制備鼠李糖脂發(fā)酵液的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于微生物制劑的制備，特別是指制備鼠李糖脂發(fā)酵液的方法。將擴(kuò)培后含有銅綠假單胞菌CGMCC?NO.8377（Pscudomonas?acruginosa）的種子液按照質(zhì)量百分比為8%-10%的接種量接入到滅菌后的發(fā)酵罐培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基中含有碳源、必要的氮源及營養(yǎng)物質(zhì)，調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值進(jìn)行通氣發(fā)酵，在發(fā)酵過程中向發(fā)酵培養(yǎng)基中補(bǔ)入碳源、營養(yǎng)物質(zhì)、增稠劑，經(jīng)通氣發(fā)酵得到含有鼠李糖脂的發(fā)酵液。本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)存在的生產(chǎn)成本高、產(chǎn)品得率低等問題，具有產(chǎn)品得率高、菌種代謝正常、生產(chǎn)成本低、工藝易于實(shí)現(xiàn)等特點(diǎn)。
【專利說明】制備鼠李糖脂發(fā)酵液的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物制劑的制備，特別是指制備鼠李糖脂發(fā)酵液的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]鼠李糖脂是一種新型生物表面活性劑，具有乳化、增溶和降低界面張力等功能，且低毒、易生物降解，在石油化工、生物醫(yī)藥、食品衛(wèi)生及環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域有良好應(yīng)用前景。通常的生產(chǎn)方法是利用銅綠假單胞菌以葡萄糖、蓖麻油等不同碳源為基礎(chǔ)原料合成鼠李糖月旨。上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題是以葡萄糖、蓖麻油等基礎(chǔ)原料生產(chǎn)鼠李糖脂成本較高；同時由于工藝設(shè)計的不合理，存在著產(chǎn)品得率低(發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵液中鼠李糖脂的濃度為55 g /L)，發(fā)酵過程中由于鼠李糖脂的產(chǎn)生發(fā)酵液中的泡沫增多，使發(fā)酵過程中通風(fēng)量量小，導(dǎo)致菌種由于供氧量的不足，影響發(fā)酵過程中的菌種代謝速度等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供產(chǎn)品得率高、生產(chǎn)成本低的制備鼠李糖脂發(fā)酵液的方法。
[0004]本發(fā)明的整體技術(shù)構(gòu)思是:
[0005]制備鼠李糖脂發(fā)酵液的方法，包括如下工藝步驟:
[0006]A、將擴(kuò)培后含有銅綠假單胞菌 CGMCC N0.8377 (Pscudomonas aeruginosa)的種子液按照質(zhì)量百分比為8%-10%的接種量接入到滅菌后的發(fā)酵罐培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基中含有碳源、必要的氮源及營養(yǎng)物質(zhì)，調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值；
[0007]B、進(jìn)行通氣發(fā)酵；
`[0008]C、在發(fā)酵過程中向發(fā)酵培養(yǎng)基中補(bǔ)入碳源、營養(yǎng)物質(zhì)、增稠劑，經(jīng)通氣發(fā)酵得到含有鼠李糖脂的發(fā)酵液。
[0009]本發(fā)明中用于生產(chǎn)鼠李糖脂發(fā)酵液的菌種銅綠假單胞菌(Pscudomonasaeruginosa)已于2013年10月23日提交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為=CGMCC N0.8377，該保藏單位位于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所。
[0010]本發(fā)明的具體技術(shù)內(nèi)容還有:
