夠有效降解垃圾中的聚乙烯廢物，提高垃圾填埋場的填埋容量，能創(chuàng)造顯著的經(jīng)濟和 環(huán)境保護效益。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024] 本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點從結(jié)合下面附圖對實施例的描述中將變 得明顯和容易理解，其中 ：
[0025] 圖1是根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，固體培養(yǎng)下聚乙烯膜上腸桿菌的生長曲線；(a) 菌落形成單位法（CFU)計數(shù)和（b)實時定量基因擴增熒光檢測（qPCR)計數(shù)結(jié)果。
[0026] 圖2是根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，聚乙烯膜上腸桿菌的生長活性。（a)掃描電鏡 (SEM)觀察28天聚乙烯塑料膜面微生物細(xì)和（b)菌生存力測試（BacLight Dead/Live)觀 察28天聚乙烯塑料膜面微生物，紅色為死菌，綠色為活菌。
[0027] 圖3是根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，聚乙烯膜降解的形貌觀察。（a)空白聚乙烯塑料 膜的SEM觀察，（b)降解28天后的聚乙烯塑料膜SEM觀察，（c)空白聚乙烯塑料膜的原子力 顯微鏡（AFM)觀察，（d)降解28天后的聚乙烯塑料膜AFM觀察。
[0028] 圖4是根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，聚乙烯膜的衰減全反射-傅里葉變換紅外光譜 法（ATR-FTIR)測試結(jié)果。空白聚乙烯塑料膜和YZ1菌株降解28天后的聚乙烯塑料膜。
[0029] 圖5是根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，聚乙烯膜本身的抗拉強度測試測試結(jié)果。
[0030] 圖6是根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，以聚乙烯塑料為唯一碳源在液體培養(yǎng)下腸桿菌 的生長曲線。
[0031] 圖7是根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，在液體培養(yǎng)基下培養(yǎng)腸桿菌對聚乙烯的降解速 率。 具體實施例
[0032] 下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終 相同或類似的標(biāo)號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附 圖描述的實施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。
[0033] 下面通過具體的實施例，對本發(fā)明進行說明，需要說明的是這些實施例僅僅是為 了說明目的，而不能以任何方式解釋成對本發(fā)明的限制。另外，在下列實施例中如果沒有特 別說明，則所采用的設(shè)備和材料均為市售可得的。
[0034] 實施例1
[0035] 一、腸桿菌（Enterobacter cancerogenus)YZl 的篩選與分離培養(yǎng)
[0036] 對嚙噬塑料昆蟲蟲體進行消毒，使用75% (v/v)的乙醇洗凈蟲體，之后用無菌水沖 洗兩次以洗去蟲身上酒精，至蟲體潔凈。無菌條件下在培養(yǎng)皿中進行操作。取出已消毒的 蟲體，解剖后拉出其腸道。之后在腸道邊滴一滴生理鹽水，并用彎頭鑷子頭部輕輕趕出腸 道中腸液，用移液器提取腸液，再使用〇. 85%生理鹽水稀釋5倍，制成腸道菌懸液。將制備 好的腸道菌懸液lml加入錐形瓶中，再量取19ml滅菌液體無機鹽培養(yǎng)基加入錐形瓶，制成 20ml液體培養(yǎng)腸道菌液。液體無機鹽培養(yǎng)基配方為：KH 2P040. 7g，K2HP040. 7g，NH4N031. 0g， MgS04 · 7H200. 7g，NaClO. 005g，F(xiàn)eS04 · 7H200. 002g，ZnS04 · 7H200. 002g，MnS04 · 7H200. 001g， 水1000ml。將已消毒的聚乙烯膜（1 X lcm2、0. 5 X 0. 5cm2兩種大小)加入到菌液中作為底物， 在28°C條件下以150rpm的速度培養(yǎng)，培養(yǎng)時間60天。以聚乙烯為唯一碳源誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)， 完畢后用移液器器吸取〇. lml進行平板涂布，挑取長出的單菌落進行劃線分離，經(jīng)過5次劃 線分離后得到腸桿菌（Enterobacter cancerogenus)YZl單菌，對其進行保藏。
[0037] 二、腸桿菌（Enterobacter cancerogenus)YZl 的鑒定
[0038]

【權(quán)利要求】
1. 腸桿菌（Enterobacter cancerogenus)YZl，其保藏編號為 CGMCC Νο·6816。
2. 一種菌劑，它的活性成分為腸桿菌（Enterobacter cancerogenus) ΥΖ1 CGMCC No.6816。
3. 權(quán)利要求1所述的腸桿菌或權(quán)利要求2所述的菌劑在降解聚乙烯塑料中的應(yīng)用；所 述聚乙烯塑料包括各種規(guī)格和形狀的聚乙烯塑料的至少一種。
4. 權(quán)利要求1所述的腸桿菌或權(quán)利要求2中所述的菌劑在降解聚乙烯塑料廢物中的應(yīng) 用。
5. -種降解聚乙烯塑料廢物的方法，該方法包括：在將權(quán)利要求1所述的腸桿菌或權(quán) 利要求2中所述的菌劑與塑料接觸，由此可以利用生物降解的方法處理聚乙烯塑料廢物。
6. 權(quán)利要求4所述的應(yīng)用或權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述聚乙烯塑料廢物 存在于垃圾填埋場中。
7. 權(quán)利要求4所述的應(yīng)用或權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述聚乙烯塑料廢物 存在于各種水體和/或土壤環(huán)境中。
8. 權(quán)利要求1或權(quán)利要求2中所述腸桿菌（Enterobacter cancerogenus) YZ1的分離 方法為：以塑料為碳源，對哨噬塑料昆蟲（Coleoptera:Tenebrionidae)的腸道菌群進行富 集培養(yǎng)，以便獲得所述可降解塑料菌株。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，包括： 獲得所述哨噬塑料的鞘翅目擬步甲蟲科昆蟲（Coleoptera:Tenebrionidae)的腸道內(nèi) 容物； 將所述哨噬塑料鞘翅目擬步甲蟲科昆蟲（Coleoptera:Tenebrionidae)的腸道內(nèi)容物 與生理鹽水混合，以便獲得腸道菌懸液；以及利用無機鹽培養(yǎng)基，并且采用塑料作為唯一碳 源，對所述獲得腸道菌懸液的至少一部分進行培養(yǎng)，以便獲得含有所述可降解塑料微生物 的培養(yǎng)液。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，進一步包括： 利用固體LB培養(yǎng)基，對所述含有所述可降解塑料微生物的培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，以便獲得 所述可降解塑料的微生物的單菌落。
【文檔編號】C12R1/01GK104232501SQ201310566604
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2013年11月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月6日
【發(fā)明者】楊軍, 魏軼豐, 趙姣, 楊宇, 周麗沙, 楊仁濤, 汪祥燕, 蘇晴晴, 于憶瀟, 周宇平, 楊瑞馥 申請人:北京航空航天大學(xué), 深圳華大基因科技有限公司