[0011]所述的步驟A中的發(fā)酵培養(yǎng)基由下列質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分組成:
[0012]玉米油1%-2% ;廢糖蜜1%_2% ;硫酸銨0.2%-0.3% ;黃原膠或溫輪膠0.1%_0.15% ;磷酸氫二鈉0.2%-0.3% ;磷酸二氫鉀0.1%-0.2% ;余量為無菌水；發(fā)酵培養(yǎng)基的pH=7.0-7.2。
[0013]所述的步驟C中的發(fā)酵條件為:
[0014]6-8小時:補(bǔ)料玉米油0.5%-1%，黃原膠或溫輪膠0.05%-0.08%,風(fēng)量0.4-0.6vvm ；
[0015]14-16 小時:補(bǔ)入玉米油 0.5%-1.0%,硝酸銨 0.1%-0.2%,風(fēng)量 0.4-0.6vvm ；
[0016]28-30小時:補(bǔ)入玉米油2%-3%，黃原膠或溫輪膠0.02%_0.05%,風(fēng)量0.4-0.6vvm ；
[0017]36-40 小時:補(bǔ)入玉米油 0.5-1%,風(fēng)量 0.4-0.6vvm ；
[0018]41 小時-放罐:風(fēng)量 0.6-0.7vvm ；[0019]所補(bǔ)入的物料為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。
[0020]為便于工業(yè)化生產(chǎn)的需要，優(yōu)選且較為常見的技術(shù)方案是，所述的步驟A中擴(kuò)培過程包括:
[0021]A1、將斜面菌種制成搖瓶種子；
[0022]A2、將搖瓶種子制成一級種子；
[0023]A3、將一級種子制成二級種子，將二級種子接入發(fā)酵罐培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵。
[0024]所述的步驟A1是將斜面菌種中的原菌接入滅菌后的搖瓶種子培養(yǎng)基中經(jīng)培養(yǎng)制成搖瓶種子，搖瓶種子的培養(yǎng)條件是培養(yǎng)溫度為35°C -39°C、轉(zhuǎn)速為200-250轉(zhuǎn)/分鐘、培養(yǎng)周期為20-25小時的條件下振蕩培養(yǎng)，接種量為斜面菌種:種子液的質(zhì)量比=1:200，斜面菌種培養(yǎng)基采用如下單位質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分組成:
[0025]葡萄糖1_2%，蛋白胨0.2-0.4%，酵母膏0.2-0.3%，瓊脂2-2.5%，余量為無菌水，pH=7.0-7.2;
[0026]搖瓶培養(yǎng)基采用如下單位質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分組成:
[0027]葡萄糖1-2%，硝酸鈉0.4-0.7%,酵母膏0.1-0.3%,胰蛋白胨0.15-0.3%,余量為無菌水，pH=7.0-7.3。
[0028]所述的步驟A2是將搖瓶種子按照質(zhì)量百分比為1%的接種量接入滅菌后的一級種子培養(yǎng)液中經(jīng)通氣培養(yǎng)制成一級種子，一級種子的培養(yǎng)條件是培養(yǎng)溫度為35 V -39 V >通風(fēng)量0.2vvm-0.35vvm、培養(yǎng)周期為24-26小時的條件下通氣培養(yǎng)，一級種子培養(yǎng)液由下列質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分組成:
[0029]葡萄糖1_2%，磷酸氫二胺0.7-0.9%，硫酸銨0.1-0.2%，大豆分離蛋白0.1-0.3%，酵母膏0.01-0.02%，余量為無菌水，pH=7.0-7.2。
[0030]所述的步驟A3是將一級種子按照質(zhì)量百分比為8%_10%的接種量接入滅菌后的二級種子培養(yǎng)液中經(jīng)通氣培養(yǎng)制成二級種子，二級種子的培養(yǎng)條件是培養(yǎng)溫度為350C _39°C、通風(fēng)量0.4vvm-0.6vvm、培養(yǎng)周期為10-15小時的條件下通氣培養(yǎng)，二級種子培養(yǎng)液由下列質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分組成:
[0031]玉米油1-2%，廢糖蜜1-2%，硝酸銨0.6-0.8%，硫酸銨0.2-0.3%，黃原膠或溫輪膠0.05-0.1%，酵母膏 0.01-0.02%，余量為無菌水，pH=7.0-7.2。
[0032]所述的廢糖蜜中蔗糖的質(zhì)量百分含量不低于45%。
[0033]所述的溫輪膠為河北鑫合生物化工有限公司生產(chǎn)。
[0034]本發(fā)明所取得的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的技術(shù)進(jìn)步在于:
[0035]1、本發(fā)明以銅綠假單胞菌CGMCC N0.8377作為原始菌種，采用玉米油及廢糖蜜作為二級擴(kuò)大培養(yǎng)及發(fā)酵的主要碳源，有效利用了工業(yè)廢料，降低了生產(chǎn)成本，發(fā)酵過程中菌種代謝正常，生產(chǎn)工藝合理易于實(shí)現(xiàn)，產(chǎn)品得率高(發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵液中鼠李糖脂的濃度為65-70 g / L)。
[0036]2、在發(fā)酵過程中補(bǔ)料加入增稠劑黃原膠、溫輪膠或玉米油，可有效提高對于發(fā)酵液的粘度控制，穩(wěn)定控制發(fā)酵過程中泡沫的產(chǎn)生。
[0037]鼠李糖脂評價方法(參照《微生物學(xué)通報》2006年33 (4)鼠李糖脂快速定量分析方法及其影響因素研究)
[0038]鼠李糖脂的測定——蒽酮比色法[0039]一、儀器、試劑和材料
[0040]1、儀器:電熱恒溫水浴鍋，分光光度計，電子天平，容量瓶，刻度吸管等
[0041]2、試劑:
[0042]( I)鼠李糖標(biāo)準(zhǔn)液:100 ii g/ml ；
[0043](2)濃硫酸；
[0044](3)蒽酮試劑:0.2g蒽酮溶于100ml濃H2SO4中。當(dāng)日配制使用。
[0045]3、材料:銅綠假單胞菌WJ-1的發(fā)酵液；
[0046]二、操作步驟
[0047]1、鼠李糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
[0048]取7支大試管，按下表數(shù)據(jù)配制一系列不同濃度的鼠李糖溶液:
[0049]
【權(quán)利要求】
1.制備鼠李糖脂發(fā)酵液的方法，其特征在于包括如下工藝步驟: A、將擴(kuò)培后含有銅綠假單胞菌CGMCCN0.8377 (Pscudomonas aeruginosa)的種子液按照質(zhì)量百分比為8%-10%的接種量接入到滅菌后的發(fā)酵罐培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基中含有碳源、必要的氮源及營養(yǎng)物質(zhì)，調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值； B、進(jìn)行通氣發(fā)酵； C、在發(fā)酵過程中向發(fā)酵培養(yǎng)基中補(bǔ)入碳源、營養(yǎng)物質(zhì)、增稠劑，經(jīng)通氣發(fā)酵得到含有鼠李糖脂的發(fā)酵液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備鼠李糖脂發(fā)酵液的方法，其特征在于所述的步驟A中的發(fā)酵培養(yǎng)基由下列質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分組成: 玉米油1%_2% ;廢糖蜜1%_2% ;硫酸銨0.2%-0.3% ;黃原膠或溫輪膠0.1%-0.15% ;磷酸氫二鈉0.2%-0.3% ;磷酸二氫鉀0.1%-0.2% ;余量為無菌水；發(fā)酵培養(yǎng)基的pH=7.0-7.2。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的以放射形根瘤菌為菌種生產(chǎn)可得然膠發(fā)酵液的方法，其特征在于所述的步驟C中的發(fā)酵條件為: 6-8小時:補(bǔ)料玉米油0.5%-1%，黃原膠或溫輪膠0.05%-0.08%，風(fēng)量0.4-0.6vvm ； 14-16 小時:補(bǔ)入玉米油 0.5%-1.0%，硝酸銨 0.1%-0.2%，風(fēng)量 0.4-0.6vvm ； 28-30小時:補(bǔ)入玉米油2%-3%，黃原膠或溫輪膠0.02%-0.05%，風(fēng)量0.4-0.6vvm ； 36-40小時:補(bǔ)入玉米油0.5-1%，風(fēng)量0.4-0.6vvm ； 41小時-放罐:風(fēng)量0.6-0.7vvm ； 所補(bǔ)入的物料為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備鼠李糖脂發(fā)酵液的方法，其特征在于所述的步驟A中擴(kuò)培過程包括: A1、將斜面菌種制成搖瓶種子； A2、將搖瓶種子制成一級種子； A3、將一級種子制成二級種子，將二級種子接入發(fā)酵罐培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備鼠李糖脂發(fā)酵液的方法，其特征在于所述的步驟A1是將斜面菌種中的原菌接入滅菌后的搖瓶種子培養(yǎng)基中經(jīng)培養(yǎng)制成搖瓶種子，搖瓶種子的培養(yǎng)條件是培養(yǎng)溫度為35°C -39°C、轉(zhuǎn)速為200-250轉(zhuǎn)/分鐘、培養(yǎng)周期為20-25小時的條件下振蕩培養(yǎng)，接種量為斜面菌種:種子液的質(zhì)量比=1:200，斜面菌種培養(yǎng)基采用如下單位質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分組成: 葡萄糖1-2%，蛋白胨0.2-0.4%，酵母膏0.2-0.3%，瓊脂2-2.5%，余量為無菌水，pH=7.0-7.2; 搖瓶培養(yǎng)基采用如下單位質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分組成: 葡萄糖1_2%，硝酸鈉0.4-0.7%,酵母膏0.1-0.3%,胰蛋白胨0.15-0.3%,余量為無菌水，pH=7.0-7.3。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備鼠李糖脂發(fā)酵液的方法，其特征在于所述的步驟A2是將搖瓶種子按照質(zhì)量百分比為1%的接種量接入滅菌后的一級種子培養(yǎng)液中經(jīng)通氣培養(yǎng)制成一級種子，一級種子的培養(yǎng)條件是培養(yǎng)溫度為`35°C -39°C、通風(fēng)量0.2vvm-0.35vvm、培養(yǎng)周期為24-26小時的條件下通氣培養(yǎng)，一級種子培養(yǎng)液由下列質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分組成: 葡萄糖1_2%，磷酸氫二胺0.7-0.9%，硫酸銨0.1-0.2%，大豆分離蛋白0.1-0.3%，酵母膏·0.01-0.02%，余量為無菌水，pH=7.0-7.2。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備鼠李糖脂發(fā)酵液的方法，其特征在于所述的步驟A3是將一級種子按照質(zhì)量百分比為8%-10%的接種量接入滅菌后的二級種子培養(yǎng)液中經(jīng)通氣培養(yǎng)制成二級種子，二級種子的培養(yǎng)條件是培養(yǎng)溫度為35°C -39°C、通風(fēng)量0.4vvm-0.6vvm、培養(yǎng)周期為10-15小時的條件下通氣培養(yǎng)，二級種子培養(yǎng)液由下列質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分組成: 玉米油1-2%，廢糖蜜1-2%，硝酸銨0.6-0.8%，硫酸銨0.2-0.3%，黃原膠或溫輪膠0.05-0.1%，酵母膏 0.01-0.02%，余量為無菌水，pH=7.0-7.2。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備鼠李糖脂發(fā)酵液的方法，其特征在于所述的廢糖蜜中蔗糖的質(zhì)量百分含量不低于45%。
9.根據(jù)權(quán)利要求1、3或7中任一項(xiàng)所述的制備鼠李糖脂發(fā)酵液的方法，其特征在于所述的溫輪膠為河北鑫合生物化工有限公司生產(chǎn)。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備鼠李糖脂發(fā)酵液的方法，其特征在于所述的廢糖蜜中蔗糖的質(zhì)量百分含量不低于45·%。
【文檔編號】C12P19/44GK103589765SQ201310559717
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年11月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月11日
【發(fā)明者】張禹, 乞峰輝, 張少華, 楊曉民 申請人:河北鑫合生物化工有限公司